促甲状腺素检测系统分析灵敏度的验证

促甲状腺素检测系统分析灵敏度的验证执笔人：陈政君指导老师：冯仁丰、顾志冬 瑞金临床医学院摘要：目的：对Beckman Dxi800系统TSH项目的检测低限、功能灵敏度等分析性能的验证。方法：对血清空白、系列低浓度的TSH样品进行批内重复性实验、天间重现性实验，统计确定这些性能。结果：该系统的TSH检测低限为0.003 mIU/L，功能灵敏度为0.005 mIU/L。与Beckman的产品说明书的指标有差异。结论：为了使实验室对甲状腺患者提供可靠的TSH低值结果，实验室必须自己建立适合本实验室条件的可报告低限。关键词：TSH 、检测系统、检测低限、功能灵敏度、前言甲状腺疾病是目前最为常见的内分泌紊乱疾病之一。其发病过程通常缓慢而不易被察觉，症状常被患者疏忽，当出现明显的疾病症状时，后果十分严重。因此采用敏感、特异的检验项目，准确、可靠地为临床提供检验结果，是实验室的责任。促甲状腺素（TSH）的检测相对于FT4检测来说，对甲状腺功能紊乱更具有特异性。临床上通常使用TSH检测项目来筛选疑似患者。出现TSH异常的患者，FT4才是之后最重要的测定项目。TSH在血清中的含量很低，真实反映TSH的低值是内分泌临床、与众多公司努力的方向。目前，各大厂商所建立的检测系统的灵敏度均号称达到了10-3 mIU/L的水平。按照质量管理要求，在实验室开始对患者标本进行检测、报告结果前，应对引进的检测系统进行必要的性能确认。因此，我们这次短暂的实验，就是对瑞金医院检验科近日使用的Beckman Dxi800型系统，进行分析灵敏度（检测低限与功能灵敏度）的系列实验。以期为该实验室建立TSH必须的可报告定性与定量低限。一 材料和方法1检测系统：Beckman Dxi800免疫测定检测系统。使用双夹心酶免化学发光方法。试剂为该系统的专用的人促甲状腺素（hTSH）检测试剂，包括专用的hTSH校准品。所有检测过程完全按照系统规定程序进行校准、质量控制、以及对样品等进行检测。每次检测前，首先作校准。系统校准认可后，进行质量控制检测。控制值在控，说明检测结果有效。收集在控的检测数据。该系统的检测原理是：在标记了碱性磷酸酶的羊抗hTSH抗体（酶结合物）、包被了羊抗大鼠抗体-大鼠抗hTSH抗体复合物的磁性颗粒存在下，样品中的hTSH两个位点与两个抗hTSH抗体同时结合，形成了酶标的双夹心（抗体-抗原-抗体）磁性颗粒复合物。经磁性作用，将所有磁性颗粒分离、清洗后，加入碱性磷酸酶的发光底物（Lumi-Phos* 530）。检测反应产生的发光化学物的相对发光单位（RLU），在校准曲线上确定样品中的hTSH含量。2实验用的样品准备：（1）空白样品：参照Beckman 产品说明书，配制30g/L的牛血清白蛋白（BSA）溶液为hTSH空白样品。原料来自SIGMA公司的牛血清白蛋白干粉（BSA）。在该溶液中加入0.1叠氮钠防腐。置冰箱保存，备用。（2）系列低浓度hTSH溶液：将Beckman的hTHS 100 mIU/L校准液，用上述配制的空白样品液进行稀释。限于稀释条件，对该稀释溶液内的实际hTSH含量，由Beckman Dxi800免疫测定检测系统检测确定。经测定为hTSH 1.29 mIU/L。然后，再从该溶液作进一步的稀释，形成系列低浓度的hTSH溶液。它们的hTSH含量分别是：0.003、0.006、0.013、0.026、0.052、0.077、0.103，0.129 mIU/L。各个溶液在实验时的编号分别依次为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8，空白样品编号为S0。所有溶液为8 ml，足够进行多天实验。置冰箱保存备用。 3实验方法：（1）定性检测低限的实验方案：按照文献1要求，对空白样品进行批内重复测定。记录仪器上的检测发光强度原始值（RLU）。对数据作均值、中位数、标准差等处理。以2.58倍的标准差对应的发光强度，在系列低浓度曲线上确定检测低限。我们考虑到批内重复检测的结果，也许与实际每天检测状况不同，因此，也采用以下的天间重复检测结果，另外确定检测低限。（2）定量的功能灵敏度的实验方案：按照文献1、2要求，对系列低浓度样品在每天的上下午（相隔4小时以上）分别进行检测。共进行了10天、20批的检测。记录检测的发光强度原始值（RLU）。对数据作均值、中位数、标准差、CV等处理。（3）绘制hTSH低浓度与发光强度关系的校准曲线。以系列溶液的稀释比例关系，确定各个溶液内hTSH的预期浓度。以该浓度为X，各个溶液检测信号读数均值减去天间S0均值所得差的值为Y，绘制校准曲线。若各个溶液检测结果呈非正态分布，则以各溶液检测信号读数扣除天间S0中位数所得差值的中位数为Y，再和hTSH浓度为X绘制标准曲线。（4）在校准曲线上，确定2.58倍空白溶液标准差相当的hTSH浓度。确定为99可能性的检测低限。（5）以各个溶液的TSH预期浓度为X，各个溶液的天间重复CV为Y，绘制浓度与CV关系的曲线。从曲线上查阅相当于CV为20的对应hTSH浓度，即为功能灵敏度限值。二 结果1空白溶液批内重复结果：空白均数13037.20，标准差SD批内144.62，CV批内1.11。210天、20批低hTSH结果的统计，见表1。表1：各低浓度hTSH溶液10天、20批重复检测结果的归纳样品号预期hTS浓度（mIU/L）发光强度范围（RLU）中位数（RLU）均值（RLU）标准差（RLU）S0011967135511265812768.0484.1S10.00313144144831375113810.8383.1S20.006148121598815260.515307.6379.8S30.013171532067218223.518203.3682.6S40.026219772393722788.522993.0566.2S50.05230691340873264332636.1644.1S60.07740253461384231642695.6813.9S70.103489415449852092.552204.91094.6S80.129605406838263004.563740.91549.9 注：仪器检测的发光强度单位为相对发光单位（RLU）。通过EXCEL2003和SPSS11.0软件计算，这九份样品天间数据基本属于正态分布，可以直接使用均值与标准差反映数据分布状况。3定性的检测低限的确定。（1）依据实验批内重复检测的结果，我们以99的可能性作为确定性限值的标准。因此，每次实验仅做一次空白时，出现较空白均值大的99可能性的空白值，应为2.58S空白。为：373.1 RLU。从hTSH浓度与RLU关系上（图1）可以确定：以批内重复方式确定的hTSH定性检测低限为：0.001 mIU/L。（2）在实验中，同一空白溶液的10天、20批重复的均值为：12768.0 RLU，标准差为：484.1 RLU。它的CV为3.80。空白溶液批内的10次重复CV为1.11 ，较天间的CV要小得多。由于实际检验工作是每天进行的，最好的估计空白变异应是天间与批间的综合。所以，若以本实验中综合的标准差484.1 RLU去估计hTSH定性检测低限的99限值为：0.00288 mIU/L，约为0.003 mIU/L。以各样品的hTSH预期浓度为X、以RLU均值为Y，绘制hTSH在Beckman Dxi800系统上的校准曲线，见图1。图1：低hTSH浓度与发光强度（RLU）半对数校准曲线注：X为hTSH浓度；y为发光RLU值。4定量可报告低限的确定将表1的所有各个浓度的RLU均值，减去S0的均值，为含有相应hTSH量，在系统中相对于空白溶液的基础读数实际具有的检测发光量值。将这些量值与原标准差求出各自对应的CV。所有结果见表2。表2：各hTSH低浓度的检测均值（扣除空白后）、CV值表样品号S1S2S3S4S5S6S7S8hTSH（mIU/L）0.0030.0060.0130.0260.0520.0770.1030.129均值（RLU）1043.82539.65435.310225.019868.129927.639436.950972.9SD（RLU）383.1379.8682.6566.2644.1813.91094.61549.9CV（）36.7%15.0%12.6%5.5%3.2%2.7%2.8%3.0%以各样品的hTSH预期浓度为X、以RLU的CV为Y，绘制hTSH在Beckman Dxi800系统上低浓度与重复变异程度的关系。见图2。在图2上，可以确定，当CV为20时，对应的hTSH浓度为：0.00535mIU/L mIU/L，约为：0.005 mIU/L。这即为本系统的功能灵敏度，也是系统可以报告定量结果的低限值。图2：hTSH在Beckman Dxi800系统上低浓度与重复变异程度的关系注：图的X为hTSH浓度（mIU/L；Y为重复CV（）。三 讨论：1准确报告hTSH检测结果的最低限值，一直是内分泌临床与有关厂商关注的热点。早于1989年，著名的内分泌专家Spencer4,5首先提出了以天间重复CV为20时，对应hTSH的浓度为实验方法可以报告的最低量值，称之为功能灵敏度。自此以后，由于该做法的可操作性，很快在厂商中广泛应用。最近，美国的国家临床标准研究院（NICS，前身为NCCLS）发布了EP-17的标准化文件3。该文件首次在国际上提出确定空白低限（LOB）、检测低限（LOD）、以及量值低限（LOQ）的定义和实验方案。我们认为，这个文件在理论上可行，在具体实施中，对于如何确定量值低限上，却难以操作。文件中的LOB就是我们现在实验的检测低限；LOD就是文献1中论述的生物检测限。因此，本次实验限于时间有限、大量低浓度标本收集困难、以及尚未彻底了解文件的统计做法等的局限，没有按照NICS的标准化文件要求实施。还是采用了文献1的做法，确定Beckman Dxi800系统对hTSH检测的检测低限与功能灵敏度。2 实验的时间紧凑，但是又要较好地体现实际和客观的状况，采取进行10天、20批实验的综合方案。这样的做法，均较以往报道的要求全面。以综合实验得到的天间、批间的空白溶液变异，确定99的定性检测低限，可以如实反映瑞金实验室条件下，每天实验的空白波动实际情况。该值约为0.003 mIU/L，与Beckman公司报告的可报告定量低限数值相符；但是在概念上是完全不同的。定性低限是因空白波动导致低于这样量值的hTSH样品，无法被定性确认，样品中确实含有hTSH。定量低限是：除了空白波动外，样品单次检测的信号可以有99的可能性一定为可检测信号，予以定量的最低值。初步实验结果表明，由实验室对诸如hTSH重要项目自行确定限值的意义。4实验结果的功能灵敏度为：0.005mIU/L。即：今后瑞金实验室报告hTSH定量结果的最低限值不得低于该值。报告的定量值不可从0开始。今后在具体使用时建议：可报告范围只说明可报告的上限；定量低限是报告定量结果的最低值；介于定性与定量低限间的结果不可报告具体量值，只说明可检出；不可将定性限值作为定量报告的低限。尤其在参加国际或国家的实验室间质量评估中，对于低于功能灵敏度的报告，只能报告无法检测具体量值。 5美国的临床实验室管理法规要求实验室对于新引入的免疫检测系统，除了进行精密度、准确度、可报告范围等性能的确认外，还应对如hTSH项目增加分析灵敏度性能的确认。所有一切都是为了确保每个患者检测结果的可靠。本实验是对于分析灵敏度中确定两个重要性能指标（检测低限、功能灵敏度）的实践。由于在领会文件与文献的意义上不深、在真正参与检验实践上缺少锻炼，所以，还应在以后的学习与实验中继续努力。四 参考文献1 冯仁丰，分析灵敏度（检测限）。临床检验质量管理技术基础。第1版 上海科技技术文献出版社，2003.72 方积乾，孙振球。卫生统计学。第5版 人民卫生出版社，2003.83 Protocol for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation。NCCLS Document EP-17A。Wayne,PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards,2004。4 Spencer CA。Thyroid profiling for the 1990s：free T4 estimate or sensitive TSH m