泡菜中耐盐细菌的16SRRNA基因序列分析

西华大学毕业论文 毕 业 论 文题 目: 泡菜中耐盐细菌的16S RRNA基因序列分析 学院(直属系): 生物工程学院 年级、专业 : 2007级生物工程专业 学 生 姓 名: 谢 恩 学 号: 1105 指 导 教 师: 向文良 完 成 时 间: 2011年6月10日 目 录目 录2摘 要4Abstract5英文缩略语61.文献综述71.2微生物简介81.3传统方法在微生物多样性研究中的应用81.3分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用91.4乳酸菌与泡菜101.5乳酸菌在泡菜生产中的作用101.5.1改善泡菜的风味101.5.2提高泡菜的营养价值101.5.3延长泡菜的保质期111.6泡菜中常见乳酸菌111.6.1 乳杆菌属111.6.2链球菌属121.6.3肠球菌属121.6.4乳球菌属121.6.5片球菌属121.6.6明串株菌属131.7晌乳酸菌生长的因素131.7.1 氧气131.7.2温度131.7.3 pH141.7.4渗透压141.8适用于乳酸菌鉴定的方法141.8.1 形态特征和生理生化特性分析141.8.2分子生物学鉴定152材料和方法152.1材料152.1.1 供试样品从152.1.2样品采集152.1.3仪器设备与试剂152.1.4培养基173 耐盐菌16S rDNA文库的建立及ARDRA分析173.1 实验室分离纯化菌落173.2 提取DNA173.3用PCR反应扩增16S DNA183.4用凝胶电泳检验16S rRNA是否扩增193.5对扩增后的16S rDNA纯化193.6 16S rDNA 文库的建立193.7 ARDRA分析204 结论215总结与体会226致谢词23【参考文献】24摘 要泡菜最早始于中国，是入们喜爱的佐餐食品，它是利用蔬菜上附着的乳酸菌自然发酵而成。研究表明，乳酸菌能够消耗亚硝酸盐，产生细菌素，积累维生素、有机酸等，并且赋予泡菜特别的风味。乳酸菌是泡菜生产过程中的一个主要菌群，在整个发酵过程中起着积极的作用，加强对其生物多样性的了解，对于开发泡菜中的优良乳酸菌资源具有重要的意义。研究16S rRNA基因序列分析泡菜中乳酸菌的多样性。 分子生物学方法近年来己被广泛应用于微生物多样性的研究中，也越来越多地应用予食品微生态的研究。 在今后的研究中，有必要利用多种分子生物学技术来检测特定环境中可能具有的微生物多样性，将经典微生物学方法与免培养方法结合起来，进行综合分析。只有这样，才能更全面、充分地认识微生物天然存在的状况。【关键词】：泡菜；多样性； 乳酸菌ABSTRACTPickles may origin from ancient ChinaThis traditional food is based onnatural fermentation carried out by the epiphytic lactic acid bacteria(LAB) from the vegetables that were used for raw materials of pickles LAB plays an important role in the production of picklesLAB can produce organic acids，bacteriocin，vitamins，and other nutrients，consume nitrite，and give a special flavor to picklesLactic acid bacteria(LAB)aie the dominant microorganisms in the fermented vegetable since they paly an active role in the whole fermentationStudying on the biodiversity Can help to exploit the LAB resource，it will work well in the practically application1he aim of this study WaS to investigate the biodiversity of lactic acid bacteria in the traditional fermented vegetable by 1 6 S rRNA gene sequencingMolecular biological methods were widely used to study the microbial diversity，and introduced into the research on food microecology in recent years。It suggested thatwe should apply different molecular approaches and the combination of culturedependant and culture-independent methods in the analysis of microbial diversity，so we can assess the microbial diversity more adequately and objectivelyKey Words：pickles；biodiversity； lactic acid bacteria缩 略 词缩写 英文全名 中文名CTAB Cetyltrimethylammonium bromide 十六烷基三甲基溴化铵 EDTA Ethlenediaminetetraacetic 乙二胺四乙酸 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 dNTP Deoxynucleoside triphosphate 脱氧核苷三磷酸 Sec Second 秒Mln minute 分钟Ml milliliter 毫升Ep eppendorf 离心管 1.文献综述乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)产大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，其种类多、资源丰富，并广泛应用于工、农、医、食品、饲料和化工等方面1。乳酸菌在自然界分布广泛，是生物圈的重要组成部分，且具有特殊的生理活性和营养价值，乳酸菌的分离、特性和应用研究受到日益重视。近年来乳酸菌发酵制品越来越受到大家的欢迎，特别是通过乳酸菌发酵得到的蔬菜加工品泡菜。蔬菜表面通常附生有细菌、酵母菌和霉菌等多种微生物，在泡菜的制作过程中乳酸菌最终成为优势菌，其代谢产物和低氧份的环境抑制了食品腐败菌的生长，从而保障了食品的品质和风味。为了更全面的认识和研究泡菜中的乳酸菌，不仅必需了解乳酸菌发酵泡菜的机理，更要加强对泡菜中乳酸菌群的结构和多样性的了解，这对于开发泡菜中优良乳酸菌资源，揭示乳酸菌群结构与功能的联系，指导乳酸菌群落功能的定向调控具有重要意义2。1.1微生物简介微生物是一类丰富的生物资源，种类繁多，数量巨大，包括了从原核生物到真核生物的不同类群：如细菌、真菌、放线菌、原生动物、部分藻类和病毒。微生物作为地球生态系统中重要的一员，其多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供大量多种珍贵资源方面起着重要的作用，它们的价值是无法估量的。微生物的多样性是指在一个集合群落中，众多不同类型微生物的变化及它们之间相对的丰度。对微生物多样性的研究不仅将极大地推动生命科学的发展，也将有利于发现新的有用微生物资源，进一步造福人类。与宏观生物不同的是，由于微生物本身所具有的个体微小、形态结构简单等特点，致使微生物的多样性在形态和分化上表现并不突出，而主要表现在物种和基因水平上，因此要对自然环境中的微生物多样性有一个客观的认识是一个非常艰巨的任务。对微生物资源的认识、保护是整个生物圈保护中必不可少的内容，所以人们一直在努力探索研究、开发微生物资源，以期更加客观、真实地认识它们，从而更好应用微生物为人类造福。近年来，对微生物多样性的研究闩益受到人们的重视。研究微生物生态学有两个主要的趋向：一是利用各种分子生物学技术或与传统方法的结合，以期更客观地认识研究环境中微生物的丰度、均度等自然存在状况：二是加强对极端环境微生物的研究，以期发现新的特殊的微生物资源，了解其适应极端环境的机制。1.2传统方法在微生物多样性研究中的应用 传统的研究方法是首先从特定自然生境(如土壤、水)中取样，采用模拟自然生境的各种培养基和条件进行分离培养，通过纯培养获得菌株后，再对其表型特征、细胞的性质(形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察)进行观察收集，能对其特性进行描述，这种方法又被称作经典方法。经典方法需要进行一系列繁杂的形态特征和生理生化实验，相关的实验做得越多，得到的结果就更可靠一些。它最大的缺点是，即使最复杂的实验组合也不能对分离物进行精确的鉴定，而且不能揭示分离物间的系统发育关系。对乳酸菌而言，应用经典方法对其进行准确鉴定非常困难，因为不同的种在适应某一环境后就有相应的新的营养要求3。人们不能利用传统的微生物技术获得微生物多样性的真正概貌，这首先在温泉、瘤胃和废水处理工厂4的微生态研究中得到证实，那里的许多微生物很难培养或者根本不能培养。Suau等(1999)的研究结果表明，人类肠道中6080的微生物在目前是不能培(unculturable)。实际上，我们已经知道，在自然环境中能够分离培养的微生物的数量还不到自然界微生物总数的1(Norman1996)，还有相当多的微生物因无法培养而未被认识。传统培养方法严重地限制了我们认识微生物的视野，由于缺乏再现环境条件的方法和培养基质，造成了大多数微生物难以被标准实验室方法复苏分离和培养。这对于人们确认识微生物资源，开发并利用这些资源造成了严重的障碍。因此，传统方法严重地制约了人们对微生物生态的认识。虽然传统的依靠培养的方法制约了人们对微生物生态的客观认识，并存在着研究周期较长等缺点。但是通过纯培养获得菌株后可以对其进行深入、全面的研究，最终确定其分类学地位并为人类所利用，此外还可以加强人们对微生物群落结构与功能的认识。因而在微生物学的研究中，经典的微生物技术仍然将是一个不可替代的方法。1.3分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用近十年来，分子生物学的发展使得我们可以摆脱依赖培养的传统方法的束缚，开辟了一条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路、新途径。Pace等(1986)首次将5S rRNA基因用于环境样品中总微生物的测定，随之很快被用于微生物多样性研究领域。由于5S rRNA基因相对较小(约120个核营酸)，携带信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。16SrRNA(约15kb)种类少，含量大(约占细菌RNA含量的80)，分子大小适中，存在于所有生物中，特别是其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。细菌的16S rRNA的可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，设计引物将16S rRNA基因扩增出来，利用可变区序列差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定，判定不同菌属、菌种的细菌的遗传关系远近，因而更适于微生物多样性的研究。目前，16S rRNA基因序列分析己广泛应用于微生物多样性的研究。比较微生物的相对进化关系，典型的方法是比较不同微生物的类似基因并计算它们碱基序列的不同，微生物间的碱基数相差越多，所比较微生物的进化关系越远，类似数据用于计算所比较微生物的进化距离并由此建立系统发生树或进化多样性图谱。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，DNA标记技术已成为探讨种群遗传变异的重要选择。主要包括限制性片段长度多态性(Restriction fragment tength polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性(Randomly amplifiedpolymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、末端限制性片段长度多念性(Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridizationFISH)等。 1.4乳酸菌与泡菜根据国际公认的分类系统伯杰氏系统，在伯杰氏系统细菌学手册第9版中，乳酸菌属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eubacteriales)中的乳酸细菌科(Lactobacillaceae)。60年代之前，乳酸菌主要按细菌的形态、培养条件、碳水化合物的利用、代谢产物等特性来进行分类；而60年代之后，很多研究采用了乳酸菌细胞DNA中(G+C)的百分含量的测定。到90年代，增加了脂类分析和醌类分析技术、16S rRNA基因序列分析和基因探针等进行测定和分类。核分子探针杂交技术和聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是乳酸菌目前分类和鉴定的最常用方法。自从1875年巴斯德发现乳酸菌以来，130多年来己发现的乳酸菌有43个属，包括373个种和亚种。而近年来，国内外对泡菜这一微生态系统进行了多方位的研究，利用不同的分析手段从各种泡菜样品中筛选出了许多具有优良性能的菌种，其中包括乳杆菌属(Lactobacillus)5-7、链球菌属(Streptococcus)8、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)9、片球菌属(Pediococcus)10、明串株菌属(Leuconostoc)11等1.5乳酸菌在泡菜生产中的作用15.1改善泡菜的风味首先乳酸菌经过发酵可以产生醋酸、丙酸等有机酸，它们赋予了制品独特的酸味，可以刺激人们的食欲。另外，这些有机酸可与乳酸菌或其他微生物发酵过程中产生的醇、醛、酮等物质相互作用，形成多种新的呈味物质具有芳香味的羧酸酯类，如乳酸与乙醇结合形成乳酸乙酯等，而这些呈味物质的产生就改善了制品风味12-13。15.2提高泡菜的营养价值当今用于乳酸发酵泡菜的乳酸菌一般不具有硝酸还原酶和氨基酸脱羧酶，因而不会使硝酸盐还原成亚硝酸盐，也不会产生胺，所以乳酸发酵蔬菜中一般不会产生亚硝酸胺。相反，乳酸菌分泌的肽酶可产生多种氨基酸，这些氨基酸既可以提高食品的鲜味也具有一定的营养价值。乳酸菌进入人体后参与调节人体肠道的微生态平衡，不仅可以利用代谢产物抑制有害菌群增长，还可促进有益菌群的增殖。另外，乳酸菌进入人体后可促进胃肠道蠕动，帮助消化，还能刺激肠道免疫细胞产生抗体，预防疾病153延长泡菜的保质期一方面，乳酸菌通过竞争氧气及养分来抑制其它微生物的生长。另一方面，乳酸菌在其代谢过程中，会产生一些具有抗菌活性的物质，如：有机酸、双乙酰、过氧化氢、二氧化碳等，这些物质可以抑制泡菜中一些腐败菌的生长，延长泡菜的保质期。更为重要的是很多乳酸菌都能产生细菌素，经研究表明这些物质在抑制病原菌上具有重要作用。而细菌素本身具有许多优良性质：易被人体消化道中的一些蛋白酶(如胰蛋白酶)所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，无副作用、无残留，同时也不污染环境；具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏：对制品的口感、口味等无不良影响，因而不仅适用于泡菜，更被广泛用作于食品添加剂14-16，如：nisin，plantaricin17-18，Sakacin等，其中研究较多的是nisin，nisin对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌活性，所以被作为硝酸盐的替代剂广泛的应用于食品的保鲜19，减少或避免了亚硝胺类物质对人体健康的威胁，同时又延长了食品的储藏期。16泡菜中常见乳酸菌161 乳杆菌属杆菌，细胞形态多样，一般不运动。以发酵代谢，专性的分解糖，在碳的终产物中至少50是乳酸。通常不发酵乳酸盐，副产物可能是乙醇、乙酸盐、琥珀酸盐、甲醇盐和C02，一般不会产生多于2个碳原子的挥发性酸。氧化酶阴性，几乎没有菌株以假接触酶分解过氧化物。接触酶阴性。罕见产色素者，如有色素一般是黄或橙色到锈红。通常不还原硝酸盐，只有pH值最终平衡在6O以上才会还原硝酸盐。不液化明胶，不产生吲哚和H2S。营养需求复杂，需要氨基酸、肽、核酸衍生物、脂肪酸、可发酵的碳水化合物和盐类等，般而言，每个种都有特殊的需求20.162链球菌属现包括在链球菌属的细菌经修改后已限定为无芽孢的化能异养菌，是类球或者球杆状的细胞，排列成链或成对，不生成芽孢。其中很少菌株可合成过氧化物酶。不能合成血红素，由此在联苯胺试验中是阴性21。发酵代谢过程中主要是产生乳酸，不产气，不能利用氧，但可在氧中生长，因而被认为是耐氧的厌氧菌。163肠球菌属肠球菌属最先由Schleifer和Kilpper-Balz在1984年提议的，多数成对排列或成短链，少数种有色素如E mundtii和E cassliflavus。化能异养菌，能量产生主要通过同型发酵乳酸的途径，利用碳水化合物发酵后的代谢产物主要是L(+)哥L酸。具有Lancefield D群抗原。一般能在lO和45下生长，在pH96、40胆汁同样可以生长，耐热，60。C处理30min仍可存活22。164乳球菌属卵圆形细胞，成对或成短链状。兼性厌氧菌，不运动，接触酶阴性，不产芽孢。化能异养菌，营养需求复杂。乳球菌一般能在4NaCI中生长，而乳酸乳球菌乳脂亚种例外，只能耐受2NaCI。通常能在10下生长，但不能再45中生长。165片球菌属细胞球形，在特定条件下，以直角的两个平面方向交替分裂形成四联状。化能异养菌，细胞生长需要含有复杂的生长因子和丰富氨基酸的培养基，都需要生物素、泛酸和烟酸，但不需要硫胺素。生长依赖于可发酵的碳水化合物，发酵葡萄糖产生DL或L(+)乳酸盐，产酸不产气。一般不酸化和凝固牛奶，不分解蛋白，不还原硝酸盐，不产吲哚。氧化酶阴性，接触酶也阴性。166明串株菌属(23)细胞常呈豆状，不运动，不产生芽孢，接触酶阴性，无细胞色素。化能有机营养，生长通常需要丰富的生长因子和氨基酸，所有的菌种都需要生物素、硫胺素和烟酸，不需要泛酸或泛酸的衍生物。最适生长温度一般为2030。均可发酵葡萄糖产酸产气，主要产物为D-(-)-乳酸、乙醇。不还原硝酸盐，精氨酸不水解，不酸化和凝固牛奶，不产生吲哚23。1.7晌乳酸菌生长的因素1.71 氧气由于乳酸菌种类繁多，因此不同的菌对氧气的需求也不尽相同。但各种乳酸菌通常以发酵方式代谢产能，且因普遍缺乏好氧的呼吸链酶，在与游离氧的关系上，一般是一些耐氧性厌氧菌、微好氧菌、兼性厌氧菌或是专性厌氧菌。如乳杆菌属的菌种一般都是耐氧性厌氧菌，但有少数的是微好氧，当培养时充以510的C02或降低氧压可促进其生长24；链球菌属、乳球菌属、片球菌属、肠球菌属等都是兼性厌氧菌；双歧杆菌属则为专性厌氧菌。氧气与培养液中的pH值，对乳酸的产量有一定的影响25。在厌氧条件下，连续培养保加利亚乳杆菌，培养液的pH则由酸性变为碱性，同时原来的同型乳酸发酵也会转化为异型乳酸发酵，乳酸的产量也相应减少。1.72温度一系列的生物化学反应组成了各种微生物的正常生命活动，温度对这些生命活动的影响极其明显。乳杆菌属一般生长温度范围为253，最适生长温度在3040之间，如短杆菌最适生长温度一般为35，但其中发酵乳杆菌一般在15不生长，而植物乳杆菌在45也不生长26：片球菌属最适生长温度通常为25-45一般培养温度为37；链球菌属生长温度范围为2545 oct50J，一般最适生长温度为37；乳球菌属的最适生长温度为30，可以在10下生长，但不能在45下生长；肠球菌属最适生长温度为37，能在lO45下生长。1.73 pH乳酸菌通常以乳酸为唯一或主要代谢产物，所以它们对酸性环境十分适应，乳酸菌的几个主要属的生长pH如下：乳杆菌属最适pH为5562，pH为90的时候不能生长，一旦接种到初始pH为中性或碱性的培养基中时，生长速度明显很低：明串珠菌属一般生长pH范围在5O以上，一般在pH45可以生长27，在pH为96时不能生长；肠球菌属的生长pH范围比较广，在中性和碱性条件下生长较好，可以在pH为96下生存；链球菌属生长pH范围也较广，一般还可以生长在pH为96下。1.74渗透压不同乳酸菌对渗透压的适应能力有较大差别，例如大多数的乳球菌属只可以在4NaCl中生长，也有研究证明在6NaCI中生长良好，但在8NaCI中则生长缓慢28；生长肠球菌属和链球菌属的菌种能在65NaCl环境下生长，植物乳杆菌对NaCI的耐受能力最强，能耐受91的NaCl，而发酵乳杆菌只能耐受53的NaCl。1.8适用于乳酸菌鉴定的方法1.8.1 形态特征和生理生化特性分析形态特征鉴定主要是依据乳酸菌菌落形态和细胞形态的不同进行初步鉴定，但不能作为独立的鉴定方法。菌落形态主要包括菌落在培养基平板上的色泽、形状、大小等；而细胞形态则是对菌落在进行革兰氏染色后，再进行显微镜观察。生理生化特性鉴定则是依据菌株不同的生理生化特性进行分析，一般可以将菌株鉴定到属。内容一般包括过氧化氢酶试验，精氨酸产氨试验，淀粉水解试验，七叶苷水解试验，石蕊牛奶试验，明胶液化试验，乙酰甲基甲醇试验(VP试验)，H2S的产生试验，精氨酸水解试验，葡聚糖的产生试验，脲酶的测定和碳水化合物发酵产酸试验等29-30。商军等就利用了形态学和生理生化相结合的方法从泡白菜、泡萝卜和泡辣椒中分离出的11个乳酸菌株进行了初步鉴定。目前也有很多研究是根据API细菌鉴定标准31，利用API 50 CH试剂条和API CHL培养基对分离菌株进行49种碳水化合物发酵反应，经APILAB Plus软件对各菌株进行鉴定。Dicks（32）等就采用了API 50 CH试剂条和API CHL培养基对从南非红酒中4分离得到的19株菌株进行了分析，经API系统鉴定11株菌为Lhilgardii，另外8株菌为短乳杆菌。1.82分子生物学鉴定越来越多的研究采用了分子生物学技术来进行菌种的分类鉴定，如扩增片段长度多态性分析技术(AFLP)（33）、随机扩增多态DNA技术(RAPD)（34-35）、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和16S rRNA基因序列分析（36）等，这些技术显示出了特异、敏感、快速、简便、重复性好等优点。2材料和方法2.1材料2.1.1 供试样品从 四川成都采集自然发酵泡菜汁一份。2.1.2样品采集 采集自然发酵泡菜汁于灭菌瓶中，放入4冰箱中保存备用。于213仪器设备与试剂(1)仪器设备超净工作台 苏净安泰 电热恒温培养箱 黄石市恒丰医疗器械有限公司 HH数码显恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 自动台式灭菌器 山东新华医疗器械股份有限公司 恒温振荡器 金坛市富华仪器有限公司DYY8C型电泳仪 北京市六一仪器厂家用冷藏冷冻箱 合肥荣事达电冰箱有限公司PCR仪 Biometra台式高速冷冻离心机 Beckman Coulter微型离心机 Eppendirf凝胶成像系统 BioradMILLIQ超纯水纯化机 Biocel制冰机 XUEKE超低温冰箱 Heto Uitra Freeze旋涡混合器 XW80A(2)主要试剂TE缓冲溶液（Ph8.0 高压灭菌）10%（W/V）SDS溶液（无需灭菌）20mg/ml蛋白酶K（分成装，-20保存）5M NaCl （灭菌）CTAB/ NaCl 溶液（无需灭菌）24；1 氯仿/异戊醇25:24:1 酚/氯仿/异戊醇异丙醇70%乙醇无水乙醇3M NaAc(PH5.2)214培养基LB培养基(1L溶液中)：Tryptone(胰蛋白胨)10g,Yeast Extract(酵母提取物)5g,NaCl(氯化钠)10g近自然培养基(10ml体系)：滤菌后自然发酵泡菜汁4ml，无菌水6ml3 耐盐菌16S rDNA文库的建立及ARDRA分析3.1 实验室分离纯化菌落(1)吸取1ml泡菜汁接种于琼脂平板培养基上在30培养48h.(2)挑取单个菌落(3)将单个菌落接种到画好格的琼脂培养基平板上并标号，放入恒温箱30培养48h. 图1 菌体培养过程中的对照平板(4)用牙签把单个菌落接种到装有近自然培养基的试管中标上编号，30水浴恒温摇床培养48h3.2 提取DNA （1）用化学方法提取耐盐菌的DNA(2)用凝胶电泳检验耐盐菌DNA是否提出 图2 凝胶电泳检验耐盐菌DNA 3.3用PCR反应扩增16S rDNAPCR扩增所用引物：Eu27F：5 一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3 1490R：5一CGGTTACCTTGTTACGACTT-3 。PCR扩增所用反应体系：10xBuffer5 uL，Mg (25 mmolL)4 uL，dNTP(5 mmolfL)2 uL，上下游引物(10 pmolL)各3 uL，模板(土壤DNA)10 ul，TaqDNA聚合酶(su)uL，用无菌ddH20补足50 L体系。采用降落PCR的方法：94 变性4 min；然后941 min，45 1.5min，72 2min,循环26次；72延伸10min.3.4用凝胶电泳检验16S rRNA是否扩增图3 PCR后凝胶电泳3.5对扩增后的16S rDNA纯化 把PCR扩增后的16S rDNA再次吸取一部分来PCR，3.6 16S rDNA 文库的建立 对耐盐菌的16S rDNA测序（成都瑞信生物技术有限公司）。3.7 ARDRA分析用酶切软件以限制性内切酶Smal、Xmal、Aval、Pstl、EcoR1、Ncol进行酶切。菌株SmalXmalAvalPstlEcoR1Ncol19492926238022949292633949292621800476747478697457270705996989696804 图4 酶切结果两种限制性内切酶，Smal、Aval和Xmal被用来对6株细菌16S rDNA 片断的多样性进行初步的比较分析。由于这三种酶的识别位点均为6个碱基，假设16S rDNA 上的碱基排列完全是随机的话，那么，理论上它们将以相似的频率对任一给定的序列进行切割。经Smal、Aval和Xmal酶切分离之后，6个克隆子被分成4个不同的ARDRA 型。利用Pstl、EcoR1、Ncol进一步的酶切分析，结果表明当中某些型还可以被细分。但为了得到全部Smal、Aval和Xmal型的集合，对所有6个重组克隆子均进行了Smal、Aval和Xmal酶切分析和比较。结果显示，Smal、Aval和Xmal也将它们划分为4个不同的ARDRA 型，其中最大的一个型含有3个菌株，而剩下的3个型中有包含三个型。综合两种限制酶的分析结果，所有被分析的6个16SrDNA 克隆子被划分为4个不同的ARDRA 型。因此，显示出了泡菜中所含的乳酸菌种类比较丰富。4 结论从1份泡菜样品中筛选乳酸菌：经富集培养和分离纯化后获得6株乳酸菌，把获得的6株乳酸菌进行提取DNA把提取的DNA进行扩增和纯化。将得到的16S rDNA进行测序把测序结果电子酶切。对酶切结果进行ARDRA分析。经3种Smal、Aval和Xmal酶切分离之后，6个克隆子被分成4种ARDRA型耐盐菌，以6种限制性内切酶Smal、Xmal、Aval、Pstl、EcoR1、Ncol进行酶切之后得到6种ARDRA型耐盐菌.显示出了泡菜中所含的乳酸菌种类比较丰富。5总结与体会经过接近三个月的紧张实验，本毕业论文告一段落。在短短的三个月内，我学到了很多在课堂上和书本上学不到的东西，不论是在理论知识方面还是在动手能力方面都有了不小的进步，可谓受益匪浅。通过这次毕业设计，我进一步熟悉和巩固了对实验室相关基本仪器的正确使用技能和有关注意事项的了解，加深了大学四年中所学的知识的认识与体会。在这过程中，通过查找资料和翻阅书籍，我学到了不少知识，拓展了知识面，更重要的是提高了自己思考问题、分析问题、解决问题的能力。实验的过程就是一个不断探索，在探索中发现新的问题、解决问题的过程。实验中，有时为得到一个结论，需要不断重复，经过几次失败后才能掌握较好的实验方法，这使我深深体会到，实验不仅需要科学分析，正确操作，更需要一种锲而不舍的科学精神。我相信，在三个月所学的，将使我受益终身。6致谢词本课题在选题及研究过程中都一直得到了向文良老师的悉心指导。向老师多次询问研究进程，并在我一筹莫展的时候为我指点迷津，帮我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。向老师严谨细致、一丝不苟的作风一直是我学习工作中的榜样！他循循善诱的教导和不拘一格的思路给予了我无尽的启迪！深深的感谢您！同样，我也要感谢在我的实验过程中一直与我们在一起的蒲开阳师兄和梁华中师兄，感谢他们对我的细心指导和实验室中对我的帮助和关心；再次，我要感谢这几个月来和我一起奋战在实验室的同学们在我艰难的时候鼓励、支持我；此外，我还要感谢生物工程实验中心全体老师为我们提供开展实验的空间和各种实验设备和仪器；最后，我要感谢生物工程学院所有老师这四年对我的教导，感谢全体同学和朋友们对我各方面的关心和支持，谢谢大家！【参考文献】（1）赵红霞，詹勇，许梓荣乳酸菌的研究及其应用江两饲料，2003，(1)：912（2）胡书芳，王雁萍乳酸菌在泡菜生产中的应用安徽农业科学，2008，(21)：92759276（3）.Ampe F.ben Omar N.Guyot JR Culture-independent 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