第章 抗原与抗体

第七章抗原与抗体 2 免疫的基本概念抗原抗体抗体产生的克隆选择学说 3 第一节免疫的基本概念免疫是指机体识别自身和非自身物质 并排除非自身大分子物质的一种复杂的生理学反应 免疫学是研究抗原 机体免疫系统和免疫应答规律的一门学科 4 一 免疫的基本特性 1 识别自身与非自身正常动物机体能识别自身与非自身的大分子物质 识别的物质基础是存在于免疫细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 膜表面的抗原受体 识别功能很精细 2 特异性机体的免疫应答和免疫力具有高度的特异性 针对性 3 免疫记忆机体受抗原刺激产生抗体和致敏淋巴细胞外 也形成了免疫记忆细胞 对再次接触的相同抗原物质可产生更快的免疫应答 5 二 免疫的基本功能1 抵抗感染指动物机体抵御病原微生物的感染和侵袭的能力 又称免疫防御 2 自身稳定又称免疫稳定 机体免疫系统识别和清除自身衰老死亡的细胞 以维持机体的生理平衡 3 免疫监视机体免疫系统识别和清除自身的变异细胞 6 第二节抗原一 抗原的概念1 抗原 antigen 与抗原性 antigenicity 凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能与之发生反应的物质称为抗原 Ag 抗原物质具有抗原性 包括免疫原性与反应原性 7 免疫原性 immunogenicity 抗原作用 指能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性 反应原性 reactinogenicity 抗原反应 指抗原与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特性 此特性又称为免疫反应性 immunoreactivity 8 2 完全抗原与半抗原抗原又分为完全抗原与不完全抗原 既具有免疫原性又有反应原性的物质称为完全抗原 completeantigen 只具有反应原性而缺乏免疫原性的物质称为不完全抗原 incompleteantigen 亦称为半抗原 hapten 如荚膜多糖 类脂 脂多糖 半抗原又分为简单半抗原和复合半抗原 9 简单半抗原 simplehapten 简单半抗原的分子量较小 只有一个抗原决定簇 不能与相应的抗体发生可见的反应 但能中和相应的抗体阻止其出现可见的反应 用沉淀抑制反应可证实 复合半抗原 complexhapten 复合半抗原的分子量较大 有多个抗原决定簇 一般的半抗原都属于此类 能与相应的抗体发生沉淀反应 二硝基氯苯 DNCB 多糖 类脂质 脂多糖等半抗原都为复合半抗原 10 二 构成抗原的条件 影响抗原免疫原性的因素 1 异源性又称异物性 foreigness 一般说来 只有非自身物质进入机体才能具有免疫原性 微生物 异种组织 细胞及蛋白质均是良好的抗原 通常动物亲缘关系相距越远 种系差异越大 免疫原性越好 有以下几种情况 非动物性抗原非动物性的物质 譬如植物蛋白 叶绿素等 微生物等 对动物宿主有良好的免疫原性 异种动物抗原动物之间血源关系相距越远 生物种系差异越大 免疫原性越好 譬如 鸭源蛋白质对鸡的免疫原性较弱 而对兔则是良好的免疫原 同种异体抗原同种动物异体间的某些物质也有免疫原性 譬如血型抗原 组织相容性抗原等 自身抗原动物自身的组织通常情况下不具有免疫原性 11 2 大分子抗原的免疫原性与其分子大小有直接关系 免疫原性良好的物质分子量一般都在10000以上 在一定条件下 分子量越大 免疫原性越强 分子量小于5000其免疫原性较弱 分子量在l000以下的物质为半抗原 没有免疫原性 但与蛋白质载体结合后可获得免疫原性 3 分子结构相同大小的分子如果化学组成 分子结构和空间构象不同 其免疫原性也有一定的差异 一般讲 分子结构和空间构型越复杂 免疫原性越好 芳香环结构比直链结构强 12 4 物理性颗粒性抗原的免疫原性通常比可溶性抗原强 可溶性抗原分子聚合后或吸附在颗粒表面可增强其免疫原性 例如将甲状腺蛋白与聚丙烯酰胺颗粒结合后免疫家兔可使IgM的效价提高20倍 免疫原性弱的蛋白质如果吸附在氢氧化铝胶 脂质体等大分子颗粒上可增强其免疫原性 5 完整性所以抗原物质通常要通过非消化道途径以完整分子状态进入体内 才能保持抗原性 13 三 抗原决定簇1 概念抗原分子并非所有的基团都作用一致 决定其免疫活性的只是其中的一小部分抗原区域 抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团称为抗原决定簇 antigenicdeterminant 或抗原决定基 由于抗原决定簇通常位于抗原分子表面 因而又称为抗原表位 epitope 抗原决定簇决定抗原的特异性 14 15 2 决定簇的大小抗原决定簇的大小是相当恒定的 蛋白质抗原的每个决定簇由5 7个氨基酸残基组成 如肌红蛋白的决定簇由6 7个氨基酸残基组成 伸长约为1 9 2 3nm 多糖抗原由5 6个单糖残基组成 大小为3 5nm 核酸抗原的决定簇由5 8个核苷酸残基组成 大小为2 0nm 16 3 决定簇的数量抗原分子抗原决定簇的数目称为抗原的抗原价 单价抗原只有一个抗原决定簇的抗原称为 如简单半抗原 多价抗原含有多个抗原决定簇的抗原为多价抗原 单特异性决定簇抗原分子只含有一种特异性决定簇称为单特异性决定簇 17 多特异性决定簇含有两种以上不同特异性的决定簇 功能价位于抗原分子表面 能与免疫活性细胞接近 对激发机体的免疫应答起着决定意义的决定簇称为抗原的功能价 非功能价隐蔽于抗原分子内部的决定簇谓之非功能价 只有在用酶轻度消化后才能暴露 天然抗原一般都是多价和多特异性决定簇抗原 18 单特异性决定簇多价抗原 多特异性决定簇多价抗原 19 20 四 抗原的交叉性不同抗原物质之间存在相同的抗原决定簇 这种现象称为抗原的交叉性 这些共有的抗原组成或决定簇称为共同抗原或交叉抗原 如果两种微生物有共同抗原 它们与相应抗体相互之间可以发生交叉反应 21 载体效应 carriereffect 小分子物质不具有免疫原性 不能诱导产生免疫应答 但当与大分子物质 载体 连接后 就能诱导机体产生免疫应答 并能与相应的抗体结合 这种现象称为半抗原载体现象 这些小分子物质即为半抗原 实质上就是抗原决定簇 大分子物质即为载体 半抗原与载体结合后首次免疫动物 可测得半抗原的抗体 初次免疫反应 但当二次免疫时 半抗原连接的载体只有与首次免疫所用的载体相同时 才会有再次反应 这种现象称为载体效应 22 现代实验表明免疫系统对半抗原和载体各自的决定簇分别进行识别 T细胞识别载体决定簇 B细胞识别半抗原决定簇 实际上任何大分子抗原都可看成半抗原和载体的复合物 在抗原分子中载体起着增加半抗原的大小 使其获得免疫原性与免疫记忆的作用 23 抗原 载体现象 24 五 抗原的分类 一 抗原分类抗原有多种分类方法 大致如下 1 按抗原的性质分类分 抗原 完全抗原 不完全抗原 半抗原 简单半抗原 复合半抗原 25 2 按来源分异种抗原与免疫动物不同种属的抗原 如微生物抗原 异种动物红细胞 异种动物蛋白 同种抗原与免疫动物同种属不同个体的抗原 能刺激同种而基因型不同的个体产生免疫应答 如血型抗原 同种移植物抗原 自身抗原动物的自身组织细胞 蛋白质在特定条件下形成的抗原 对自身免疫系统具有抗原性 异嗜性抗原指与种属特异性无关 存在于人 动物 植物及微生物之间性质相同的抗原 交叉抗原 该现象首先由瑞典病理学家Forssman 1868 1947 发现的 故又称为Forssman抗原 26 3 根据对胸腺 T细胞 的依赖性分类胸腺依赖性抗原 这类抗原在刺激B细胞分化和产生抗体的过程中需要辅助性T细胞的协助 多数抗原都属此类 如异种组织与细胞 异种蛋白及人工复合抗原等 非胸腺依赖性抗原这类抗原直接刺激B细胞产生抗体 不需要T细胞的协助 如大肠杆菌脂多糖 肺炎球菌荚膜多糖等 27 4 根据化学性质分类 糖蛋白 脂蛋白 脂质 多糖 核酸 抗原 28 二 微生物抗原1 按保护性分保护性抗原和非保护性抗原 2 按微生物种类分 细菌抗原细菌的抗原结构比较复杂 每个菌的每种结构都由若干抗原组成 因此细菌是多种抗原成分的复合体 有菌体抗原 荚膜抗原 鞭毛抗原和菌毛抗原等 29 菌体抗原又称O抗原 是革兰氏阴性菌细胞壁抗原 其化学本质为脂多糖的多糖侧链 鞭毛抗原又称H抗原 鞭毛抗原主要决定于鞭毛丝 荚膜抗原又称K抗原 荚膜是细菌主要的表面抗原 成分为多糖或多肽 菌毛抗原菌毛由菌毛素组成 有很强的抗原性 毒素抗原外毒素的成分为糖蛋白或蛋白质 具有很强的抗原性 能刺激机体产生抗体 即抗毒素 30 病毒抗原各种病毒都有相应的抗原结构 如囊膜抗原 衣壳抗原 可溶性抗原和核蛋白抗原 囊膜抗原 V抗原 有囊膜病毒 抗原特异性主要是囊膜上的纤突所决定的 如流感病毒HA和NA 是流感病毒亚型分类基础 衣壳抗原 VC抗原 无囊膜病毒 其抗原特异性决定于病毒颗粒表面的衣壳蛋白 如口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1 VP2 VP3 VP4等属此类抗原 可溶性抗原 S抗原 核蛋白抗原 NP抗原 31 第三节抗体一 免疫球蛋白与抗体1 免疫球蛋白 immunoglobulin 简称Ig 指存在于人和动物血液 血清 组织液及其他外分泌液中的一类具有相似结构的球蛋白 过去曾称为 球蛋白 在1968年和1972年两次国际会议上决定以Ig表示 免疫球蛋白普遍存在于血液 组织液及外分泌液中 依据化学结构和抗原性差异 Ig可分为IgG IgM IgA IgE和1gD五类 32 2 抗体 antibodyAb 抗体动物机体受到抗原物质刺激后 由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的 能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白 这类免疫球蛋白称为抗体 antibody 简称Ab 抗体的本质是Ig 它是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物 具有各种免疫功能 体液免疫抗体具有各种免疫功能 主要存在于动物的血液 血清 淋巴液 组织液及其他外分泌液中 因此将抗体介导的免疫称为体液免疫 33 34 膜表面免疫球蛋白在成熟的B淋巴细胞表面具有抗原受体 其本质也是免疫球蛋白 称为膜表面免疫球蛋白简称 SmIg 关于免疫球蛋白分子的结构和功能的研究是现代免疫学中的一大突破 在1959 1963年R Porter和G Edelman采用酶及还原剂消化和分离免疫球蛋白技术 弄清了免疫球蛋白的基本结构 从而提出免疫球蛋白的结构模型 35 二 Ig的分子结构IgG IgE 血清型IgA IgD均是以单体分子形式存在 IgM是以五个单体分子构成的五聚体 分泌型IgA是以二个单体构成的二聚体 36 二 Ig的分子结构1 单体分子结构所有种类Ig的单体分子结构都是相似的 即是由两条相同的重链和两条相同的轻链四条肽链构成的 Y 字形的分子 37 免疫球蛋白的单体分子结构 所有Ig单体分子结构相似 由2条重链和2条轻链组成 Y 字型结构分子 38 重链又称H链 大约是由420 440个氨基酸组成 分子量大约为50000 77000 两条重链之间由一对或一对以上的二硫键互相连接 39 可变区重链从氨基端 N端 开始最初的110个氨基酸 约占整个重链的1 4 的排列顺序以及结构是随抗体分子的特异性 与抗原对应 不同而有所变化 这一区域称为重链的可变区 variableregion VH 简称V区 它赋予抗体以特异性 40 恒定区其余的氨基酸 占重链的3 4 数量 种类 排列顺序及含糖量都比较稳定 称为恒 稳 定区 constantregion CH 简称C区 41 高 超 变区在重链的可变区 VH 内部 有四个区域的氨基酸最易发生变化 称为高 超 变区 氨基酸残基位置分别位于31 37 51 58 84 91 101 1l0 其余的氨基酸变化较小 称为骨架区 42 轻链 lightchain 又称L链 是由213 214个氨基酸组成 分子量约为22500 两条相同的轻链其羧基端 C端 靠二硫键分别与两条重链连接 轻链从N端开始最初的109个氨基酸的排列顺序及结构随抗体分子的特异性 与抗原对应 变化而有差异 称为轻链的可变区 VL 其余的氨基酸比较稳定 称为恒定区 CL 43 抗原结合部位Ig的重链的可变区 VH 与轻链的可变区 VL 相对应 构成有结合特异抗原决定簇功能的区域为抗体分子的抗原结合部位 44 IgG IgE 血清型IgA IgD均是以单体分子形式存在 IgM是以五个单体分子构成的五聚体 分泌型IgA是以二个单体构成的二聚体 45 2 Ig的功能区功能区Ig多肽链分子折叠形成的几个 由链内二硫键连接 环状球形结构 称为Ig的功能区 Ig每条重链有四个功能区 分别称为VH CH1 CH2 CH3 IgM和IgE有五个功能区 即多了一个CH4 轻链有两个功能区 即VL和CL 此外 在两条重链之间二硫键连接处附近为Ig的绞链区 免疫球蛋白每个功能区都是由约110个氨基酸组成 46 47 48 49 50 51 52 53 3 绞链区 hingeregion CH1与CH2之间大约30个氨基酸残基的区域为免疫球蛋白的绞链区 由2 5个链间二硫键 CHl尾部和CH2头部的小段肽链构成 54 55 4 水解片段及其生物学活性 56 水解片段Porter 1959 应用木瓜蛋白酶 papain 将IgG水解 可将其重链于链间二硫键近氨基端处切断 得到大小相近的三个片段 其中有两个相同的片段 可与抗原特异性结合 称为抗原结合片段 Fab 分子量为45000 另一个片段可形成蛋白结晶 称为Fc片段 Fc 分子量为55000 57 后来 Nisonoff又应用胃蛋白酶 pepsin 将IgG重链于链间二硫键近羧基端切断 消化成两个大小不同的片段 一个是具有双价抗体活性的F ab 2片段 另一个为若干小分子多肽碎片 称为pFc 片段 后者无任何生物学活性 58 59 Fab片段的生物学活性抗体结合抗原的活性由Fab所呈现 由VH和VL所组成的抗原结合部位 可结合抗原 是决定抗体分子特异性的部位 60 Fc片段的生物学活性该片段无结合抗原活性 但与抗体分子的生物学活性有密切关系 选择性地通过胎盘 如人IgG可通过胎盘进入胎儿体内 就与Fc片段有关 Brambell已证实 胎盘母体一侧的滋养层细胞能摄取各类血浆蛋白 但其吞饮泡内只有IG的Fc受体而无其它种类Ig的受体 与受体结合的IgG可得以避免被酶分解 进而通过细胞的外排作用 分泌到胎盘的胎儿一侧 进入胎儿循环 61 与补体结合活化补体 补体可与抗原抗体复合物结合 其结合位点就位于抗体分子Fc片段的CH2上 62 63 决定Ig分子的亲细胞性 即与带Fc受体细胞的结合 一些免疫细胞如巨噬细胞 淋巴细胞 嗜碱性粒细胞 肥大细胞等表面都具有免疫球蛋白的Fc片段的受体 因此 免疫球蛋白可通过其Fc片段与这些细胞表面的Fc受体结合 Ig与这些细胞Fc受体的结合部位因其种类不同而有差异 IgG与巨噬细胞 K细胞 B细胞Fc受体的结合部位是CH3 而IgE与嗜碱性粒细胞和肥大细胞Fc受体结合的部位是CH4 64 65 66 与Ig通过粘膜进入外分泌液有关 如分泌型IgA可由局部粘膜固有层中的浆细胞产生 然后通过粘膜进入呼吸道和消化道分泌液中 就与lgA的Fc片段有关 67 补体结合位点位于CH2上 Fc受体结合位点在CH3上 Ig抗原特异性Fc片段是Ig分子中的重链稳定区 因此它是决定各类Ig抗原特异性的部位 用Ig免疫异种动物产生的抗抗体 第二抗体 可与相应Ig发生抗原抗体反应 68 5 Ig的特殊分子结构某些Ig还具有一些特殊分子结构 如连接链 分泌成分 糖类等为个别Ig所具有 69 连接链又称J链 在Ig中 IgM是五聚体 分泌型的IgA是二聚体 这些单体之间就是依靠J链连接起来的 J链是一条多肽链 内含10 糖成分 糖类Ig是含糖量相当高的蛋白 特别是IgM和IgA 糖类在Ig的分泌过程中起着重要作用 并可使Ig分子易溶和具有防止其分解的作用 70 分泌成分 SC 又称分泌片 是分泌型IgA所特有的一种特殊结构 为多肽链 含6 糖成分 它是由局部粘膜的上皮细胞所合成的 在IgA通过粘膜上皮细胞的过程中SC与之结合形成分泌型的二聚体 SC可防止IgA在消化道内为蛋白酶所降解 从而使IgA能发挥免疫作用 71 三 Ig的种类与抗原性1 种类Ig可分为类 亚类 型 亚型及亚群等 分类分型Ig类的区分是依据其重链C区的理化特性及抗原性的差异 Ig可分为IgG IgM IgA IgE和IgD5大类及其亚型 72 2 Ig的抗原性Ig是蛋白质 因此一种动物的Ig对另一种动物而言是良好的抗原 同种型指在同一种动物所有个体的不同类型的Ig共同具有的抗原特异性 同种间不表现出抗原性 只是在异种动物之间才表现出抗原性 Ig的同种型抗原决定簇主要存在于重链C区 同种异型指Ig在同一种动物不同个体之间呈现出的抗原性 同种异型的抗原决定簇存在于IgG IgA IgE的重链C区和k型轻链的C区 同种异型是Ig稳定的遗传标志 可用于亲子鉴定 73 独特型抗体分子的特异性是由Ig的重链和轻链可变区所决定的 因此体内针对不同抗原分子的抗体之间的差别表现在Ig分子的可变区 这种差别就决定了抗体分子在机体内具有抗原性 由抗体分子的可变区呈现的抗原性就称为Ig的独特型 独特位独特型由Ig可变区若干个抗原决定簇所组成 它们被称为独特位 独特型在异种 同种异体乃至同一个体内均可刺激产生相应的抗体 称为抗独特型抗体 74 四 各类Ig的主要特性与功能1 IgG特性是人和动物血清中含量最高的Ig 占血清Ig总量的75 80 IgG是介导体液免疫的主要抗体 多以单体形式存在 分子量为160000 180000 产生与分布IgG主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生 大部分 45 50 在血浆中 其余存在于组织液和淋巴液中 IgG是惟一可通过人 和兔 胎盘的抗体 在新生儿的抗感染中起重要作用 75 IgG的功能IgG是动物机体抗感染免疫的主力 同时也是血清学诊断和疫苗免疫后监测的主要抗体 IgG在动物体内不仅含量高 而且持续时间长 可发挥抗菌 抗病毒 抗毒素以及抗肿瘤等免疫学活性 能调理 凝集和沉淀抗原 与抗原结合后能结合补体 76 2 lgM特性是动物机体初次体液免疫应答最早产生的免疫球蛋白 IgM是由五个单体组成的五聚体 是所有Ig中分子量最大的 分子量为900000左右 又称为巨球蛋白 macroglobulin 产生与分布IgM主要由脾脏和淋巴结中B细胞产生 只分布于血液中 仅占血清lg的10 左右 IgM在体内产生最早 在抗感染免疫的早期起着十分重要的作用 77 IgM的功能与IgG相比 IgM在体内产生最早 但持续时间短 因此不是机体抗感染免疫的主力 但由于它是机体初次接触抗原物质 接种疫苗 时体内最早产生的抗体 因此在抗感染免疫的早期起着十分重要的作用 也可通过检测IgM抗体进行血清学的早期诊断 IgM具有抗菌 抗病毒 中和毒素等免疫活性 由于其分子上含有多个抗原结合部位 所以它是一种高效能的抗体 其杀菌 溶菌 溶血 促进吞噬 调理作用 及凝集作用均比IgG高 大约高500 1000倍 78 3 IgA特性以单体和二聚体两种分子形式存在 单体存在于血清中 称为血清型IgA 约占血清Ig的10 20 二聚体为分泌型IgA 产生与分布分泌型IgA是由粘膜固有层中的浆细胞所产生 主要存在于各种分泌液中 分泌型IgA对机体呼吸道 消化道等局部粘膜免疫起着相当重要的作用 可抵御经粘膜感染的病原微生物 在传染病预防中 经滴鼻 点眼 饮水及喷雾途径免疫 均可产生分泌型IgA而建立相应的粘膜免疫力 79 IgA功能血清型的IgA同样具有抗菌 抗病毒 抗毒素等免疫学活性 分泌型的IgA对机体呼吸道 消化道等局部粘膜免疫起着相当重要的作用 特别是对于一些经粘膜感染的病原微生物 动物体的这种粘膜免疫功能就显得十分重要 若动物体呼吸道 消化道分泌液中存在这些病原微生物的相应的分泌型IgA抗体 则可抵抗其感染 因此分泌型IgA是机体粘膜免疫的一道 屏障 在传染病的预防接种中 经滴鼻 点眼 饮水等途径免疫 均可产生相应的粘膜免疫力 80 4 IgEIgE的产生部位与分泌型IgA相似 在血清中的含量甚微 IgE是一种亲细胞性抗体 易与皮肤组织 肥大细胞 血液中的嗜碱性粒细胞和血管内皮细胞结合 可介导I型过敏反应 IgE在抗寄生虫 某些真菌感染方面也有重要作用 81 82 5 IgD特性很少分泌 在血清中的含量极低 而且不稳定 容易降解 IgD分子量为17 20万 迄今对血清中的IgD的结构和功能尚不完全清楚 是否具有抗感染作用也未证实 有报道认为IgD与某些过敏反应有关 如抗青霉素和牛奶过敏性抗体以及一些自身免疫病抗体 有的属于IgD 功能IgD主要作为成熟B细胞膜上的抗原特异性受体 是B细胞的重要表面标志 此外IgD与免疫记忆与某些过敏反应有关 83 五 抗体的制备 抗体制备技术是免疫学工作者经常采用的一项技术 当今 免疫学已进入分子水平时代 因此抗体的制备亦已步入分子水平 人工制备抗体的类型有三种 即多克隆抗体 单克隆抗体和基因工程抗体 84 一 人工制备抗体的种类1 多克隆抗体 polyclonalantibody PcAb 采用传统的免疫方法 将抗原物质经不同途径 皮内 皮下 肌肉 静脉 腹腔 淋巴结注射等或点眼 滴鼻 饮水等 注入动物体内 经免疫后 分离出血清 由此获得的抗血清即为多克隆抗体 细菌病毒抗原 均是由多种抗原成分组成 即使纯蛋白质抗原分子也含有多种抗原表位 因此进入机体后可激活许多淋巴细胞克隆 机体可产生针对各种抗原成分或抗原表位的抗体 由此获得的抗血清是一种多克隆的混合抗体 具有高度的异质性 一只小鼠能产生约107 108种不同抗体 人约109种 85 2 单克隆抗体 McAb 由一个B细胞分化增殖的子代细胞 浆细胞 产生的针对单一抗原决定簇的抗体 称为单克隆抗体 McAb的特点McAb的重链 轻链及其V区独特型的特异性 亲和力 生物学性状及分子结构均完全相同 86 McAb技术原理K hler和Milstein在1975年建立了体外淋巴细胞杂交瘤技术 用人工的方法将产生特异性抗体的B细胞与同系骨髓瘤细胞融合 形成B细胞杂交瘤细胞 这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖特性 又具有B细胞分泌特异性抗体的能力 由克隆化的B细胞杂交瘤所产生的抗体即为单克隆抗体 87 单克隆抗体的问世 极大地推动了免疫学及其他生物科学的发展 并于1984年获得诺贝尔奖 McAb优点与多克隆抗体比较 McAb具有无可比拟的优越性 具有高特异性 高纯度 均质性好 亲和力不变 重复性强 效价高 成本低 并可大量生产等优点 88 二 B细胞杂交瘤株建立与McAb生产技术基本过程B细胞的制备 骨髓瘤细胞的制备 细胞融合 检测抗体 杂交瘤细胞的克隆化 细胞株冻存或单克隆抗体的生产 89 1 B细胞的制备可用提纯的抗原免疫Balb c或其他品系小鼠 免疫2 3次间隔2 4周 最后一次免疫后3 4d 取小鼠脾脏 制成脾细胞悬液 即为亲本的B细胞 2 骨髓瘤细胞的制备用与免疫相同品系小鼠的骨髓瘤细胞 要求其本身不能分泌Ig 而且具有某种营养缺陷 可用SP2 0或NS 1 它们缺少次黄嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 不能在HAT培养基上生长 3 饲养细胞的准备常用小鼠巨噬细胞或胸腺细胞作为饲养细胞 90 4 选择培养基常用HAT选择培养基 H为次黄嘌呤 T为胸腺嘧啶核苷 二者都是旁路合成DNA的原料 A是氨基喋呤 是细胞内源性合成DNA的阻断剂 在该培养基中 未融合的骨髓瘤细胞不能生长 因它不能利用旁路途径合成DNA 内源性的合成又受到氨基喋呤的阻断 至于未融合的脾细胞则在2周内自然死亡 所以只有融合的杂交瘤细胞才能在该培养基中生长 91 5 细胞融合将脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例 一般3 1 5 1 混合 离心后弃上清液 然后缓慢加入融合剂50 聚乙二醇 PEG4000 摇动试管 静置90s 逐渐加入HAT培养基 分于加有饲养细胞的96孔培养板孔中 置5 10 CO2培养箱中培养 5d后更换一半HAT培养基 再5d后改用HT培养基 再经5d后用完全DMEM培养基 92 6 检测抗体杂交瘤细胞培养后 应用敏感的血清学方法检测各孔中的抗体 视抗原性质的不同 可采用放射免疫分析 酶联免疫吸附试验 免疫荧光抗体技术间接法等 通过检测筛选出抗体阳性孔 93 7 杂交瘤细胞的克隆化对于抗体阳性孔的杂交瘤细胞 应尽早克隆化 一方面是保纯 获得的杂交瘤细胞株是由一个细胞增殖而来的 即单个克隆 另一方面防止染色体丢失 防杂交瘤细胞因染色体丢失而丧失分泌抗体的能力 一般需反复克隆3 5次方能使杂交瘤细胞稳定 克隆的方法包括有限稀释法 显微操作法和软琼脂平板法 94 8 单克隆抗体的生产获得稳定的杂交瘤细胞克隆后 即可用于生产单克隆抗体 可采用的方法有 可将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔 瘤细胞可在小鼠腹腔中无限繁殖 导致腹水产生 腹水可获得5 20mg ml的单克隆抗体 将杂交瘤细胞进行大量细胞培养后 收集培养液分离获得大量的单克隆抗体 可利用微球技术制备单克隆抗体 95 单克隆抗体的制备 96 97 98 三 基因工程抗体 geneticengineeringantibody 利用基因工程技术来制备的抗体分子称为基因工程抗体 是分子水平的抗体 基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子 可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性 去除或减少无关结构 如Fc片段 从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷 如鼠源单克隆抗体在人体内使用会引起抗体产生而降低其效果 Fc片段的无效性的副作用 因此基因工程抗体更具有广阔的应用前景 99 1 嵌合抗体 chimericantibody 又称杂种抗体 是指在同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体 迄今构建的嵌合抗体多为 鼠 人 类型 也就是抗体的Fab或F ab 2来源于鼠类 而Fc片段来源于人类 可将小鼠VH基因与人的CH基因连接后导入骨髓瘤细胞 使之表达嵌合重链 再将小鼠杂交瘤细胞的VL与人CL基因相连 转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞 经过筛选即可得到分泌鼠 人嵌合抗体的骨髓瘤细胞 其所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分泌的抗体特异性和亲和力相同 但减少了抗体中的鼠源性成分 100 101 102 2 重构型抗体 reshapingantibody 尽管嵌合抗体具有一些优点 但该抗体中仍然有近50 的成分来自小鼠 因此为进一步减少鼠源蛋白在嵌合抗体内的含量 将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因中 再将此DNA片段与人免疫球蛋白恒定区基因相连 然后转染杂交瘤细胞 使之表达嵌合的V区抗体 实际上也就是在人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列 通过这种置换为人类抗体提供了一个新的抗原结合部位 103 104 105 3 单链抗体 Single chainantibody 又称FV分子 由于抗体的分子量较大 体内应用时受到一定的限制 因此可用基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段 即FV分子或单链抗体蛋白 这种单链抗体是由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物 linker 连接而成 106 107 此外肽连接物还可将药物 毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合 这类抗体具有分子量小 作为外源性蛋白的免疫原性较低 在血清中比完整的单克隆抗体或F ab 2片段能更快地被清除 无Fc片段 体内应用时可避免非特异性杀伤 能进入实体瘤周围的微循环等优点 108 109 110 4 Ig相关分子可将抗体分子的部分片段 如V区或C区 连接到与抗体无关的序列上 如毒素 就可创造出一些Ig相关分子 例如可将有治疗作用的毒素或化疗药物取代抗体的Fc片段 通过高变区结合特异性抗原 连接上的毒素可直接运送到靶细胞表面 起生物导弹的作用 Byrn构建的 CD4免疫粘附素 即是这一类抗体分子 他是将CD4基因与IG1C区在体外重组而表达出的Ig相关分子 它可封闭人HIVgpl20蛋白与CD4 T细胞的结合 在治疗人的爱滋病上具有重要意义 111 5 噬菌体抗体 phageantibody 这是一类近年刚开始研究的基因工程抗体 是将已知特异性的抗体分子的所有V区基因在噬菌体中构建成基因库 用噬菌体感染细菌 模拟免疫选择过程 具有相应特异性的重链和轻链可变区即可在噬菌体表面呈现出来 这种技术称为噬菌体表面表达技术 phagedisplaytechnology 这种抗体作为研究和治疗用试剂具有广阔的应用前景 112 113 114 115 六 抗体的分类1 根据抗原的来源异种抗体由异种抗原免疫产生的抗体均称为异种抗体 如各种微生物抗体 对异种蛋白和细胞的抗体 因此大多数抗体均属于此类 同种抗体由同种属动物之间的抗原物质免疫所产生的抗体 如血型抗体 组织相容性抗原的抗体 自身抗体针对自身抗原所产生的抗体 如抗核抗体 抗自身Ig的抗体 116 2 根据有无抗原刺激天然抗体指无明显抗原刺激而天然存在于动物体内的抗体 如存在于人血清中的天然血型抗体 A型人血清中有B型红细胞抗体 B型人血清中有A型红细胞抗体 免疫抗体指自然感染 人工免疫动物所产生的抗体 117 3 按Ig的类型分IgG IgM 1gA IgE IgD抗体 4 按反应表现分沉淀素 凝集素 溶解素 调理素 补体结合抗体 中和抗体 保护性抗体等 118 第四节抗体产生的克隆选择学说在免疫学发展的不同时期 不同的学者们提出了不同的关于抗体产生的学说 但