宏基因组上机操作手册.doc

目录0. 准备工作21. 宏基因组比对22. 宏基因组组装32.1 组装软件：SOAPdenovo32.2 组装软件：Meta-Velvet63 基因预测64 构建基因集70. 准备工作上机步骤如下：mkdir /Metagenome#新建工作目录cd /Metagenome#进入工作目录cp -R /RealBio_Train/Metagenome/01_clean_reads ./#拷贝数据1. 宏基因组比对宏基因组的序列可以通过SOAPaligner比对软件，比对上目标基因组，从而进行物种注释或计算物种丰度。SOAPaligner需要先对目标基因组进行建库，建库命令如下：2bwt-builder SOAPaligner用法：soap a -b -D -o -2 -m -x 其他重要参数：OptionType Content-rINT匹配到多处时的策略：0：不显示；1：随机显示一个；2：全部-MINT匹配模式：0：只允许完全匹配；1：允许一个错配；2：允许两个错配；4：最佳匹配-pINT程序运行的线程个数上机内容为：将拷贝得到的reads比对上微生物的基因组。上机步骤如下：cd /Metagenome#先进入个人目录下的工作目录mkdir 02_alignment#新建02_alignment目录cd 02_alignment#进入比对目录cp /RealBio_Train/Metagenome/02_aligner/soapaligner.sh ./#拷贝比对脚本less test01.pm#查看比对结果less test01.sm#查看比对结果2. 宏基因组组装基因组组装是指将测序仪产出的大量的DNA片段（Reads）拼接成原始的待测物种的染色体序列，可以类比为拼图游戏。本手册指导你如何使用SOAPdenovo（2.04）组装软件对鸟枪法测序数据进行组装。2.1 组装软件：SOAPdenovoSOAPdenovo的功能是对二代测序数据进行从头组装。使用SOAPdenovo前首先要清楚的是它的组装配置文件，该文件包含以下信息：Option Content全局配置max_rd_len记录输入数据的最大读长，并根据这个配置输入缓存大小。文库配置，每个文库需要以LIB表明avg_ins记录当前文库插入片段大小。asm_flags用来配置流程中哪些步骤用到当前文库数据：1，表示当前文库只在构建contig时用到；2，表示当前文库只在构建scaffold时用到；3，表示当前文库在构建contig与scaffold时都用到。rank配置构建scaffold时当前文库的使用优先级，由于单端的reads不用于构建scaffold，该文库不用设置rank参数。q1/q2，q配置当前文库数据路径，q1/q2用于配置双端的reads，q用于配置单端的reads本次上机使用到的完整的配置文件内容如下：配置文件完成后，即可开始进行组装。组装分四步骤操作。四个步骤分别是：1. pregraph，De Bruijn图构建。输入组装配置文件，输出图信息文件，主要参数如下：OptionType Content-sCONFIG指定组装配置文件-oPREFIX指定输出文件的前缀，由用户随意设定-pINT指定使用的线程数目。SOAPdenovo使用了多线程技术以充分利用计算机资源，一般取运行机子的cpu核心数目即可，如你的机器是双核一个cpu的，那么可指定为2-KINT指定需要构建De Bruijn图的kmer大小，应根据SOAPdenovo的版本设定。如使用31mer版本，则可取kmer为31，29，27等-dINT指定构建完De Bruijn图后，需要对深度小于多少的kmer进行过滤，一般设置为12. 构建contig。输入上一步骤产生的图文件，输出contig序列文件，主要参数如下：OptionType Content-gPREFIX输入图文件前缀，应该与上面步骤中的-o参数一致-DINT设定在进行构建contig时，需要对深度低于该设定参数的contig连接边进行过滤。默认取值为1-MINT设定在进行构建contig时，可以先对相似的序列进行合并，参数最大取值为3，表示最大程度合并相似序列；最小取值为0，表示不对相似序列进行合并。这里取经验值2-R选择是否利用reads的相邻kmer信息解决短重复序列，一般选择利用3.测序数据map回contig序列。在搭建scaffold前，需要先将输入数据比对回contig序列中，输出比对信息。SOAPdenovo在这一步中会将reads打碎成kmer，将一个个kmer比对回contig上，涉及到的参数有：OptionType Content-sSTR输入组装配置文件-gSTR输入De Bruijn图文件的前缀，应该与上面步骤1中的-o参数一致-pINT指定多线程运行使用的cpu个数4.搭建scaffold。输入上步产生的contig文件和原始数据的比对信息文件，SOAPdenovo将根据比对的pair关系信息，搭建scaffold，主要参数有：OptionType Content-gSTR输入De Bruijn图文件的前缀，应该与上面步骤1中的-o参数一致-F可选参数选择是否在搭建完scaffold后对其进行补洞。SOAPdenovo内置有补洞流程，主要思路是把落在内洞中的reads进行局部组装，把装好的序列嵌入到内洞中去，完成补洞工作-u可选参数选择是否需要对高深度的contig进行屏蔽后再搭建scaffold。SOAPdenovo默认会对高深度的contig进行屏蔽，以减少重复序列的影响，选择此参数，将不对高深度的contig进行屏蔽-L INT，可选参数选择选取多长以上的contig进行scaffold搭建。SOAPdenovo默认选取kmer+2上机内容为：将上一步得到的clean reads进行SOAPdenovo组装，得到contig。上机操作的步骤如下：cd /Metagenome#先进入个人目录下的工作目录mkdir 03_assembly#新建03_Assembly 目录cd 03_assembly#进入组装目录mkdir CFGcp /RealBio_Train/Metagenome/03_assembly/CFG/test01.cfg CFG/ #拷贝 组装的config文件到当前目录mkdir shell#新建脚本目录cp /RealBio_Train/Metagenome/03_assembly/shell/test01_Kmer31.sh shell/#拷贝组装脚本到脚本目录mkdir assemble#新建结果目录mkdir assemble/test01sh shell/test01_Kmer31.sh#运行组装脚本less assemble/test01/test01.scafSeq#查看组装结果ss.o assemble/test01/test01.scafSeq#查看组装统计结果模仿CFG/test01.cfg，生成test02文件的config文件CFG/test02.cfg，插入片段长度为412；模仿shell/test01_Kmer31.sh，生成关于test02文件的组装脚本shell/test02_Kmer37.sh，kmer值设为37mkdir assemble/test02sh shell/test02_Kmer37.sh#运行组装脚本less assemble/test02/test02.scafSeq#查看组装结果ss.o assemble/tets02/test02.scafSeq#查看组装统计结果2.2 组装软件：Meta-VelvetMeta-Velvet是在原来基因组组装软件Velvet基础上改进的，适合宏基因组数据的组装软件。主要参数如下：OptionType Content-cov_cutoffINT or autoDe Bruijn图中节点过滤参数，节点层数小于该参数即被过滤-ins_lengthINT插入片段长度，reads长度加上gaps长度-exp_covINT or auto基因组覆盖层数，这里选auto上机内容为：将上一步得到的test03样品的clean reads进行SOAPdenovo组装，得到contig。上机操作的步骤如下：cd /Metagenome#先进入个人目录下的工作目录cd 03_assembly#进入组装目录cp /RealBio_Train/Metagenome/03_assembly/shell/test03_Kmer31.sh shell/#拷贝组装脚本到脚本目录mkdir assemble/test03sh shell/test03_Kmer31.sh#运行脚本less assemble/test03/meta-velvetg.contigs.fa#查看组装结果ss.o assemble/test03/meta-velvetg.contigs.fa#查看统计结果3 基因预测宏基因组一般使用MetaGeneMark预测contig中的cds（coding sequence）序列。OptionType Content-a输出基因碱基序列-d输出基因蛋白序列-f可选参数选择输出格式：L为lst文件，G为gff文件，一般使用gff文件作为输出格式-k利用RBS序列预测基因起始位点-r输出RBS序列的打分与间隔序列上机内容为：将上一步得到的clean reads进行SOAPdenovo组装，得到contig。上机操作的步骤如下：cd /Metagenome#先进入个人目录下的工作目录mkdir 04_gene_predict#新建04_Gene_predict目录cd 04_gene_predict#进入基因预测目录cat .03-assembly/assemble/test01.tst01.scafSeq contig.fa #将上步得到的3个文件的contig文件写入04_gene_predict/contig.faperl filter.pl contig.fa contig.filter.fa#过滤500bp以下的contigcp /RealBio_Train/Metagenome/04_gene_prediction/gene_prediction.sh /Metagenome/04_gene_predict#拷贝基因预测脚本cp /RealBio_Train/soft/metagenemark/MetaGeneMark_linux_64/mgm/gm_key /.gm_key#拷贝权限sh /Metagenome/04_gene_predict/gene_prediction.sh#运行脚本less /Metagenome/04_gene_predict/gene.gff#查看gff文件ss.o /Metagenome/04_gene_predict/gene.cds 100#查看统计信息4 构建基因集宏基因组研究未知菌的方法大多通过基因集，相当于环境中微生物基因的集合。通过预测出来的基因，其中有一部分是序列相近或完全相同的。这里需要进行去冗余的步骤，所用到的软件为CD-HIT。CD-HIT是根据序列相似性，将序列进行聚类的软件。OptionType Content-cDOUBLE配合-G 0，配置identity参数，即完全匹配的碱基数与匹配上的碱基数的比值-aSDOUBLE配置coverage参数，即匹配上的碱基数与较短的基因碱基数的比值上机内容为：将之前得到的基因序列合并，并去冗余，得到非冗余的基因集。上机操作的步骤如下：cd /Metagenome#先进入个人目录下的工作目录mkdir 05_gene_catalog#新建05_Gene_catalog 目录cd 05_gene_catal