第七章 抗生素的提取

第七章抗生素的提取 四川理工生药2011 抗生素的提取 提取要求 1 时间短 2 温度低 3 pH宜选择对抗生素较稳定的范围 4 勤清洗消毒 提取方法 1 溶媒萃取法 2 离子交换法 3 吸附法 4 沉淀法 药物的一般分离纯化方法 第一节溶媒萃取法提取抗生素 定义 利用抗生素在水及与水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性 使抗生素从一种液相 如发酵滤液 转移到另一种液相 如有机溶媒 中去 以达到浓缩和提纯的目的 料液 在溶剂萃取中 被提取的溶液 溶质 其中欲提取的物质 萃取剂 用以进行萃取的溶剂 萃取液 经接触分离后 大部分溶质转移到萃取剂中 得到的溶液 萃余液 被萃取出溶质的料液称为 萃取的基本概念 萃取常数 一 萃取原理 有机相中浓度 水相中浓度 E萃取效率 有机相中总量 水相中总量 100 E萃取效率 100 水 有 二 工业萃取方式 萃取过程 1 混和2 分离3 溶剂回收 操作方式单级萃取多级萃取多级错流多级逆流 1 单级萃取 单级萃取流程示意图 单级萃取 只包括一个混合器和一个分离器 多级顺流 错流 萃取 F一料液S一溶剂L一萃取液R 萃余液下标1 2 3 级别 多级错流萃取的理论收率高于单级萃取 即萃取完全 但多级萃取流程长 萃取剂用量大 因而得到的萃取液浓度低 3 多级逆流萃取 多级逆流萃取中 料液移动方向和萃取剂移动方向相反 故称逆流萃取 多级逆流萃取与同级错流萃取相比 在相同的萃取剂用量下 可获得更高的收得率 在逆流萃取中 由于只在最后一级中加入萃取剂 故与错流萃取相比 萃取剂用量少 因而萃取液浓度高 例1 利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D pH3 5时分配系数K 57 令料液体积为450l h 单级萃取剂流量为39l h 计算单级 三级顺流 三级逆流萃取的萃取率 解 单级萃取的萃取效率 E 57 57 450 39 100 83 2 三级顺流E 94 6 三级逆流E 99 3 水 有 4 影响萃取操作的因素 1 有机溶剂的选择 2 pH的范围 3 温度的确定 4 盐析 5 乳化作用 有机溶剂的选择 根据相似相溶的原理 选择与目标产物极性相近的有机溶剂为萃取剂 可以得到较大的分配系数 有机溶剂与水不互溶 与水有较大的密度差 黏度小 表面张力适中 应当价廉易得 容易回收 毒性低 腐蚀性小 不与目标产物反应 常用于抗生素萃取的有机溶剂有丁醇 丁酯 乙酸乙酯 乙酸丁酯 乙酸戊酯等 pH的影响 pH对表观分配系数的影响 pH K pH低有利于酸性物质分配在有机相 碱性物质分配在水相 温度TT 分子扩散速度 故萃取速度 一般生化物质的萃取在室温或较低温度下进行 盐析无机盐 氯化钠 硫酸铵 作用 生化物质在水中溶解度 两相比重差 两相互溶度 乳化和破乳 去乳化 1 乳化乳化是一种液体 分散相 分散在另一种不相混溶的液体 连续相 中的现象 这样形成的分散体系称乳浊液 原因 是发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质 这些物质具有表面活剂性的作用 使有机溶剂和水的表面张力降低 水易于以微小液滴的形式分散于油相称为油包水型W O乳浊液 相反 为O W型乳浊液 害处 乳化产生后会使有机溶剂相和水相分层困难 并出现两种夹带 发酵液中夹带有机溶剂微滴 使目标产物受到损失 有机溶剂中夹带发酵液给后处理操作带来困难 破乳 由蛋白质引起的乳化多为O W型 其粒径在2 5 30微米之间 表面活性剂的亲水基团强度大于亲油基团 破乳方法 1 过滤或离心分离破乳法 2 化学法 加电解质中和离子型乳油液的电荷 3 物理法 加热 稀释 吸附等 4 顶替法 加入表面活性更大 但因其碳链较短难以形成坚固的保护膜的物质 取代界面上的乳化剂 5 转型法 如在O W中加入亲油性乳化刑 使乳化液有生成W O的倾向 但又不稳定 从而达到破乳目的 常用的去乳化剂 醇类 戊醇最好 溴代十五烷基吡啶 十二烷基三甲基溴化氨 1231 十二烷基磺酸钠最好的方法是防止乳化 如蛋白质是乳化起因 就应设法去除蛋白质 二 萃取设备 1 萃取体系的组成及功能液 液萃取设备应包括3个部分 混合设备 分离设备和溶剂回收设备 混合设备 管式混合器 喷嘴式混合器 搅拌混合罐 管式混合器 混合管 工作原理萃取剂及料液在一定流速下进入管道一端 混合后从另一端导出 依靠管内特殊设计的内部单元和流体流动实现液体混合 强迫湍流状态 料液在管内平均停留时间10 20s 特点混合管的萃取效果高于混合罐 且为连续操作 流程简单 结构紧凑 能耗小 萃取效率高 适于各种黏度的流体 a 交错射流混合 b 同向射流混合 2 喷嘴式混合器喷嘴式混合器是一种体积小 简单方便的混合装置 特别适用于低黏度 易分散的料液 这种设备投资小 但需要料液在较高的压力下进入混合器 且效率较低 3 混合罐 混合罐的结构类似于带机械搅拌的密闭式反应罐 对化学腐蚀性强的液体 可采用气流搅拌 三 分离设备 高速离心机 碟片式 4000 6000rpm超速离心机 管式 10000rpm 第二节离子交换法 离子交换法 是利用某些抗生素能在溶液中形成带电粒子 与合成离子交换树脂之间结合力的差异来进行分离的方法 带电粒子与离子支换树脂间的作用力是静电力 它们的结合是可逆的 固体球形颗粒 多孔网状结构 不溶于水 具有离子交换特性的有机高分子聚电解质 一 原理 1 组成 2 离子交换过程 离子交换 R A B R B A 洗脱 R B C R C B 再生 R C A R A C 骨架 接功能基团 惰性固定基团 接于骨架上 与相反离子结合活性离子 可移动离子待交换离子 吸附阶段与活性离子交换 按材料不同 按结构 二 离子交换树脂 聚 苯乙烯树脂 多糖类骨架 DEAE 凝胶 葡聚糖 琼脂糖 多糖蛋白 751 722等离子型小分子 按离子属性及强弱 三 离子交换树脂的理化性质 外观珠球形颗粒度 粒度 颗粒度是指树脂颗粒在溶胀状态下的直径大小 粒度小其交换速度快 但流体阻力增加 粒度过大会使交换速度降低 膨胀性确定树脂装填量时应考虑到其膨胀性能 密度干树脂的密度称真密度 而膨胀树脂酌密皮称视密度 由视密度可以估计树脂的装填量和离子交换柱所承受的压力 交联度指离子交换树脂中交联剂 二乙烯苯简称DVB 含量的质量分数 一般来说交联度大 机械强度高 树脂的孔度小 大分子的物质就不易被交换 交换容量表征树脂交换能力的重要参数 所谓交换容量是指一定量树脂所能交换离子的毫克当量数 meq 其表示方法有质量交换容量 meq g干树脂 和体积交换容量 meq ml湿树脂 两种 四 离子交换树脂选择依据 1 带正电荷的碱性抗生素用阳离子交换树脂 反之 用阴离子 强酸性或强碱性抗生素 宜选用弱碱性及弱酸性交换树脂 交换树脂有酸 碱型和盐型 对弱酸 碱型离子交换树脂用盐型 工业离子交换树脂宜选用容量高 选择性好 特别是易再生的树脂 五 离子交换方法 1 静态交换法 工业上 间歇式工艺 交换罐 实验室中 烧杯 2 动态交换法 工业上 离子交换器将树脂装入柱状交换器中 使待交换溶液流过交换柱 实验室中 交换柱或滴定管 装柱 离子交换 洗脱 树脂再生 六 离子交换柱式操作过程 预处理 研磨 过筛 使粒度符合要求浸泡 使其充分溶胀洗涤 减少杂质 一般经过研磨 溶胀 洗涤等步骤 树脂的预处理 装柱 树脂洗至中性后借助水的重力使树脂自然沉积 避免夹杂气泡现象 装柱与装样交换 洗脱 洗脱一般采取分步淋洗或梯度淋洗 其中分步洗脱 是指先采用洗脱能力较弱的溶液 使易洗脱组分流出 然后依次使用洗脱能力更强的溶液 洗脱较难洗脱的组分 七 工业离子交换提取方法 1 分批法 交换罐 2 固定床 树脂上柱或交换器 动态洗脱 3 流动床 树脂与料液在柱床内同时逆向流动 八 抗生素离子离子交换工艺选择 1 pH 交换时pH值 抗生素离子化 抗生素稳定性适宜 2 吸附与洗脱 条件相反 逆过程 eg 酸性吸附则碱性洗脱 3 为防止洗脱过程pH变化过大 可选用缓冲剂作为洗脱液 工业常用洗脱剂 1 概念 吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力 使其富集在吸附剂表面的过程 被吸附的流体称为吸附质 多孔固体颗粒称为吸附剂 吸附达到平衡时 吸附剂内的流体称为吸附相 剩余的流体本体相称为吸余相 第三节吸附法分离抗生素 吸附法的发展 吸附法在各种层析技术中应用最早 如一战期间发展起来的活性炭吸附 后来使用的硅胶 凝胶型离子交换树脂 分子筛和纤维素等近些年发展的大网格吸附剂 吸附法的特点 常用于从稀溶液中将溶质分离出来 由于受固体吸附剂的限制 处理能力较小 对溶质的作用较小 可直接从发酵液中分离所需的产物 成为发酵与分离的耦合过程 从而可消除某些产物对微生物的抑制作用 溶质和吸附剂之间的相互作用及吸附平衡关系通常是非线性关系 故设计比较复杂 实验的工作量较大 吸附法的优缺点 优点 分离效果好操作简便 安全 设备简单pH变化小 适于稳定性差的物质缺点 收率低成本高无机吸附剂性能不稳定不能连续操作 劳动强度大 吸附的类型 1 物理吸附 放热 可逆 单分子层或多分子层 选择性差 2 化学吸附 放热量大 单分子 选择性强 3 交换吸附 吸附剂吸附后同时放出等当量的离子或氢键到溶液中 物理吸附 基于范德华力 氢键和静电力 它相当于流体中组分分子在吸附剂表面上的凝聚 可以是单分子层 也可以是多分子层 物理吸附一般速度较快且是可逆的 化学吸附 基于在固体吸附剂表面发生化学反应使吸附质和吸附剂之间以化学键力结合的吸附过程 因此选择性较强 化学吸附一般速度较慢 只能形成单分子层且不可逆 无论是物理吸附 还是化学吸附 吸附都是发生在吸附剂表面的一种表面现象 为了增大吸附容量 吸附剂应具有大的比表面积 吸附剂通常应具备以下特征 对被分离的物质具有较强的吸附能力 有较高的吸附选择性 机械强度高 再生容易 性能稳定 价格低廉 常用的吸附剂有极性的和非极性的两种 羟基硅燥土 硅胶 氧化铝等属前者 活性炭属后者 人工合成的如大网格吸附剂 分子筛等两种都有 但大多属非极性的 常用吸附剂种类 硅胶是应用很广的一种极性吸附剂 是具有硅氧交联结构 表面有许多硅醇基的多孔性微粒 硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力 主要优点是化学惰性 具有较大的吸附量 易制备不同类型的多孔硅胶 一般以SiO2 xH2O通式表示 硅胶的活性与含水量有关 含水量高则吸附力减弱 当游离水含量17 以上时 吸附能力极低 可作为分配色谱的载体 硅胶具有微酸性 适用于分离酸性和中性物质 如有机酸 氨基酸 甾体等 OO Si O Si OH OO 硅胶 氧化铝 氧化铝的吸附能力很强 可以活化到不同程度 重演性好 再生容易 故是常用的吸附剂之一 氧化铝的活性与其含水量有很大的关系 水分会掩盖活性中心 故含水量愈高 活性愈低 分酸性 碱性和中性三种 酸性氧化铝 pH4 5 适合于分离酸性化合物 碱性氧化铝 pH9 10 适合于分离碱性化合物 中性氧化铝 pH7 适合于分生物碱 挥发油 萜类 甾体及在酸 碱中不稳定的甙类 酯类等化合物 硅藻土是由硅藻类植物死亡后的硅酸盐遗骸形成的 基本质是含水的无定形SiO2 并含有少量Fe2O3 C2O MgO Al2O3及有机杂质 外观一般呈浅黄色或浅灰色 优质的呈白色 质软 多孔而轻 硅藻土的多孔结构使它成为一种良好吸附剂 在食品 化工生产中常用来作助滤剂及脱色剂 硅藻土 活性炭是一类碳质吸附剂的总称 品种很多 几乎所有的有机物都可以作为制造活性炭的原料 如泥炭 褐煤 烟煤 重质石油馏分 木材 果壳 纸浆废液等 将原料在隔绝空气的条件下加热至600 左右 有时还加添加剂 使其热分解 得到的残碳再在800 以上高温下与空气 水蒸气或二氧化碳反应使其烧蚀 便生成多孔的活性炭 活性炭 Activecarbon 活性炭吸附的优缺点优点活性炭具有吸附力强 分离效果好 来源比较容易 价格便宜 缺点但由于活性炭生产原料和制备方法不同 因此吸附性能的可重复性很难控制 另外活性炭色黑质轻 有时会造成环境污染 活性炭类型活性炭的分类可分为粉末状活性炭 颗粒状活性炭和锦纶 活性炭三类 活性炭对物质的吸附规律 活性炭是非极性吸附剂 因此在水中吸附能力大于有机溶剂中的吸附能力 针对不同的物质 活性炭的吸附遵循以下规律 对极性基团吸附力大于非极性基团对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物对相对分子量大的化合物的吸附力大于相对分子量小的化合物抗生素生产中应用主要除杂质 操作 静态吸附动态吸附 注意事项 活性炭的选择吸附与pH的关系 活性炭的用量吸附时间 大孔吸附树脂技术 是20世纪60年代未在离子交换剂和其它吸附剂应用的基础上发展起来的一种新型树脂 是一种具有多孔立体结构 人工合成的有机高分子聚合物 是多孔网状结构 巨大的比表面积使其具有良好的吸附性能 能吸附液体中的特质 又称为大孔吸附树脂 macroporousabsorbingresin 大孔树脂 MacroporousResin MR 主要应用 生物化学制品的净化 分离 回收植物活性成份的纯化如 皂苷 黄酮 内酯 生物碱中药复方精制及质量标准制定工业废水 废液的处理 主要理化性质 性状 白色 乳白色至微黄色颗粒粒度 20 60目 稳定性 不溶于水 酸 碱及有机溶剂 加热不溶 可在150 以下使用 含水量 40 75 按其极性和所选用单体分子结构的不同 可分为 1 非极性吸附树脂 为苯乙烯 二乙烯聚合物AmberliteXAD 4DiaionHP 20上海试剂厂的D101 D102 D401南开大学的D1 D2 D3 D42 中等极性吸附树脂 为聚丙烯酸酯型聚合物AmberliteXAD 6 XAD 7 XAD 83 极性吸附树脂 含硫氧 酰胺等基团AmberliteXAD 9 南大化工厂的X 5 S 8天津试剂二厂的GDX 501 GDX 601等4 强极性吸附树脂 含氨基 吡啶 氧化氮等极性基因AmberliteXAD 11 AmberliteXAD 12 天津试剂二厂的GDX 402 GDX 403等 类型 制备 骨架类型 苯乙烯 丙烯酸酯 丙烯腈 异丁烯等致孔剂 甲苯 石蜡 溶剂汽油 煤油 碳醇 聚乙烯醇等交联剂 二乙烯苯等分散剂 明胶等 大孔树脂优缺点 1 应用范围广许多生物活性物质对pH较为敏感 易受酸碱作用而失去活性 限制了离子交换法的应用 而采用大孔吸附树脂 既能选择性吸附 又便于溶剂洗脱 整个过程pH不变 另外 可从存在有大量无机盐的发酵液中分离提取抗菌素等物质 理化性质稳定大孔树脂稳定性高 机械强度好 经久耐用 且又避免了溶剂法对环境的污染和离子交换法对设备的腐蚀等不良影响 3 分离性能优良大孔树脂对有机物的选择性良好 分离效能高 且脱色能力强 效果不亚于活性炭 4 使用方便大孔树脂一般系小球状 直径在0 2 0 8mm之间 因此流体阻力小于粉状活性炭 使用方便 5 溶剂用量少溶剂法是液液萃取 溶剂消耗大 回收较难 而大孔树脂吸附法仅用少量溶剂洗脱即达到分离目的 不仅溶剂用量少 而且又避免了严重的乳化现象 提高了效率 6 可重复使用 降低成本大孔吸附树脂再生容易 一般用水 稀酸 稀碱或有机溶剂如低浓度乙醇 丙酮对树脂进行反复清洗 即可再生重复使用 7 确定大孔吸附树脂价格较贵 吸附效果易受流速和溶质浓度的影响 品种有限 不能满足中药多成分 多结构的需求 操作较为复杂 对树脂的技术要求较高 分离规律 分子量相似的成分极性越小 吸附能力越强 则越难洗脱下来 极性越大 吸附能力越弱 则越易洗脱下来 极性相似的成分分子量越大 越易洗脱下来 分子筛原理 73 药液 水 洗脱剂 再生剂 分段收集 泵 检测器 过程控制器 储罐 流程 树脂 预处理 上样 吸附 洗脱 收集洗脱液 回收 浓缩 干燥 成品 74 预处理 大孔树脂 乙醇浸泡 小时 蒸馏水洗至无醇味 待用 装柱 乙醇湿法装柱 乙醇冲洗 蒸馏水洗乙醇 待用 乙醇洗脱液与水混合无白色浑浊 上样 蒸馏水稀释样品 缓慢上样 或湿样品与树脂混合烘干 洗脱 0 90乙醇梯度洗脱 浓缩 不同极性的流分 收集洗脱液 再生 一般用乙醇洗涤至流出液无色 如污染严重 也可用酸或碱进行处理 最后乙醇和蒸馏水洗涤 树脂的强化再生 当树脂正常使用一段时间后 吸附能力下降或严重污染 需要进行强化再生 高浓度盐酸浸泡 洗涤 纯水洗至中性 高浓度氢氧化钠浸泡 洗涤 纯水充分淋洗 直至中性 树脂类型 极性 中性 非极性树脂亲脂性成分选用中性 非极性树脂 苷类等极性大的成分选用极性树脂 气泡 易产生 采用梯度洗脱可减少 再生 大孔树脂再生效果好 但再生次数不是无限 标准 与新树脂比较 吸附能力下降30 注意事项 沉淀法定义 利用沉淀剂使抗生素在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程 沉淀法的目的 通过沉淀达到浓缩的目的 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分 初步纯化 将已纯化的产品由液态变成固态 加以保存或进一步处理 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法 但目前在抗生素生产中的应用不多 主要在四环素类 一 概述 第四节 沉淀法提取抗生素 沉淀法的优缺点优点 操作简单 经济 浓缩倍数高缺点 针对复杂体系而言 分离度不高 选择性不强 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心 除去不溶性杂质及细胞碎片 以后进行 得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯 如透析 超滤 层析或结晶制得高纯度