流感诊断Microsoft-Word-文档-(3)

流行性感冒诊断标准及处理原则 编辑词条 流行性感冒 简称流感 是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病 主要通过空气飞沫传播 流感病毒有甲 乙 丙三个型 其中甲型所引起的流感流行最为广泛和严重 乙型常引起 爆发 丙型则多引起小儿散发病型 在我国虽将该病归属于法定丙类传染病 但一旦流行 传播快 波及面广 对人民健康及劳动生产力有很大影响 而且对年老体弱多病者及婴 幼儿的威胁较大 为贯彻执行 中华人民共和国传染病防治法 及 中华人民共和国传染 病防治法实施办法 特制定本标准 目录 1 简介简介 2 病原学诊断方法病原学诊断方法 3 血清学诊断方法血清学诊断方法 4 流感快速诊断方法流感快速诊断方法 1 简简 介介 2 病病 原原 学学 诊诊 断断 方方 法法 3 血血 清清 学学 诊诊 断断 方方 法法 4 流流 感感 快快 速速 诊诊 断断 方方 法法 1 简介编辑本段 本标准由中华人民共和国卫生部提出 本标准起草单位 中国预防医学科学院病毒学研究所 本标准主要起草人 陶三菊 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释 1 范围 本标准规定了流感的诊断标准及处理原则 本标准适用于各级各类医疗 卫生 保健机构和人员对流感的诊断 报告和处理的应 用 2 诊断原则 流感流行时一般根据临床症状 结合流行病学可对病人作出初步诊断 如确定诊断则 需要分离病毒阳性或病人双份血清抗体 测定恢复期抗体较急性期增高 4 倍或以上 3 诊断标准 3 1 流行病学史 在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人 或近期内本地区或邻近 地区上呼吸道感染病人明显增多 或医院门诊上呼吸道感染病人明显增多 3 2 临床症状 3 2 1 出现急起畏寒 高热 头痛 头晕 全身酸痛 乏力等中毒症状 3 2 2 可伴有咽痛 干咳 流鼻涕 流泪等呼吸道症状 3 2 3 少数病例有食欲减退 伴有腹痛 腹胀 呕吐和腹泻等消化道症状 3 3 实验室诊断 3 3 1 血液化验检查白细胞总数不高或偏低 3 3 2 从病人鼻咽分泌物分离到流感病毒 见附录 A 3 3 3 恢复期病人血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期有 4 倍或 4 倍以上升高 见附录 B 3 3 4 直接检查呼吸道上皮细胞的流感病毒抗原阳性 见附录 C 中 C1 3 3 5 标本经敏感细胞增殖 1 代后查抗原阳性 见附录 C 中 C2 3 4 病例分类 3 4 1 疑似病例 具备 3 1 加 3 2 或 3 1 加 3 2 加 3 3 1 3 4 2 确诊病例 疑似病例加 3 3 2 或 3 3 3 或 3 3 4 或 3 3 5 4 处理原则 4 1 早期隔离病人 对症治疗病人和防治合并症 早期发现病人 早期隔离病人是最重要的措施 对病人治疗一般采用对症治疗 防治 并发症主要应防止流感病毒性肺炎和细菌性肺炎 特别是对年老体弱者或伴有心血管 慢 性呼吸道疾病者或婴幼儿 流感本身或其合并症可能引起死亡 应特别注意加强治疗护理 4 2 预防措施 一般采用综合性预防措施 讲究卫生 注意体格锻炼和营养 保持室内空气流通 对 易感人群应采取相对隔离措施 如避免接触病人 不去公共场所等 对年老体弱者必要时 可采用灭活疫苗接种或服用金刚烷胺等预防方法 但须注意金刚烷胺仅对防治甲型流感有效 2 病原学诊断方法编辑本段 A1 病毒分离 从疑似流感病人呼吸道采集标本分离病原体 A2 标本的收集和处理 A2 1 标本收集时间应于发病早期 1 3d 内 越早越好 A2 2 标本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法 棉拭子擦抹法用于采集儿童标 本 采集时将灭菌棉拭子稍沾标本收集液 pH7 2 7 6 含 20 40 灭菌肉汤的生理盐水 或 Hanks 液或生理盐水 反复擦拭患者咽部数次 然后将此棉拭子放进装有上述收集液 的试管中塞上棉塞 咽喉洗漱法用于采集成人标本 采集时先让患者咳嗽 然后用 10mL 左右的收集液反复洗漱咽喉部约 1min 吐入管内 如有条件 儿童标本用负压抽吸法抽取 鼻咽分泌物 成人标本用鼻咽洗液 可提高分离的阳性率 标本采集后置冰壶 4 中尽快 送实验室 A2 3 标本的处理 用毛细吸管反复吹打标本液 如为咽拭子标本 先反复挤压咽拭子 后弃之 将粘液打散 于 4 静置 5 10min 待自然沉淀后取 3mL 上清 按每毫升加青 霉素 1000 单位和链霉素 1000 g 混匀置 4 处理 2 4h 即可接种 如标本污染较重 可 置 4 过夜处理 如预计标本在 48h 内不能完成接种时 应将标本置低温 最好 70 保存 A3 接种及培养法 最常用鸡胚培养法和组织培养法 有条件的亦可同时用两种方法进行病毒分离 A3 1 鸡胚培养法 取 9 11 日龄鸡胚 将处理过的标本液经羊膜腔和尿囊腔各接种 0 2 mL 每份标本接种 3 4 只胚 置 33 35 温箱培养 3d 然后将鸡胚放置 4 冰箱过夜 或置 20 冰箱 1h 再置 4 数小时 可分别收获尿液和羊水 并作初步血凝 其方法是用毛 细吸管取 1 2 滴尿液或羊水 置大孔塑料板内 再加入 1 2 滴 1 鸡红细胞 摇匀后置 室温或 4 30 45min 观察结果 根据血球凝集程度的不同可分为 如血凝为 时 再按系列倍比稀释测定其血凝滴度 如具有一定血凝滴度 即可鉴定 如血凝阴性 可盲传 2 代 如仍为阴性则弃之 A3 2 组织培养法 用 0 2mL 处理过的标本液接种于长成单层的原代人胚肾 或猴肾或 地鼠肾 或狗肾传代细胞 Madin Darby Canine Kidney MDCK 每份标本接种 4 管 置 37 吸附 1 2h 后弃标本液 再加入每毫升含 2 g 胰酶的 199 维持液 1mL 于 33 培 养 7 10d 并逐日观察病变 从第三天开始每隔一天用 0 4 鸡或豚鼠红细胞对培养管做 红细胞吸附试验 试验前无菌法收获细胞培养上清液 如阴性则用已收获的上清液盲目传 代 如阳性则测定上清液的血凝滴度 如标本第 1 代红细胞吸附试验阴性 可用收获的全 部上清液混合进行盲传 2 代 仍为阴性则弃之 A4 新分离株的鉴定 新分离流感病毒可用血凝抑制 补体结合 中和以及血细胞吸附抑制等试验方法进行 鉴定 最常用和最简单的方法是血凝抑制试验 必要时采用补体结合试验 A4 1 血凝抑制试验 用当前流行的甲 3 甲 1 及乙型流感病毒代表株的免疫血清与新 分离流感病毒做血凝抑制试验 观察新分离株能否被免疫血清所抑制 血凝抑制试验方法 见附录 B A4 2 红细胞吸附抑制试验 取红细胞吸附试验阳性的组织培养管和正常细胞对照管 用 Hanks 液洗细胞 2 次 加入经霍乱滤液 RDE 处理 1 10 的免疫血清 0 2mL 再加入 Hanks0 6mL 室温作用 30min 后 再加入 0 4 鸡 或豚鼠 红细胞 0 2mL 置室温 30min 后于普通光学显微镜下观察有无血球吸附 如果血细胞吸附被所用免疫血清所抑制 表明 所分离的病毒与所用免疫血清型别相一致或接近 A4 3 补体结合试验 如果用已知的甲型 甲 3 甲 1 或乙型或丙型流感病毒免疫血清 对新分离病毒的血凝均不能抑制 则应考虑可能为甲型流感病毒的新亚型 可用针对甲型 乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作补体结合试验定型 3 血清学诊断方法编辑本段 B1 血凝抑制试验方法 B1 1 原理 一些动物红细胞 如鸡 豚鼠等 以及人 O 型血红细胞上有流感病毒受体 遇流感病毒 可产生红细胞凝集现象 简称血凝 若将特异性抗体与流感病毒 血凝素 预先作用后再加 入红细胞则不产生凝集 称为血凝抑制现象 用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后 能完全抑制血凝的最高稀释度 即为血凝抑制抗体效价 B1 2 主要材料 大孔塑料板 1mL 吸管或 1mL 移液器 B1 3 双份血清收集及处理 急性期血清于发病 3d 内采取 恢复期血清于发病后 2 4 周采取 取 0 1mL 已分离的 血清加入 0 9 或 0 4 mL 霍乱滤液 RDE 即 1 10 或 1 5 稀释 摇匀 于 37 水浴中过夜 以去除血清中的非特异性抑制素 次日置 56 水浴 50min 以灭活多余的 RDE B1 4 流感病毒血凝素制备 流感病毒接种鸡胚后 48h 收获的尿囊液 加入 1 10000 硫柳汞防腐 为了延迟尿盐沉 淀可先用无菌生理盐水做等量稀释 置 4 备用 B1 5 鸡红细胞悬液的制备 从静脉或心脏抽取正常健康鸡血 保存于阿氏 Alsevr s 液中 置 4 保存 用前以生 理盐水洗 3 次 末次经 2000r min 离心 10min 将红细胞用生理盐水配成 1 浓度 B1 6 血凝素滴定 将流感病毒血凝素在大孔塑料板内用生理盐水从 1 5 开始做系列倍比稀释 每孔 0 2 5mL 再加入等量 1 鸡红细胞 摇匀 置室温或 4 30 45min 后观察结果 以出现十十 血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价 即为 1 个血凝单位 实验时采用 4 个血凝素单位 例如血凝素效价为 1 320 为 1 个单位 4 个单位即为 1 80 稀释 正式实验前经校对 取 4 个血凝单位用于实验 B1 7 血凝抑制试验步骤 B1 7 1 将上述已处理的待检血清 1 10 或 1 5 再用生理盐水做系列倍比稀释 每孔 加 0 25mL B1 7 2 加入等量已配好的 4 个单位血凝素 B1 7 3 每孔加入 0 25mL 1 鸡红细胞 摇匀置室温或 4 30 45min B1 8 结果观察 观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟 待阴性孔内红细胞自由下滑呈泪滴状时读结果 以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为抗体的效价 在检测患者双份血清时需在同一 次试验中进行 并以恢复期血清抗体效价较急性期抗体效价升高 4 倍或 4 倍以上为阳性 B2 型特异性补体结合试验 B2 1 原理 甲 乙 丙三个型流感病毒各具有特异的可溶性抗原 核蛋白抗原 甲型流感病毒各 亚型均具有相同的可溶性抗原 与乙型或丙型的可溶性抗原完全不同 因此可利用补体结 合试验来区别它们 当流感病毒出现很大的变异或出现新亚型而引起大流行时 由于来不 及充分掌握新分离毒株的性状 常需同时采用补体结合试验和血凝抑制试验对新毒株进行 血清学诊断 B2 2 型特异免疫血清制备 B2 2 1 免疫用抗原 甲型为 PR8 株和乙型为 Lee 株均为小鼠适应株 于乙醚麻醉下鼻腔感染 12 16g 小 鼠 每鼠 0 05mL 待感染后 3 5d 大部分小鼠发病 部分死亡时 解剖小鼠 取肺研磨 并用生理盐水制成 10 的悬液 低速离心去除粗块 取上清鼠肺悬液即为免疫用抗原 B2 2 2 免疫血清制备 选体重 300 500g 的健康豚鼠 免前采血 3 5mL 分离血清分装冻存留作对照 豚 鼠用乙醚轻度麻醉 鼻腔滴入上述鼠肺悬液抗原 0 5mL 共免疫 3 4 次 每次间隔一周 在末次免疫的同时 由腹腔注射鼠肺悬液 2mL 一周后试血 如果对同型尿膜抗原的血 清效价超过 1 80 而与异型抗原无交叉反应 立即采血分离血清分装冻存于低温 20 以下 试验前血清于 56 水浴灭活 30min B2 3 可溶性抗原的制备 用甲 乙型流感病毒或新分离病毒按常规接种和收获尿囊液 如尿液血凝在 1 40 以 上时 收获其尿囊膜 将尿囊膜用盐水洗一次 用无菌剪刀将膜剪成数小块放入试管中 每个鸡胚的尿囊膜加 1mL 无菌生理盐水 冻化三次 末次化后以 3000r min 离心 15min 吸出上清即为可溶性抗原 加入 1 10000 的硫柳汞防腐 置 4 冰箱至少可用一个月 B2 4 双份血清采集 收集病人急性期 发病 3d 内 和恢复期 发病 10 30d 后 的血清 血清于试验前 56 3 0min 灭活 B2 5 1 绵羊红细胞悬液制备 溶血素 补体的制备和滴定按常规方法 B2 6 补体结合试验步骤 按常规进行 B2 7 结果判定 B2 7 1 被检病毒尿膜抗原与甲型 或乙型 流感病毒免疫血清呈阳性反应则可诊断为甲 型 或乙型 流感病毒 如甲 乙均为阴性时 应考虑丙型流感病毒或其他病毒 B2 7 2 双份血清对甲型 或乙型 抗原有 4 倍或 4 倍以上升高 即可诊断为甲型 或乙型 流 感病毒感染 B2 7 3 正常人群补体结合抗体滴度一般在 1 16 以下 如单份恢复期血清抗体在 1 32 以上时 结合临床症状可作诊断的参考 B2 7 4 人群血清抗体水平调查中 补体结合抗体在 1 32 以上者可作为新近感染流 感的证据 B3 神经氨酸酶抑制试验 B3 1 原理 胎球蛋白 Fetuin 底物经流感病毒的神经氨酸酶作用后 使 N 乙酰神经氨酸游离出来 经过碘酸盐的氧化作用将 N 乙酰神经氨酸转化为 甲醛内酮酸 后者经硫代巴比妥酸 作用形成生色团 用有机溶剂提取生色团 并在分光光度计上比色 利用上述反应可测知 流感病毒的神经氨酸酶活性 反应的颜色越深酶活性越强 并可选择用于神经氨酸酶抑制 试验的标准剂量 神经氨酸酶抑制试验是将标化好剂量的神经氨酸酶 即一定稀释度的流感 病毒尿囊液 和系列稀释的被检血清和正常血清起孵育 测知血清作用于神经氨酸酶活性的 抑制效价 并计算出血清的神经氨酸酶抑制滴度 B3 2 器材及试剂 B3 2 1 小试管 10mL 吸管及分光光度计等 B3 2 2 磷酸缓冲液 PBS pH5 9 及生理盐水 B3 2 3 胎球蛋白底物液 450 500mg 冰冻干燥的胎球蛋白加蒸馏水 10mL 溶解后 置 4 保存 每周新配 B3 2 4 过碘酸钠溶液 称 4 8g 过碘酸钠 NaIO 下标始 4 下标终 溶于 38mL 蒸馏水 中 加 62mL 正磷酸 浓 充分混合 置于棕色磨口瓶中 室温保存 B3 2 5 砷试剂 称 10g 砷酸钠 NaAsO 下标始 2 下标终 和 7 1g 无水硫酸钠溶于 10 0mL 蒸馏水中 加 0 3mL 浓硫酸 置于带玻璃塞的瓶中 置 4 保存 B3 2 6 硫代巴比妥酸试剂 称 1 2g 硫代巴比妥酸和 14 2g 无水硫酸钠加入 200mL 蒸 馏水中 在煮沸的水浴中加热溶解 每周新配 B3 2 7 酸化丁醇试剂 于 100mL 正丁醇中加入 5mL 浓盐酸 置棕色带玻璃塞的瓶中 室温保存 B3 3 神经氨酸酶活性测定 B3 3 1 病毒用生理盐水做系列倍比稀释 1 2 1 32 分装小试管 每管 0 1mL 标 准病毒和未知病毒的神经氨酸酶应在同一试验中测定 B3 3 2 每管补充加入 0 1mL 生理盐水 再加入 0 1mL 用 pH5 9 PBS 配制的胎球蛋 白底物 对照管用盐水代替病毒 充分混合后置 37 水浴作用 18h B3 3 3 从水浴中取出试管在室温冷却 每管加入 0 1mL 的过碘酸盐试剂 充分混合 室温静置 20min 时间要准 B3 3 4 每管加入 1mL 砷试剂 由于碘的释放出现棕色 摇动试管待棕色消失 B3 3 5 每管加入 2 5mL 硫代巴比妥试剂 并充分混合 该试剂需在煮沸溶解后加入 用棉塞将管口堵紧 B3 3 6 立刻将试管置于煮沸的水浴中 煮沸 10min 可见红色出现 即为神经氨酸酶 活性的表现 颜色越深酶活性越高 B3 3 7 将试管置冰水中冷却后去掉棉塞 加入 4mL 丁醇试剂 换上干净橡皮塞 用 手剧烈摇动试管 提取颜色使其转到有机物 丁醇 相 B3 3 8 以 1500r min 离心 5 10min 使丁醇层清亮透明 小心地吸出上层的丁醇 放 入干净的试管中待检 B3 3 9 将上述受检样品由高稀释度到低稀释度依次倾入透光池中 其中第一个透光池 加入无病毒的对照管液 将分光光度计波长调至 549nm 将对照管调至零 然后依次读取 每个稀释度样品的光密度 B3 3 10 酶单位的计算 酶活性测定时光密度为 0 45 0 85 的病毒稀释度作为一个酶 单位 B3 4 神经氨酸酶抑制试验 B3 4 1 按上述方法测定酶活性 选用 1 个酶单位的病毒稀释度 即酶活性测定时光密 度为 0 45 0 85 的病毒稀释度 每管加入 0 1mL B3 4 2 受检血清做系列倍比稀释 每管病毒加入不同稀释度血清 0 1mL 血清对照管 是以最低稀释度血清加生理盐水代替病毒 37 水浴作用 1h 以同法做正常血清对照组 B3 4 3 每管加入 pH5 9 PBS 配制的胎球蛋白 0 1mL 充分摇匀 置 37 水浴中孵育 18h B3 4 4 自水浴中取出试管 按 B3 3 3 B3 3 7 逐步加入前述各种试剂 B3 4 5 测定光密度时应从低稀释度血清管至高稀释度血清管 检测方法同 B3 3 9 B3 5 神经氨酸酶抑制抗体滴度的计算法 B3 5 1 根据抗血清和正常血清两组试验的实验结果 求得每组血清同一稀释度的光密 度之商数 即为经血清作用后所余之酶活性的百分数 血清稀释度越高 残留的酶活性也 越高 找出 50 酶活性前后两个血清稀释度及其相应的酶活性百分数 按公式计算出血清 神经氨酸酶抑制抗体滴度 B3 5 2 计算公式 式中 A 血清神经氨酸酶抑制抗体效价倒数 B 下标始 1 下标终 酶活性高于 50 的血清稀释度倒数 B 下标始 2 下标终 酶活性低于 50 的血清稀释度倒数 C 下标始 1 下标终 高于 50 的酶活性的百分数 C 下标始 2 下标终 低于 50 的酶活性的百分数 50 常数 B3 5 3 计算举例 先计算血清作用后的酶活性 然后将对数稀释度换算为几何稀释度 例如 10 上标始 3 上标终 换算为 1 1000 1 0 上标始 3 5 上标终 换算为 1 3200 最后代入公式 此抗血清的神经氨酸酶抑制效价为 1 1440 4 流感快速诊断方法编辑本段 C1 直接检查呼吸道脱落上皮细胞内抗原 C1 1 原理 由于流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮细胞 因此在病人呼吸道标本的脱落细 胞中含有流感病毒抗原 通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断 检查方法可采用免 疫荧光法 一般于 3 4h 内即可完成 而且可以直接定型 C1 2 标本的收集和制片 儿童标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物 成人标本最好采用鼻咽洗液 可将 每份标本分为两份 一份低温冻存备作病毒分离 一份用 pH7 2 磷酸缓冲液 PBS 将粘 液吹打散 1500r min 离心 15min 去除上清 细胞沉淀用 PBS 洗 1 2 次 末次离心后弃 上清 加入适量 pH7 2 PBS 使细胞重悬 滴加于带圈的玻璃片上 自然干燥 冷丙酮固 定 10min C1 3 间接免疫荧光法 C1 3 1 用 10 新鲜羊或牛血清封闭标本片 置湿盒中于 37 30min C1 3 2 分别加入适当稀释度的抗甲型和乙型流感型特异性单克隆抗体 置湿盒中于 3 7 放置 1h 在 PBS 中洗两次 共 10min C1 3 3 加适当稀释度的兔抗鼠荧光素结合物置 37 1h 在 PBS 中洗三次 共 10min 末次用蒸馏水过一下 C1 3 4 于荧光显微镜下观察结果 观察到三个以上胞浆内或胞核内荧光阳性细胞即可 判为阳性 C2 标本经敏感细胞增殖 1 代后查抗原 C2 1 原理 病人呼吸道标本经接种敏感细胞 狗肾传代细胞 MDCK 增殖 1 3d 后 将细胞消化分 散制成抗原片 再用免疫荧光法或免疫酶染法检查细胞内抗原 由于标本中的病毒在敏感 细胞增殖后查抗原 能明显提高其诊断的敏感性 可在细胞病变出现以前查到抗原 可以 直接定型 而且比常规鸡胚分离病毒法要快得多 一般 24 72h 即可诊断 检查方法可采 用间接免疫酶染法 C2 5 或间接免疫荧光法 C2 4 C2 2 标本的收集及处理 儿童标本可采用咽拭子 最好采用负压抽吸法 成人标本可采用咽漱液 最好采