小麦过氧化物酶活性的测定

I 毕毕 业业 设设 计 计 论论 文文 题目题目 干干旱旱胁胁迫迫下下小小麦麦过过氧氧化化物物酶酶 活活性性的的变变化化 作者作者 学院学院生命科学学院生命科学学院 专业专业生物科学生物科学 学号学号 指导教师指导教师 二 一三年六月五日 II 干旱胁迫下小麦过氧化物酶活性的变化 摘摘 要要 以豫麦 69 种子为材料 利用沙基培养法培养小麦幼苗 用 Hoagland 培养 液浇灌 在小麦幼苗培养到第 10 天时 对其中一半的小麦幼苗进行干旱处理 在干旱处理后的第 3 天 6 天 9 天进行过氧化物酶活性的测定 采用比色法 用分光光度计在 470nm 波长下测量其吸光值 以每分钟 OD 值变化表示其酶活性 大小 实验结果表明 在干旱胁迫下 小麦幼苗过氧化物酶活性提高 随干旱 时间延长 过氧化物酶活性增长速率减慢 关键词关键词 小麦 干旱 过氧化物酶 Abstract We take Yumai 69 as the material culture the wheat seedlings with Chaki and irrigate them with Hoagland culture medium Half of zhe wheat seedings were divided under drought To determine the peroxidase s activity in the drought treatment after the third day the sixth day and the ninth day and use the guaiacol colorimetric Spectrophotometer at 470nm wavelength to measure the resultant content take the OD changes in the value per minute as the enzyme activity size The results showed that the rice peroxidase activity enhanced over time under the drought conditions with prolonged drought in time the peroxidase activity of the growth rate slows down Keywords drought conditions peroxidase wheat III 目 录 1 前言 1 1 1 中国淡水资源现状 1 1 2 研究小麦干旱的意义 1 1 3 植物体内过氧化物酶的作用 2 2 实验设计 2 2 1 实验材料与方法 2 2 1 1 实验材料 2 2 1 2 小麦种子的萌发 3 2 1 3 Hoagland 培养液的配置 3 2 1 4 小麦幼苗的培养与处理 3 2 1 5 试剂的配置 3 2 1 6 粗酶液的提取 4 2 1 7 酶活性的测定 4 2 2 结果与分析 4 2 2 1 实验数据 4 2 2 2 实验结果 5 2 2 3 结果分析 5 2 2 4 讨论 5 3 结论 6 参考文献 7 致谢 8 1 1 前言前言 1 1 中国淡水资源现状中国淡水资源现状 随着全球温室效应的加剧和生态平衡的破坏 干旱已成为全人类面临的一 个严重生态问题 早在1972 年 联合国就在 人类环境 全球会议上向全世界 发出警告 水即将成为继石油危机之后的一项严重的社会危机 1992 年 联合 国发布的 二十一世纪议程 提出 水不仅是地球上的一切生命所必需 而 且对一切社会经济部门都具有生死攸关的重要意义 同发达国家相比 中国水 危机状况尤其严重 中国人均水资源占有量仅为2900 不足世界平均水平的 1 4 居世界第 109 位 属于世界上 13 个贫水国家之一 另外 中国水资源 不但总量不足 而且时空分布极不均匀 在耕地和人口分别占全国总量的 45 和 38 的北方 15 个省区中 水资源仅占全国的9 7 在我国水资源极度紧缺 的同时 农业用水浪费又十分严重 灌溉水的利用率只有 40 左右 每立方米 的粮食生产效率只有1 kg 左右 与发达国家的以色列相比 以色列的农业用水 效率则达到每立方米2 3 kg 更由于近年来的持续干旱和对水资源的过度开 发利用 连同愈来愈严重的水体污染 不但使工 农业用水和生活用水矛盾日益 突出 甚至已酿成如黄河断流 河川断流 海水入侵 地面沉降等生态灾难 1 2 已成为这些地区农业可持续发展的最大障碍 可以预料 到2030 年中国人口达 到高峰期时 为解决 16 亿中国人口的吃饭生存问题 水危机形势将更加严重 在此形势下 必须全面实施节水农业和旱作农业 建立农作物 如小麦 抗旱性 综合评价体系 进行抗旱育种的基础与应用研究 这是我国农业可持续发展的必 由之路 1 2 研究小麦干旱的意义研究小麦干旱的意义 小麦属于禾本科的小麦属 它是世界上最早栽培的农作物之一 经过长期 的发展 已经成为世界上分布最广 面积最大 总产量第二 贸易额最多 营 养价值最高的粮食作物之一 全世界有43个国家 有35 40 的人口以小麦为 主要粮食 小麦子粒含有丰富的淀粉 较多的蛋白质 少量的脂肪 还有多种 矿物质元素和维生素 B 是一种营养丰富 经济价值较高的商品粮 并且随着 人口数量的增加 人们对小麦的需求量也在不断增加 所以了解小麦在干旱胁 迫下的反应机制对培育抗旱小麦品种 提高产量和品质具有重要意义 目 前 小麦抗旱机制的研究主要集中在形态结构方面 包括根系构型 结构及叶 片形态 生理机制方面 包括光合作用 渗透调节 酶及蛋白质含量 分子生 物学等方面 3 2 1 3 植物体内过氧化物酶的作用植物体内过氧化物酶的作用 过氧化物酶是生物体内的一种重要的蛋白质 是由微生物或植物所产生的 一类氧化还原酶 主要存在于细胞的过氧化物酶体中 与植物的抗逆性有关 是植物体内重要的保护酶之一 4 普遍存在于植物各种组织器官中 具有物种 组织器官和发育阶段的特异性 它对环境变化十分敏感 如辐射 重金属 低 温 盐胁迫 干旱胁迫等逆境下都会引起酶谱带及活性的变化 实验设计实验设计 2 1 实验材料与方法实验材料与方法 2 1 1 实验材料实验材料 1 材料 小麦种子选用豫麦 69 属半冬性大穗型中熟品种 幼苗半匍匐 叶色浓绿 生长势强 抗寒性好 抗冬寒 耐春冻 2 仪器 紫外分光光度仪 离心机 秒表 天平 研钵 磁力搅拌器 移液枪 烧 杯 量筒 试管 容量瓶 玻璃棒 试剂瓶 移液管 剪刀 3 试剂 20mmol L KH2PO4溶液 PH6 0 磷酸缓冲液 附表 2 1 愈创木酚 30 过氧化氢溶液 Hoagland 培养液 0 2 KMnO4溶液 石英砂 表 2 1 磷酸缓冲溶液 PHXYPHXY 3 046 53 54 823 027 0 3 243 76 35 020 529 5 3 440 010 05 218 032 0 3 637 013 05 416 034 0 3 835 015 05 613 736 3 4 033 017 05 811 838 2 4 231 518 56 09 540 5 4 428 022 06 27 242 8 4 625 524 5 x mL A y mL B 稀释至 200mL 3 贮备液 A 0 2mol L 磷酸二氢钠 NaH2PO4 H2O 27 6 g 配成 1000mL 贮备液 B 0 2mol L 磷酸氢二钠 Na2HPO4 7H2O 53 65 g 或 Na2HPO4 12H2O71 7 g 配成 1000mL 5 2 1 2 小麦种子的萌发小麦种子的萌发 播种前 将种子与沙子用 0 2 KMnO4 溶液浸泡消毒十五分钟 流水冲洗 10min 然后将种子置于 25 环境下浸泡 24h 最后置于 25 的恒温培养箱培 芽 24h 2 1 3 Hoagland 培养液的配置培养液的配置 1 大量元素的配置 称取四水硝酸钙 0 945g 硝酸钾 0 506g 硝酸铵 0 08g 磷酸二氢钾 0 136g 硫酸镁 0 493g 将药品放入烧杯中溶解 然后用 1000ml 容量瓶定容 2 铁盐溶液的配置 称取七水硫酸亚铁 2 78g 乙二胺四乙酸二钠 EDTA Na 3 73g 置于扫杯 中溶解后用 500ml 容量瓶定容 pH 5 5 3 微量元素液的配置 称取碘化钾 0 83mg 硼酸 6 2mg 硫酸锰 22 3mg L 硫酸锌 8 6mg 钼酸钠 0 25mg 硫酸铜 0 025mg 氯化钴 0 025mg 将药品置于烧杯中溶 解后用 1000ml 容量瓶定容 4 向配置好的大量元素溶液中加入 2 5ml 的铁盐溶液 5ml 的微量元素溶液 混合均匀 调整溶液 PH 6 0 所得溶液既为 Hoagland 完全培养液 2 1 4 小麦幼苗的培养与处理小麦幼苗的培养与处理 将萌发一致的种子播于装有消好毒的沙子的盘中 置于普通环境下培养 每天浇灌适 量水 每两天浇灌适量 Haogland 营养液 待小麦长到第十天时 将幼苗分为正常对照组和 持续干旱组 持续干旱组小麦停止加水 正常组不变 干旱处理后的第 3 天 6 天 9 天分 别对干旱组和正常组小麦进行过氧化物酶活性测量 2 1 5 试剂的配置试剂的配置 1 20mmol L KH2PO4试剂的配制 称取 2 72g KH2PO4置于烧杯中溶解 然后用 1000ml 容量瓶定容 2 PH6 0 的磷酸缓冲液的配置 4 称取 NaH2PO4 2H2O 31 2g 置于烧杯中溶解 然后用 1000ml 容量瓶定 容 称取 Na2HPO4 12H2O 71 7 g 置于烧杯中溶解 然后用 1000ml 容量瓶 定容 取 87 7ml 贮备液 A 12 3ml 贮备液 B 混匀 稀释成 200ml 配制成 PH 为 6 0 的磷酸缓冲液 3 反应混合液的配置 取 100 mmol L Ph6 0 磷酸缓冲液 50ml 加入愈创木酚 28uL 于磁力搅拌 器上加热搅拌 直至愈创木酚溶解 待溶液冷却后 加入 30 过氧化氢 19uL 混合均匀 保存于冰箱中 2 1 6 粗酶液的提取粗酶液的提取 称取 1g 正常小麦材料 放入加石英砂的研钵中 加入 5ml 20mmol L KH2PO4溶液 研磨成匀浆 以 4000 r min 离心 15 min 收集上清液保存在冷处 残渣再用 5 ml 20mmol LKH2PO4溶液提取一次 合并两次上清液 6 干旱处理 的小麦粗酶液的提取过程和正常处理的小麦的提取过程相同 2 1 7 酶活性的测定酶活性的测定 取两只光径 1cm 的比色杯 一只加入反应混合液 3ml 20mmol L KH2PO4 1ml 作为较零对照 另一只加入反应混合液 3ml 正常处理的小麦粗酶 提取液 1ml 如酶活性过高可适当稀释 立即开启秒表计时 于分光光度计 470nm 波长下测量 值 没隔一分钟读数一次 以每分钟 变化值表示酶 活性大小 干旱处理的小麦 活性的测定的过程和正常处理的小麦的测定 过程相同 2 2 结果与分析结果与分析 2 2 1 实验数据实验数据 每分钟 OD 值12345 正常0 5471 2461 6751 9422 141 第三天 干旱0 4230 8781 1341 3311 522 5 正常0 3140 8061 2871 6571 964 第六天 干旱0 4360 8511 3871 6081 787 正常0 5101 2751 6931 9872 297 第九天 干旱0 3260 7881 3141 5251 724 2 2 2 实验结果实验结果 酶活性 OD D 0 01W t OD 为反应时间内吸光度的变化值 为植物鲜重 为反应时间 1min 为稀释倍数 酶活单位为 FW min 0 01 为一个过氧化物酶活性单位 7 2 2 3 结果分析结果分析 由图表干旱组与正常组的对比可知 经干旱处理后 小麦幼苗的 POD 活性 增强 甚至是成倍的增强 通过干旱组之间的对比可知 小麦干旱处理的前 6 天 小麦幼苗 POD 活性增强的速率较快 第 6 天以后 小麦幼苗的 POD 活性 虽然也有所增加 但速率明显下降 根据氧自由基伤害学说 干旱胁迫会使小麦体内氧自由基的的含量增加 进 而破坏氧自由基原本低水平的动态平衡 引起细胞膜脂质过氧化 细胞膜通透 6 性发生变化 细胞器甚至整个细胞的结构都会受到破坏 过氧化物酶是植物酶 促反应体系的保护酶 它可以防御活性氧对植物细胞的伤害 以减轻干旱对小 麦幼苗的伤害 8 10 在干旱初期 小麦细胞体内活性氧增加 为了防御活性氧 对细胞的伤害 小麦细胞内的 活性增强 但随着干旱时间的延长 小麦 体内活性氧的含量越来越多 进而破坏了小麦体内保护酶系统 过氧化物体 的活力和平衡 最后使得POD的活性增强受到抑制 2 2 4 讨论讨论 植物在正常的生理条件下 体内的氧自由基是处于低水平的动态平衡状态 而在干旱条件下 氧自由基的动态平衡遭到破坏 进而使细胞遭受伤害 而POD 可以防御活性氧对细胞的伤害 在活性氧的代谢过程中 POD可催化NADH 或 NADPH氧化成O2 进一步被歧化为H202和分子氧 11 H202是一种相对稳定的分 子 在POD催化下转变成对细胞无害的H2O和02 POD活性增强可缓解干旱胁迫造 成的氧化性损伤 减轻对细胞膜的破坏 这是生物体的一种适应性反应 但POD 活性的增强并不能完全阻止干旱对小麦的伤害 所以 活性增加的速率会 随干旱时间的延长而降低 从实验结果来看 酶活性的变化符合氧自由基伤害学说 体现了 作 为一种保护酶的功能 通过对干旱条件下小麦 活性的研究 对筛选小麦 抗旱品种有一定的指导意义 当前小麦抗旱性研究的相关趋势是从实验室到农 田的转移 从小麦的单个时期到整个生活周期的延伸 从研究一个基因到探索多个 基因的功能超过几百的过度 伴随着基因库和基因芯片在小麦抗旱性领域的普 遍应用转基因小麦种植面积的不断扩大 小麦抗旱性研究将取得重大突破 12 3 结论结论 过氧化物酶是植物体内的一种重要保护酶 与植物的抗逆性有关 在干旱条 件下 小麦过氧化物酶的活性增强 但干旱到一定程度时 POD 酶活性即受 到抑制而增长变慢 发生这种现象的原因可能是干旱脱水严重时 POD 酶结构 受到影响 活性中心构象遭到破坏或障碍 从而使酶活性下降 本研究证实从 一定干旱处理时间的 POD 酶活性变幅大小上可以判断小麦抗旱性大小 这样 POD 酶活性可以作为评价稻品种抗旱性的指标之一 7 参考文献参考文献 1 Riccardi F Gazeau P de Vienne D et al Protein changes in response to progressive water deficit in maize J Plant Physi2ology 1998 117 125321263 2 Bais H