药物分析-第十六章-3

,第十六章 生化药物分析,理化分析法酶分析法电泳法生化检定法,第三节 常用定量分析法与应用,第十六章 生化药物分析,化学分析法紫外-可见分光光度法高效液相色谱法,第三节 常用定量分析法与应用,一、理化分析法,第十六章 生化药物分析,1. 重量法2. 容量法,第三节 常用定量分析法与应用,化学分析法,重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。根据被测组分分离方法的不同，可分为提取法、挥发法、沉淀法。例如：中国药典（2010年版）收载的品种胰酶中脂肪含量的检查采用提取法，以乙醚提取后挥散乙醚，残渣在105干燥2小时后称重并计算。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,容量法：根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定。例如，中国药典（2010年版）二部收载的品种： 盐酸组氨酸的测定通过加入甲醛与之作用，生成Schiff碱后，用氢氧化钠滴定液滴定； 胰酶中淀粉酶的测定是利用氧化还原反应； 核酸类药物硫唑嘌呤采用银量法测定含量。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,紫外-可见分光光度法,样品或转化后的产物在某一波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测定。例如，中国药典（2010年版）二部收载的品种五肽胃泌素采用吸收系数法定量：取本品适量，精密称定，加0.01mol/L氨溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含50g的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录 A），在280nm的波长处测定吸光度，按C37H49N7O9S的吸收系数（E ）为70计算，即得。,1%1cm,第十六章 生化药物分析,1. 反相高效液相色谱法2. 离子抑制法3. 离子对色谱法4. 离子色谱法5. 分子排阻色谱法,第三节 常用定量分析法与应用,高效液相色谱法,反相高效液相色谱法: 固定相：尽量选择球形全多孔硅胶键合相，相对分子质量较小的药物选用十八烷基硅烷键合硅胶，相对分子质量较大的药物选用辛烷基硅烷键合硅胶。 流动相：以甲醇-水、乙腈-水或甲醇、乙腈与缓冲液构成的溶液。 检测手段：紫外、荧光或电化学检测器,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,例如，中国药典（2010年版）二部收载的品种肌苷的含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(1090)为流动相，检测波长为248nm。取肌苷对照品约10mg，80水浴加热10分钟，放冷，加水至50ml，取20l注入液相色谱仪，肌苷峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求，理论板数按肌苷峰计算不低于2000。测定法：取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含20g的溶液，摇匀，精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取肌苷对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,离子抑制色谱法：离子抑制色谱法常在流动相中加入少量弱酸、弱碱或缓冲溶液以调节流动相的pH，在非极性固定相中分离药物时可抑制带电荷离子的离解，增加疏水缔合作用，增加药物的分配系数，改善药物的分离效能。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,如中国药典（2010年版）二部收载的品种多肽类药物醋酸丙氨瑞林的含量测定：色谱条件与系统适用性试验：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH至3.0）-乙腈（8020）为流动相；检测波长为220nm。理论板数按醋酸丙氨瑞林峰计算不低于2000。测定法：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，精密量取10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取醋酸丙氨瑞林对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,离子对色谱法：一些生化药物在水溶液体系中可解离为带电荷离子，如氨基酸、多肽和蛋白质、核酸类等，若向其中加入相反电荷的离子，使其形成中性离子对，会增大其在非极性固定相中的溶解度，从而改善分离效能。如中国药典（2010年版）二部收载的核酸类药物中环磷腺苷的含量测定，以四丁基溴化铵为离子对试剂。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,离子色谱法：适用于离子化合物和能够解离的化合物，如氨基酸、多肽、蛋白质、多糖类药物的分析。 固定相：常用苯乙烯-二乙烯苯共聚物或亲水性高聚物凝胶为基质的离子交换树脂； 流动相：多为水溶液，有时可加入少量的有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以增加某些组分的溶解度，改变分离的选择性。如，中国药典（2010年版）硫酸软骨素钠的含量测定采用该法。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,分子排阻色谱法：分子排阻色谱法（size-exclusion chromatography，SEC）是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术，是快速分离不同分子量混合物的色谱方法，广泛应用于多肽、蛋白质、多糖、生物酶、寡聚或多聚核苷酸等药物的分离分析及其分子量测定。 分离原理：凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（sephadex）等为填充剂。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,分子排阻色谱法具有如下特点：生物活性蛋白可以回收制备。色谱分离是在固定比例的水溶液体系中进行的，流动相通常为缓冲溶液。色谱分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的。分子排阻色谱法峰容量有限，对于生物大分子蛋白类药物的分离柱效较低。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,如中国药典（2010年版）二部收载的品种重组人生长激素的含量测定：以适合分离相对分子质量为500060 000球状蛋白的亲水改性硅胶为填充剂；以异丙醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠5.18g，磷酸二氢钠3.65g，加水950ml，用磷酸调节pH值至7.0，用水制成1000ml）（397）为流动相；流速为每分钟0.6ml；检测波长为214nm。取本品，精密称定，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液，精密量取20l注入色谱仪，记录色谱图；另取重组人生长激素对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,二、酶分析法,酶活力测定法酶法分析,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,酶活力测定法,1.基本概念 酶活力：是指酶催化一定化学反应的能力。 酶的活性单位（国际单位IU） ：是指在25下，以最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的pH值条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定义为一个活性单位。 酶的比活性：是指每毫克蛋白所含的酶活性单位数（单位数/毫克蛋白）。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,2.酶促反应的条件及影响因素 底物：最好选择在物理化学性质上和产物不同的底物。反应系统中，底物的浓度应足够高。 pH：选择缓冲离子应注意以下几个问题：选择的离子的pKa值应尽量接近要调整的pH；缓冲离子不同，即使是同一酶反应所表现出来的活性水平可能各不相同，甚至最适pH也可能发生变化；缓冲离子可能与酶活性的必需成分形成络合物而导致酶活性的抑制；缓冲体系常因稀释和温度等变化而改变其pH值。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,2.酶促反应的条件及影响因素 温度：酶反应对温度十分敏感，实验中温度变动应严格控制在0.1以内。酶反应的温度通常选用25、30或37。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些酶则需要相应的辅酶物质。为了提高酶在反应系统中的稳定性，有时还需要加入某些相应的物质。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,2.酶促反应的条件及影响因素 空白和对照：空白是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可通过不加酶或不加底物。对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，用作比较或标定的标准。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,3.酶活力的测定方法酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。酶反应的速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应的速度愈快表示酶的活力愈高。测定酶活力，可用物理法，化学法或酶分析法等方法。常用的方法有终点法和动力学分析法。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,3.酶活力的测定方法 终点法：在一定条件下，将酶和底物混合，测定生成一定量产物所需时间。例如，中国药典（2010年版）二部收载的品种注射用尿激酶的效价测定，在反应体系内凝块内小气泡的量表示产物的量，故以凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应的终点。 动力学法或反应速率法：将酶和底物混合后隔一定时间，间断或连续地测定反应的连续变化，如吸光度的增加或减少，或者让其反应一定时间后终止反应，定量测定底物的减少或产物生成的量。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,4.注意事项 酶反应速率用单位时间内产物的增加量测定为好。 酶反应速率的测定应在反应的初始阶段。 测定时间点应限定在酶促反应速率与酶量呈线性关系的时间段内。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,酶法分析,酶法分析是一种以酶为分析工具（或试剂）的分析方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶的抑制剂。1.动力学分析法 测定原理：通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，通过测定酶反应的速度就可求出它们的浓度。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,测定方法：酶法分析采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的酶量必须一定。被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适条件。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,2.总变量分析法 又称为平衡法或终点法 测定原理：根据被测物质的性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用，然后在反应完成后，借助物理化学方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。仅适用于底物物质的测定。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,测定条件的控制：被测底物的浓度应很小，并控制反应于1级反应水平。因为这样可以使反应速度达到平衡点；防止过多的产物生成，避免逆反应。其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。酶的用量要高，以保证反应较快地达到终点。一般而言，工具酶用量可控制在12U/ml左右，测定时间多控制在210分钟。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,【酶法分析实例】胃蛋白酶片效价测定,供试品溶液,胃蛋白酶片,对照品溶液,酪氨酸对照品,盐酸溶液稀释、定容,盐酸溶液稀释、定容,供试品和对照品德空白对照,A275,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,测得对照品和供试品溶液平均值 和 分别为0.384和0.447，问：此批药品是否合格？代入公式：每片含蛋白酶（IU）= = =127.98（IU）,按照中国药典（2010年版）规定，胃蛋白酶活力不得少于120单位。故该批胃蛋白酶片效价是合格的。,式中 ms为每1ml对照品溶液中含 酪氨酸的量（g）； m为供试品数量（片）； n为供试品稀释倍数。,第十六章 生化药物分析,电泳法基本原理：在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。电泳分离是基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的。带电质点在电场中的泳动速度为：式中 为电泳淌度，即单位电场强度下的电泳速度（迁移率）（cm2/sV）；为胶粒泳动速率（cm/s）；E为电场强度（V/cm）。,第三节 常用定量分析法与应用,（一）电泳法的基本原理和分类,=E,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,影响各组分的最终位置和分离程度的因素：电场强度；溶液pH；溶液的离子强度；电渗现象；支持物的种类；温度；带点颗粒的性质。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,根据电泳的分离特点及工作方式，电泳可分为三大类：1.自由界面电泳2.区带电泳 在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。3.高效毛细管电泳,第十六章 生化药物分析,纸电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法聚丙烯酰胺电泳法SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳法,第三节 常用定量分析法与应用,（二）常用电泳法的类型及其应用,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,纸电泳法,纸电泳法是用滤纸作为支持介质的一种电泳法。 仪器装置 中国药典（2010年版）二部附录 F收载的水平式电泳室装置如下：,A：电泳槽B：可密封的玻璃（或相应材料）盖 C：有机玻璃（或相应材料）板D：铂电极（直径0.50.8cm）E：滤纸F：有机玻璃电泳槽架。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,电泳缓冲液的选择应根据供试品的理化特性、需要的电泳速度和分辨力，选择适宜的缓冲液、pH值和离子强度。如中国药典（2010年版）二部附录 F纸电泳法中采用的是枸橼酸盐缓冲液（pH3.0)：取枸橼酸（C6H8O7H2O）39.04g与枸橼酸钠（C6H5Na3O72H2O）4.12g，加水4000ml，使溶解。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,滤纸的裁剪取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4，置60烘箱烘干，备用。滤纸可按需要裁成与电泳槽相当的长方形或长条形，并在距底边58cm处划一起始线，每隔2.53cm做一点样记号。滤纸长度视电源输出最高电压及所需的电场强度而定，电压恒定时，所需场强越大，滤纸裁得越短。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,点样方法分干点法与湿点法：干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿。干点法能浓缩供试品，适用于稀的供试品溶液。湿点法是将滤纸全部浸入缓冲液中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点10l，共3点，并留2个空白位置。点样部分点的次数不宜过多，稀的供试品溶液应预先浓缩。湿点法优点是可保持供试品的天然状态，点样后立即接通电源以免扩散。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,电泳及区带显示于电泳槽中加入适量电泳缓冲液，浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源档，电压梯度调整为1820V/cm，电泳约1小时45分钟，取出，立即吹干，不同的供试品采用不同的显色方法，如核苷酸类药物可直接在紫外光灯（254nm）下观察定位，而有些物质必须用显色剂显色。用铅笔划出紫色斑点的位置。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,含量测定剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加如0.01mol/L盐酸溶液5ml，摇匀，放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各品种项下的规定测定吸光度，并计算含量。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,醋酸纤维素薄膜电泳法,系用醋酸纤维素薄膜为支持物的一种电泳方法，已应用于血清蛋白、脂蛋白等的分离和定量测定。其优点如下：对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象。快速省时。灵敏度高，样品用量少。应用广。染色后可制成透明的干板，利于扫描定量和长期保存。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,聚丙烯酰胺电泳法（PAGE）,PAGE的分离效果与分子所带电荷及分子量大小有关，已广泛用于酶、蛋白、聚核苷酸、多肽的分析鉴定和少量制备。与其他电泳法比较具有如下优点：区带不易扩散，用样量极微，分辨率高，分离时间短，重复性好。凝胶机械性能优良，对热稳定，无色透明，无杂质，不溶于缓冲液，在280nm波长处无紫外吸收，利于蛋白质电泳后的扫描检测。电泳时无电渗和吸附作用，适于样品定量和精制。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,SDS-PAGE,原理：蛋白分子与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）结合成复合物后，其所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应，使蛋白分子相对迁移率（Ri）的大小完全取决于分子量的高低，可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。,优点：设备简单、操作方便、试剂易得、误差小、重复性好。,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,例如，中国药典（2010年版）二部收载的品种尿激酶分子组成比的检查采用SDS-PAGE法：取本品，加水溶解并制成每1ml中含2mg的溶液后，加入等体积的缓冲液（取浓缩胶缓冲液2.5ml、20十二烷基硫酸钠溶液2.5ml、0.1溴酚蓝溶液1.0ml与87甘油溶液3.5ml，加水至10ml），置水浴中3分钟，放冷，作为供试品溶液；取供试品溶液10l，加至样品孔，照电泳法（附录V F第五法 考马斯亮蓝染色）测定，按下式计算高分子量尿激酶相对含量： 髙分子量尿激酶相对含量（）= 100,高分子量尿激酶的峰面积,高、低分子量尿激酶的峰面积之和,第十六章 生化药物分析,第三节 常用定量分析法与应用,琼脂糖凝胶电泳法,是以琼脂糖为基质的一种电泳方法。中国药典（2010年版）二部附录 F中琼脂糖凝胶电泳法的操作