肿瘤药理实验方法

肿瘤药理实验方法 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞 即称之为细胞系 CellLine 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法 由单细胞增殖形成的细胞群 称细胞株 Cellstrain 细胞株与细胞系的概念 肿瘤细胞体外实验方法 动物的 人的 动物肿瘤体内实验方法 移植性 诱发性 自发性 肿瘤转移的动物实验模型 肿瘤免疫药理研究方法 肿瘤药理学基本的实验方法 体内实验Invivo 肿瘤药理学实验方法 InVitro 肿瘤药理学体内实验方法 整体动物实验法是评价一个药物是否有效的最主要的方法 即使在体外有一个很好的疗效 最终也一定要在体内进行观察 因此 用整体动物实验方法来观察药物的作用显得很重要 研究药物的体内抗肿瘤作用 就必须建立各种肿瘤的动物模型 模型越接近于人体其意义越大 动物肿瘤体内实验方法 实验动物的选择 移植性动物肿瘤模型 诱发性动物肿瘤模型 自发性动物肿瘤模型 不同种类的动物对致癌物质的敏感性不同 其癌自发率也不同 常用于自发 诱发或移植的动物有 小鼠 裸鼠 金黄地鼠 大鼠豚鼠 两栖类动物如蛙 鸟类 其它许多家畜如猪马牛羊犬猫家兔等都可发生各种肿瘤 动物肿瘤体内实验方法动物的选择 小鼠小鼠肿瘤自发率高 其自发性肿瘤无论是从组织发生 临床过程以及组织形态学上都与人类的肿瘤接近 所以小鼠目前广泛用于癌 肉瘤 白血病以及其它恶性肿瘤的研究 进行抗肿瘤药物筛选 小鼠自发性肿瘤模型优于移植性肿瘤模型 动物肿瘤体内实验方法动物的选择 裸鼠裸鼠是一种独特的纯系动物 全身无毛 先天性无胸腺 T淋巴细胞缺乏 细胞免疫功能缺乏 对异体移植几乎无免疫排斥反应 可接受异系 异种肿瘤肿瘤移植等 有 活试管 之称 自从1969年Rygaard Povlesev二氏将人类肿瘤异种移植于裸鼠首次获得成功后 它在肿瘤研究中已被广泛利用 目前移植于裸鼠较为成功的人类肿瘤有 结肠癌 乳腺癌 肺癌 卵巢癌 宫颈癌 白血病等 动物肿瘤体内实验方法动物的选择 裸小鼠的费用昂贵 饲养时对实验室的条件要求高 小鼠不易大量繁殖 因而一般不用于药物的初筛选研究 由于先天性免疫缺乏 因而在一般情况下也不用于免疫药物的研究 裸鼠的缺点 动物的选择 C57BL 6小鼠小鼠类的一种 黑毛 体型小 性情较温顺 易于饲养管理 对药物敏感性好 为研究Lewis肺癌所选小鼠 费用适中 饲养条件不太高 易大量繁殖 因而一般可用于药物的体内初筛选研究 Lewis肺癌为C57BL 6小鼠来源的肿瘤 动物的选择 大鼠大鼠也广泛用于肿瘤研究 与小鼠相比 大鼠的体型较大 供给的组织较多 便于进行手术等实验操作 大鼠的肝脏对致癌物质很敏感 可用二乙基亚硝胺 二甲基偶氮苯 DAB 复制大鼠肝癌动物模型 还可用甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌动物模型 大鼠的自发性癌变的发生率较低 动物的选择 金黄地鼠 金黄地鼠是肿瘤学实验研究中最常用的动物 她广泛用于研究肿瘤的增殖 致癌 抗癌 肿瘤转移 康癌药物的筛选等 豚鼠 曾被认为是很少发生肿瘤的动物 近年发现豚鼠也可发生自发性肿瘤 例如支气管乳头腺瘤 白血病等 两栖类动物 蛙类无毛 光滑的皮肤与人类接近 可为皮肤癌的研究提供实验模型 鸟类 鸡和其它鸟类对肿瘤病毒的研究具有极高的实用价值尤其是对于造血系统和间叶组织肿瘤病毒株具有易感性 鱼类 鱼类也可发生不少自发肿瘤 它们对化学致癌物十分敏感 例如用黄曲霉素 二乙基亚硝胺等可诱发鱼类肝脏肿瘤和肾母细胞瘤 其它 许多家畜如马牛羊猪犬猫家兔等都可发生各种肿瘤 动物肿瘤体内实验方法动物的选择 动物肿瘤体内实验方法 实验动物的选择 移植性动物肿瘤模型 自发性动物肿瘤模型 诱发性动物肿瘤模型 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 用人的肿瘤细胞通过移植的方法移植到适合的动物宿主体内 建立一个移植宿主的体内模型 通过该模型对实验药物进行药理药效学观察 人体肿瘤动物体内移植可观察癌细胞对药物的敏感性试验 药物对癌细胞的逆转作用 药物对癌细胞的增殖抑制作用和诱导癌细胞的凋亡等作用 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 动物要求 肿瘤细胞来源 肿瘤细胞冻存与复苏 肿瘤细胞体内接种 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 由于人和动物不同种 存在移植排斥反应 故要用免疫缺陷动物 如裸鼠 裸小鼠是一种独特的纯系动物 全身无毛 先天性T细胞缺乏 对异种肿瘤移植几乎无免疫排斥反应 可接受人类肿瘤移植 裸大鼠无胸腺 缺少T细胞 故能成功地移植异种皮肤和异种肿瘤 包括小鼠肿瘤及人肿瘤 动物要求 小白鼠 裸鼠 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 人体肿瘤细胞的来源大致可分为两类 一类是人的癌细胞株 可从细胞库或其他实验室得到 另一类是源于人体肿瘤组织块的癌细胞 主要从临床肿瘤患者体内获得 为了使肿瘤细胞能得到长期使用和保持不同代的肿瘤组织的本来特性 防止退化或变异 对肿瘤细胞的冷冻保存是很必要的 一般情况下 液氮冻存1 2年后 细胞存活率可达80 90 涉及细胞冻存与复苏技术 肿瘤细胞的来源 1 消化洗涤将对数增殖期的细胞或腹水瘤细胞经消化脱壁后 用培养液洗涤l次 2 冻存细胞配制含有保护剂 10 15 的DMSO 甘油等 的培养液作为细胞冻存液 以肿瘤细胞在细胞冻存液中的密度为l l07 ml左右悬浮细胞 将细胞悬液加入到2ml塑料冻存管内 密封后注明标记 将冻存管放入4 或 30 低温冰箱内2h后 移入液氮罐内长期保存 3 冻存细胞的复苏将冻存肿瘤细胞的冻存管从液氮罐内取出 立即置于37 40 温水中 使冻存细胞在lmin内全部融化 1000r min离心l0min 弃去上清液 用新鲜培养液稀释到所需细胞数 再进行培养 慢冻快融原则 人体肿瘤动物体内移植模型的建立冻存与复苏方法 1 体外培养扩增无菌条件下 将复苏的肿瘤细胞体外培养 扩增 2 制备细胞悬液在对数生长期 用0 05 胰蛋白酶和0 02 乙二胺四乙酸 ethylenediaminetetraaceticacid EDTA 消化1 2min 倾出消化液 加入无血清1640液洗涤 离心 计数 用无血清1640液或无菌生理盐水配成浓度为1 107 ml的细胞悬液 3 接种肿瘤细胞在无菌环境中 消毒皮肤 用lml注射器抽吸取0 2ml细胞悬液 约含2 106个肿瘤细胞 接种在裸鼠右前肢根部 腋窝 皮下 约1周左右局部就长出花生米粒大小瘤块 4 饲养 观察在无菌环境中饲养 观察 观察瘤块生长情况 定期测量瘤体的直径 最后剥瘤称重 计算抑制率 接种步骤 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立 小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法 瘤体测量方法 接种方法 主要特点 实体瘤动物体内移植模型的主要特点 1 一群动物同时接种等量同种癌细胞 肿瘤生长速度比较一致 个体差异较小 2 接种的成活率高 接近100 3 对宿主的影响较相似 易于客观判断疗效 4 可在同种或同品系动物中连续移植 长期保留 供试验用 5 试验周期一般较短 试验条件易于控制 实体瘤动物模型主要用来筛选抗肿瘤药物 移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立 小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法 瘤体测量方法 接种方法 主要特点 小块瘤体接种法 从动物剥离取出肿瘤后 剔除非肿瘤组织和坏死组织 选取生长良好而无变性坏死 呈淡红色 黑色素瘤则呈黑色或黑紫色 鱼肉状的瘤组织 切成2mm 2mm 2mm的小块 在所选宿主动物的腋下剪开一个小口 用无钩眼科镊子夹取小块 送入切口内皮 如何保证切成的小块是2mm 2mm 2mm 为什么接种在腋下 因为腋下部皮肤松弛 能使肿瘤生长得较大 可延长宿主动物的寿命 实体瘤动物体内移植模型的接种方法 肿瘤细胞悬液接种法 将选取的肿瘤组织放入玻璃匀浆器中 用无菌生理盐水研磨后 经滤网过滤成单个的细胞悬液 用台盼蓝染色法计数活细胞数 每个接种点皮下注射0 2ml 含1 l06 1 l07个细胞 每只动物可选用一个或多个接种点 通常接种于腋下部皮下 在无菌条件下操作 实体瘤动物体内移植模型的接种方法 1 研磨方向及转速制备肿瘤细胞悬液时 在人工研磨时必须使研磨杆向同一方向转动 不可反向交替研磨 防止磨破肿瘤细胞 如果采用电动研磨 一定要控制好转速 以免破坏完整的肿瘤细胞 2 细胞数细胞数多少适中 如果瘤细胞数过多 接种后瘤体生长过快 不便于药物作用的观察 瘤细胞数过少 会导致接种失败 接种部位不能形成肿瘤 接种失败后再在原动物体内重新接种也难成功 必须重新更换动物 为什么 肿瘤细胞悬液接种注意事项 将培养至快要融合的单层细胞 对数生长期 用0 25 的胰蛋白酶消化脱壁以后 经用PBS或生理盐水以1000r min经l0min离心洗涤2次后 洗掉细胞中胰蛋白酶和培养液中血清等成分 用台盼篮染色法计数活细胞数 用生理盐水将肿瘤细胞稀释成1 l06 1 l07 ml 每个接种点皮下注射0 2ml细胞 细胞悬液可置于冰上 培养细胞动物体内移植法 实体瘤动物体内移植模型的接种方法 移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立 小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法 瘤体测量方法 接种方法 主要特点 实体瘤动物体内移植模型 实体瘤瘤体测量方法 测量实体瘤生长的方法有多种 主要包括测定肿瘤的质量 体积或直径等 瘤体测量方法 通常于停药之后次日处死动物 立即剥离取出瘤块 剔除其他组织后称重 若对照组小鼠肿瘤平均小于1g或20 小鼠的瘤重小于400mg 表示肿瘤生长不良 在治疗期间给药组小鼠死亡率大于20 或平均体重下降 自身对照 超过15 者 表示药物毒性反应 应适当减量重复试验 比较试验组与对照组瘤重的差异 按下列公式计算肿瘤抑制率 肿瘤抑制率 100 称量肿瘤的质量 当中药组的瘤重抑制率大于30 需重复试验 连续数次疗效稳定 并经统计学处理有显著性差异时 则评定此药有一定疗效 瘤体的直径与肿瘤的大小及质量成正比 测量瘤体的直径不需要处死动物 可用来动态观察瘤体的变化 方法 用游标千分卡尺测量肿瘤的相互垂直的直径 取它们的平均值即为平均直径 MD 100 MD为肿瘤平均直径 A B C为实体肿瘤3个相互垂直的直径 一般用毫米为单位 由于测量的厚度包括皮肤在内 故瘤体越小 产生的误差也就越大 注意由同一实验者测量 瘤体测量方法 测量肿瘤的直径 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物模型的建立 小鼠 6 7周龄 体重18 22g 组间平均体重相差不宜超过1g 健康 纯种 杂种或杂交第一代 同一种性别 一般用雌性动物接种 接种方法 取出小鼠接种第5 7d的腹水 用生理盐水将细胞浓度稀释为1 l06 1 l07 ml 每只小鼠腹腔注射0 2ml细胞悬液即可 腹水瘤传代 腹水瘤的传代方法与移植接种方法一样 需注意的是动物的年龄与体重对腹水会产生影响 也是导致数据离散的主要原因 腹水瘤移植接种方法 给药方法 常用皮下注射 腹壁皮下注射或灌胃 不宜腹腔注射 给药方案 一般每天给药l次 疗程7 10d 亦可每天给药数次 或间歇给药 给药剂量 如有LD50资料可供参考时 一般每日可用1 3 1 5LD50的剂量 动物数 实验组一般为6 10只 对照组数目可根据试验组多少决定 亦可参考下列公式 对照组鼠数 实验组鼠数 操作时间 接种操作时间应尽可能短 不应超过半小时 炎热季节应注意降温 可在瘤源周围置以冰块 其它 严格无菌操作 瘤源污染常导致整批实验失败 实验记录应尽可能详细 可参考1978年全国抗癌研究协会制定的抗肿瘤药物体内筛选规程 腹水瘤移植实验注意事项 腹水瘤的测量方法是对小鼠进行每天1次的体重称量 一般在疗程结束后次日称体重 逐日记录 然后进行自身对照或用空白对照 观察比较体重变化 非实体瘤动物模型的建立 腹水瘤测量方法 对照组通常在2 3周内死亡 若治疗期间对照组动物死亡 20 或其20 存活时间长于4周以上 实验均应作废 治疗组观察时间一般为50d左右 按下列公式计算生命延长率 生命延长率 100 非腹腔给药时生命延长率 50 腹腔给药时生命延长率 75 则认为有苗头 连续3次疗效稳定 则评价此药有一定疗效 非实体瘤动物模型的建立 疗效判断标准 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 动物肿瘤体内实验方法 实验动物的选择 移植性动物肿瘤模型 诱发性动物肿瘤模型 自发性动物肿瘤模型 动物肿瘤体内实验方法 诱发性动物肿瘤模型 肿瘤的发生 与一系列致癌因子有关 用化学 物理 生物性致癌因子在动物机体诱发出各种类型的肿瘤 均称为诱发性肿瘤 诱癌动物模型的建立 可用来验证可疑致癌因素的致癌作用 进一步可用来观察药物对致癌因因子的作用 从而用来评价药物的抗癌作用 动物肿瘤体内实验方法 诱发性动物肿瘤模型 能够诱发肿瘤的因素很多 在实验中常用的诱癌剂对各种动物及其不同器官 不同部位会产生不同的反应 同种诱癌剂对同种动物的皮肤 食管 肝 肺 乳腺的部位会产生不同的反应 动物因种群的不同 对致癌因子会产生出不同的反应 也能诱发出不同的肿瘤 因此 建立一个诱癌的动物模型能否成功 与诱癌剂 动物的种类 种群密切相关 通常 在建立诱癌动物模型时 要考虑如下三条因素 动物肿瘤体内实验方法 诱发性动物肿瘤模型 1 动物对致癌物质的敏感性不同诱癌剂 对不同动物品系的敏感性不同 用环芳烃类诱发皮肤癌多选用小鼠 用不对称亚硝胺 如甲基苄基亚硝胺 甲基苯基亚硝胺 诱发食管癌多选用大鼠 用二乙基亚硝胺 4 二甲基氨基偶氮苯 DAB 诱发肝癌则多用大鼠 2 动物对致癌物剂量的反应性一般选用诱发期短 诱发率高 成活率高的剂量 3 动物对饲养条件的反应性某些营养物质会影响诱癌剂的作用 如饲料内的维生素B2会影响奶油黄 DAB 诱发肝癌 高脂饲料对诱发皮肤及肝癌有增强作用 动物肿瘤体内实验方法 诱发性动物肿瘤模型常用方法 一 整体实验1 涂抹法诱发皮肤癌小鼠局部脱毛2 经口给药胃癌诱发肿瘤模型将致癌物放入饮水中 或灌胃给药二 体外实验选已获得无限增殖力 但保持着接触抑制的细胞 同源动物体内接种无致瘤性 即尚未发生恶性转化 待细胞生长进入指数增生期时 向培养瓶中加入致癌剂 动物肿瘤体内实验方法 诱发实验动物肿瘤模型注意事项 凡是诱导动物发生肿瘤的物质 均能诱发人体肿瘤或对人体有毒害性 因此 进行该类实验时 须注意如下事项 1 保持动物饲养室内空气流通 2 在通风橱内给被试动物用药 3 实验者要采取隔离防范措施 如戴口罩 手套 防护服等 实验结束要清洗手和裸露的部位 动物肿瘤体内实验方法 实验动物的选择 移植性动物肿瘤模型 诱发性动物肿瘤模型 自发性动物肿瘤模型 动物肿瘤体内实验方法 自发性动物肿瘤模型 实验动物种群不经过有意识的人工实验处置而自然发生的一类肿瘤称之为自发性肿瘤 与诱发性肿瘤相比 自发性肿瘤与人类所患肿瘤更为相 有利于将动物实验结果推用到人 动物肿瘤体内实验方法 自发性动物肿瘤模型 培育自发性肿瘤发生率高的小鼠 AKR小鼠出生后一年半内90 以上的AKR小鼠会患白血病 该肿瘤可用强的松和长春新碱治疗而缓解 其对药物的治疗反应类似儿童急性淋巴性白血病 可作为研究人体白血病和淋巴瘤的模型 自发肿瘤多数为病毒性 AKR白血病小鼠出生时即带有致癌的RNA病毒 BALB C小鼠BALB C雌鼠可自发乳癌 这是当前新药研究中自发瘤模型应用最多的小鼠 它们于出生后大约10个半月左右可摸到肿瘤 自发瘤可高达70 生存大约20 35天死亡 方法 繁殖BALB C小鼠 雌 在摸到肿瘤瘤块后分组给药 用小鼠生存时间延长率来评价药物的疗效 动物肿瘤体内实验方法 自发性动物肿瘤模型 自发性肿瘤虽然具有与人类所患肿瘤更为相似的优点 但是不可能在短时间内获得大量肿瘤学材料 肿瘤的发生情况可能参差不齐 观察时间较长 实验耗费较大 故一般很少用于药物筛选 但在肿瘤生长的漫长时间里可以观察 发现原来没有发现的环境的或其它的致癌因素对肿瘤形成的影响 进行肿瘤发病学研究 动物肿瘤体内实验方法 实验动物的选择 移植性动物肿瘤模型 自发性动物肿瘤模型 诱发性动物肿瘤模型 肿瘤细胞体外实验方法 动物的 人的 动物肿瘤体内实验方法 移植性 诱发性