土壤微生物数量测定.doc

土壤微生物数量测定（一）培养基的制备：测定微生物总量培养基：1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）牛肉膏Beefextract 5.0g蛋白胨Peptone 10.0gNaCI 5.0g蒸馏水H20 1000m1PH 7.27.42. 放线菌培养基 （高氏1号琼脂培养基）可溶性淀粉 20gKNO3 1gK2HPO4 0.5gMgSO4 7H2O 0.5gNaCl 0.05gFeSO4 7H2O 0.01gpH 7.2-7.4注：配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH。 另：倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL(l00ppm)。3. 真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）葡萄糖 10.0gMgSO4.7H2O O.5g 蛋白胨 5.0g 孟加拉红 33.4mg （或者每升加1%溶液3.3mL）K2HPO4 1g蒸馏水H20 1000m1PH 自然(45)注：灭菌前加卡那霉素20g/ml，或者倒平板之前加链霉素。倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。以上培养基皆加琼脂15g/L。 测定功能菌所用培养基：1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A） (NH4)2SO4 2.0g NaH2PO4 0.25gMnSO44H2O 0.01gMgSO47H2O 0.03gK2HPO4 0.75gCaCO3 5.0g蒸馏水 1000mlPH 7.2注：CaCO3最后加，不需要溶解，直接调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。下同。2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B）NaH2PO4 0.25gK2HPO4 0.75gMgSO47H2O 0.03gMnSO44H2O 0.01gCaCO3 1.0g Na2CO3 1.0gNaNO2 1.0g蒸馏水 1000mlPH 7.23. 反硝化细菌培养基柠檬酸钠 5.0 gKNO3 2.0 gKH2PO4 1.0 g,K2HPO4 1.0 gMgSO47H2O 0.2 g蒸馏水 1000 mlpH值 7.27.54.好气性自生固氮菌培养基（改良阿须贝(Ashby)无氮培养基）苯甲酸钠 1.5 gK2HPO4 0.2 gMgSO47H2O 0.2 gNaCl 0.2 g CaSO42H2O 0.1 g PH 7.47.6注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，要露出液面。5.氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基）K2HPO4 0.5 gKH2PO4 0.5 g,MgSO47H2O 0.5 g蛋白胨 5.0 g蒸馏水 1000mlPH 7.07.26. 好气性纤维素分解菌培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基）KH2PO4 1.0 gFeCl36 H2O 0.1 gMgSO47H2O 0.3 gCaCl26H2O 0.1 g NaCl 0. 1 g NaNO3 2.5 gpH 7.274注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm滤纸长条，需露出液面。(二)试剂的配制1.格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液：第一液：将0.5g的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。第二液：将0.5g-萘胺（-naphthylamine）加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。2. 纳氏试剂甲液：将20.0g碘化汞和10.0g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。乙液：将20.0g氢氧化钾溶于100ml水中。分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置2天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。3.二苯胺试剂：溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后徐徐加入100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。（三）实验器材：1.仪器设备4冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。2.器材准备将90ml水装入250ml三角瓶中，并装有15-20个玻璃珠，灭菌。将9ml水装入试管，灭菌。试管架，1ml无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。（四）实验方法：1.样品采集在靠近植株根系部, 去除表层0-5cm的表土，采集520 cm土壤剖面,多点采集, 混匀后四分法取1 kg, 装无菌塑料袋带回，4冰箱保存。2.悬液制备称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。此为10-1土壤悬液，吸取lml此土壤悬液于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，制成10-2土壤悬液。以此类推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的土壤悬液。3.土壤悬液稀释度选择细菌:10-410-6放线菌：10-310-5真菌：10-210-4以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。亚硝酸细菌：10-310-6 硝酸细菌：10-310-6反硝化细菌：10-410-7好气性自生固氮菌：10-310-6氨氧化细菌：10-510-8好气性纤维素分解菌：10-210-5以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。4.接种液体培养基将六种功能菌培养基分装于试管中，每管5ml，每个菌需培养基12支试管。按照纵3横4的方阵排列于试管架上，标签示之。 用1ml无菌吸管依次从低浓度到高浓度吸取土壤稀释液，放入各自对应编号的管中。另取一管培养基接种1ml无菌水作为对照。琼脂培养基将细菌、放线菌、真菌琼脂培养基采用混菌法进行接种，每个培养皿接种lml土壤稀释液，二次重复。接种后，倒入15-20ml培养基迅速混匀。5.培养将所有试管和平板置于25-28黑暗条件下避光培养。培养时间由短到长分别为：真菌：23d；细菌：34d；放线菌：57d。氨氧化细菌：78d；好气性自生固氮菌：78d；亚硝酸细菌：1014d； 硝酸细菌：1014d；反硝化细菌：1014d；好气性纤维素分解菌：1014d；6.结果观察亚硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。硝酸细菌：取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。反硝化细菌：加入格利斯亚