第八讲 细胞培养

植物组织培养 第6章细胞培养 2 本章主要内容 第6章细胞培养 单细胞培养 细胞悬浮培养 3 1 掌握获得单细胞无性系的操作技术2 掌握细胞培养的方法 其含义及特点3 了解影响单细胞培养的因子4 掌握细胞悬浮培养的方法 成批培养 连续培养 5 理解细胞悬浮培养的应用 第6章细胞培养 本章教学目的与要求 4 概念及应用 细胞培养 单细胞培养是指将植物单细胞或细胞团直接在培养基中进行培养一种培养方式 操作简单 重复性好 群体大 用途 广泛用于细胞学基础研究 突变体筛选 遗传转化 有用化合物的筛选等诸多方面 5 第一节单细胞培养 分离的单细胞 看护培养微室培养平板培养 单细胞无性系 细胞培养 6 一 单细胞的分离 机械法 碾碎 过滤 离心 酶解法 用纤维素酶和果胶酸酶从组织分离 愈伤组织分离单细胞 7 机械法 材料 薄壁组织排列松散 细胞间连接不紧密 接触点少的材料才能采用此法 如叶肉组织 方法 用研钵 匀浆管 研碎 过滤 低速离心 优点 细胞不受酶的伤害 缺点 材料受限 效率低下 适用于生理生化理论研究 不能用于大规模生产 8 酶解法 是通过叶肉组织获得大量单细胞的好方法 常用果胶酶 方法 灭菌 去下表皮 剪成小块 加入酶液中 其中含有渗透保护剂 真空泵抽气 置摇床上震荡 期间换数次酶液 获取细胞 用培养基洗涤单细胞 培养 不足 禾本科植物用此法难以获得单细胞 9 二 单细胞培养方法 Singlecellculture 第一节单细胞培养 10 单细胞培养常用的方法 第一节单细胞培养 11 一 看护培养法 Nurseculture 用途 诱导形成单细胞无性系 第一节单细胞培养 含义 指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞 并使其生长和增殖的方法 1看护培养的含义及用途 12 看护培养图示 单细胞无性系 恒温培养1个月 2 3月 用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞 并使其生长和增殖 这个愈伤组织块称为看护愈伤组织 第一节单细胞培养 13 另一种看护培养法 愈伤组织 单细胞 单细胞 愈伤组织 愈伤组织 14 2 看护培养基本技术 1 在一个培养瓶中加入一定厚度的固体培养基 灭菌后备用 2 在无菌条件下 将一小块 1cm3 活跃生长的愈伤组织接种到培养基上 再在愈伤组织块上放一片 1cm 已灭菌的滤纸 放置一晚上 3 将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上 4 恒温培养 第一节单细胞培养 15 优点 1 简便易行 2 效果好 易于成功 缺点 1 不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程 第一节单细胞培养 3 看护培养特点 16 含义及用途 用途 主要用来观察细胞生长 分裂 形成细胞团的过程 二 微室培养法 Microculture 第一节单细胞培养 含义 将单细胞培养在少量的培养基中 17 微室培养图示 第一节单细胞培养 平视图 18 第一节单细胞培养 2微室培养特点 优点 1 在培养过程中 可以连续进行显微观察一个细胞的生长 分裂和形成细胞团的全部过程 材料很少或需要观察时采用 缺点 培养基少 培养时间较短 19 三 平板培养法 PlanteCulture 1含义及用途 第一节单细胞培养 含义 将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法 用途 分离单细胞无性系 研究其生理 生化 遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术 广泛应用于细胞 原生质体及融合产物的培养 20 2特点 第一节单细胞培养 固体平板培养图示 优点 1 可以定点观察 2 分离单细胞系容易 缺点 培养细胞气体交换不畅 21 1 悬浮细胞密度的调制平板培养要求最初细胞密度 即初始植板密度 为1 103 1 105个 ml 第一节单细胞培养 3平板培养的基本技术 初始植板密度 单细胞固体平板培养时 细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度 22 1 4 琼脂基本培养基 等量细胞培养液 0 7 琼脂条件培养基 条件培养基 曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基 第一节单细胞培养 2 培养基配制 23 第一节单细胞培养 植板效率 或植板率 已形成细胞团的百分数 即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团 4 培养 26 置暗处培养21天 低倍显微镜观察 记数单细胞或小细胞团 计算置板效率 也称植板率 3 制平板 细胞悬浮液与融化状态 35 条件培养基按一定比例均匀混合 倒成平板 24 第二节 细胞悬浮培养Suspensionculture 含义及特点 2 特点1 细胞可不断增殖 形成高密度的细胞群体 适于大规模培养 2 能够提供大量较为均匀的细胞 为研究细胞的生长 分化创造方法和条件 第6章细胞培养 1 含义 将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养 25 一 悬浮培养类型和方法 第二节细胞悬浮培养 分批培养 连续培养 26 一 成批培养 分批培养 Batchculture 含义 将单细胞或细胞团培养在一定容积的密闭容器中进行培养 目的是获得单细胞培养物 它是进行细胞生长 分裂的生理生化及突变 遗传研究常用的培养方法 常用100 250ml锥形瓶培养 第二节细胞悬浮培养 27 分散细胞的方法 选用松散易碎的最初培养材料 愈伤组织 手工压碎培养基中加入2 4 D 果胶酶 纤维素酶等 28 1 成批培养特点 第二节细胞悬浮培养 1 培养基体积固定 2 必须适当搅拌 3 培养过程中 细胞生长 其数目不断发生变化 呈S增长 4 如要进行下一批培养 生长一定时间后 需要继代转移 29 第二节细胞悬浮培养 细胞生长曲线 30 2 成批培养的方法 1 旋转培养 2 往返震荡培养 3 旋转震荡培养 4 搅动培养 第二节细胞悬浮培养 31 二 连续培养 Continuousculture 含义 指在培养过程中 以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基 使培养物不断得到养分补充 保持其恒定体积的培养 第二节细胞悬浮培养 32 1 连续培养的特点 1 新鲜培养基的不断加入 保证了养分的充分供应 2 可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中 3 适于大规模工业化生产及研究各营养物的影响 确定限制因子 第二节细胞悬浮培养 33 1 半连续培养 每隔一定时间倒出一定量的悬浮液 同时补充加入等量的新鲜培养液 并把细胞收集后转入新培养基 2 连续培养 加入和流出的培养基速度相同 通过调节速度 可以使细胞生长速度维持在接近最高速度水平 可以通过调节某限制因子浓度或细胞浓度来实现 第二节细胞悬浮培养 2 连续培养的种类 34 加入培养基 排出培养基及其培养物 第二节细胞悬浮培养 连续培养图示 35 三 细胞悬浮培养主要应用 1 植物有用物质的生产2 诱发和筛选突变体3 原生质体培养和细胞分离4 食品生产 第二节细胞悬浮培养 36 1 单细胞的分离方法 1 愈伤组织诱导 2 单细胞悬浮液的制备2 单细胞培养的方法 1 看护培养法 2 微室培养法 3 平板培养法3 平板培养的基本技术 1 单细胞悬浮液的制备 2 悬浮细胞密度的调制 3 琼脂培养基配制 0 7 琼脂条件培养基 4 平板制作 5 培养 第6章细胞培养 本章小结 37 4 影响单细胞培养的因子 1 条件培养基 2 初始细胞植板密度 临界密度 3 生长物质 4 pH