《生物化学》第1章蛋白质化学

第一章 蛋白质化学 本章内容 蛋白质的生物学功能蛋白质的组成氨基酸的化学蛋白质的结构蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质的性质蛋白质的分离纯化蛋白质的分类 生命是蛋白体的存在方式 这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新 恩格斯 反杜林论 1878 概念 蛋白质 protein 简写pro 是由20种天然的L 氨基酸按一定的顺序 序列 通过酰胺键 肽键 缩合而成的 具有较稳定构象并有一定生物功能的生物大分子 一 蛋白质的生物学功能 1 催化作用几乎所有的酶都是蛋白质 膜蛋白 2 生物体的结构成分 3 运输和储存 血红蛋白在血中输送氧肌红蛋白在肌肉中输送氧 膜蛋白起运输作用 4 运动作用 动物的肌肉收缩 细菌的鞭毛运动 5 免疫保护作用 抗体 Antibody Ab 6 激素作用 胰岛素等7 接受和传递信息的受体 受体蛋白 8 控制细胞生长 分化 生长因子 阻遏蛋白9 毒蛋白 植物 微生物 昆虫所分泌10 许多蛋白在凝血作用 通透作用 营养作用 记忆活动等方面起重要作用 二 蛋白质的组成 一 蛋白质的元素组成 C H O N及少量的S特点 N在各种蛋白质中的平均含量为16 用定氮法可测定蛋白质含量 蛋白质含量 g 蛋白质含氮量 6 25 二 蛋白质的水解 1 完全水解 用浓酸 碱将蛋白质完全水解为氨基酸 酸水解 无消旋作用 产物为L 氨基酸 碱水解 多数氨基酸被破坏 有消旋现象 2 部分水解 一般用酶或稀酸在较温和条件下 将蛋白质分子切断 产物为分子大小不等的肽段和氨基酸 蛋白酶 胰蛋白酶 糜蛋白酶 胃蛋白酶等 三 氨基酸的化学 氨基酸 aminoacid 简写aa 蛋白质的基本组成单位 是含氨基的羧酸 天然蛋白质由20种氨基酸组成 一 氨基酸的结构 1 通式 氨基酸中 碳原子为不对称碳原子 除甘氨酸 由通式可得出 1 组成蛋白质的aa都是 氨基酸 除脯氨酸 亚氨基酸外 2 不同aa仅R链不同 3 除甘氨酸外 其余aa的 碳原子均为不对称碳原子 2 氨基酸的构型 构型 由于基团或原子在空间排列的不对称性而引起的光学活性立体结构称立体构型 立体构型 氨基在左为L 型 氨基在右为D 型 二 氨基酸的种类及结构 1 按结构可分为 1 脂肪族侧链 甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸 丝氨酸 脯氨酸 苏氨酸 2 芳香族侧链 苯丙氨酸酪氨酸色氨酸 3 含硫侧链 半胱氨酸 甲硫氨酸 4 含氮碱性侧链 组氨酸赖氨酸精氨酸 5 酸性及酰胺侧链 天冬氨酸谷氨酸天冬酰胺谷氨酰胺 2 按R基团的极性分 Gly GAla AVal VLeu LMet MIle I Phe F Tyr Y Trp W Ser SThr TCys CPro PAsn NGln Q Lys K Arg R His H Asp D Glu E 3按其亲水性 疏水性可分为 4 按人体是否可合成来分 必需氨基酸 机体不能自身合成 必须由食物供给的氨基酸 赖 色 苏 缬 甲硫 亮 异亮 苯丙半必需氨基酸 人体可合成 但幼儿期合成速度不能满足需要 组 精 非必需氨基酸 机体可自身合成的氨基酸 5 稀有氨基酸 胱氨酸 2个半胱氨酸脱氢形成胱氨酸 羟脯氨酸 胶原蛋白 鸟氨酸 甲状腺蛋白 6 非蛋白质氨基酸 L 瓜氨酸 L 鸟氨酸 参加尿素循环 丙氨酸 维生素前体 氨基丁酸 神经递质 D 谷氨酸 D 丙氨酸 细菌细胞壁的组分 三 氨基酸的重要理化性质 1 一般物理性质 2 两性解离与等电点 两性性质 1 氨基酸为两性电解质 2 aa解离方式取决于所处环境的pH 3 等电点 isoelectricpoint 缩写为pI 定义 aa净电荷为零时的溶液的pH为该aa的等电点 AnacidicaminoacidpI pK1 pKR 2 AbasicaminoacidpI pKR pK2 2 4 pI的测定 基于aa所带基团均可解离 酸碱滴定法 得到弱酸弱碱曲线 根据aa上可解离基团的pK值计算等电点 pK 解离常数 以甘氨酸为例 5 等电点的计算 由式可知解离常数 由此可知 已知在pI时 R R 整理可得 K1K2 H 2 两边取负对数 lg H 2 lgK1 lgK2 lg H pH lgK1 pK1 lgK2 pK2 2pH pK1 pK2令pI为等电点时的pH 则pI pK1 pK2 Gly pI 2 4 9 6 5 97 由此可知 等电点相当于该aa两性离子状态两侧基团pK值之和的一半 A 对侧链R基不解离的中性氨基酸 pI 1 2 pK1 pK2 即 等电点pH值与离子浓度无关 只取决于兼性离子两侧基团的pK值 B 对有三个可解离基团的氨基酸 如 酸性氨基酸 碱性氨基酸的pI计算 a 先写出其解离公式 b 后取兼性离子两侧基团的pK值的平均值 如 天冬氨酸 如赖氨酸 总结 a 各种aa的pI不同 b 同一pH下 各种aa所带电荷不同 pH pI aa pH pI aa 用离子交换 电泳将aa分开c 处于pI时 aa溶解度最小 易沉淀 可分离aa 3 紫外吸收性质 只有芳香族氨基酸有紫外吸收能力 因其含有苯环共轭双键的R侧链 酪氨酸 max 270nm苯丙氨酸 max 259nm色氨酸 max 279nm所以 测样品280nm处的光吸收值 可知溶液中蛋白质浓度 此法快速简便 酪氨酸的 max 275nm 275 1 4x103 苯丙氨酸的 max 257nm 257 2 0 x102 色氨酸的 max 280nm 280 5 6x103 4 氨基酸的重要化学性质 1 与茚三酮的反应 氨基酸与水合茚三酮溶液共热 引起aa氧化脱氨 脱羧 水合茚三酮与反应产物 氨和还原型茚三酮 生成兰紫色化合物 Pro和Hyp呈黄色 色深与溶液中氨基浓度成正比 570nm 570nm 440nm Pro Hy Pro 桑格尔反应 SANGERREACTION 鉴定多肽或蛋白质的N 末端氨基酸 弱碱性 Edman反应 能够不断重复循环 将肽链N 端氨基酸残基逐一进行标记和解离 DNS Cl反应 用DNS 二甲基萘磺酰氯 测定氨基酸原理DNFB法相同 是氨基酸的 NH2参加的反应DNS 氨基酸在紫外灯下发黄绿色荧光由于DNS有强烈荧光 灵敏度比DNFB法高100倍 比Edman法高几到十几倍可用于微量氨基酸的定量 样品最低用量可在5pmol 与甲醛的反应 第二节肽 一肽和肽键的结构 1 肽 peptide 一个氨基酸的 羧基和另一氨基酸的 氨基脱水缩合而成的化合物 2 肽链的基本连接方式 肽键 肽键 peptidebond 为1个氨基酸的 氨基和另一氨基酸的 羧基之间脱水后形成的共价键 即酰胺键 此为蛋白质中氨基酸连接的基本方式 1 肽键具高度稳定性 2 具双键性质 不能自由转动 3 肽单元呈平面化和刚性性质 4 C O与 NH反式排列 3 肽链间 内的连接 二硫键 概念 由肽链中相应部位上两个半胱氨酸脱氢连接而成 此称胱氨酸残基 是连接肽链内或肽链间的主要桥键 功能 稳定肽链空间结构 赋予一定生物活力 二硫键的连接 种类有多种 例 胰岛素 胰脏中胰岛 细胞分泌的一种蛋白质激素 功能 降低血糖 结构 A链 21aa B链 30aa 链间有两对二硫键 在A链内aa6和aa11间以二硫键连成小环 如 牛胰岛素 多肽 polypeptide 多个氨基酸以肽键连接方式形成 书写习惯 左N右C 一端是游离氨基 另一端为游离羧基 肽链中的氨基酸已非完整分子 称氨基酸残基 animoacidresidue 在多肽链中 氨基酸残基按一定的顺序排列 这种排列顺序称为氨基酸顺序书写习惯 左N右C 通常在多肽链的一端含有一个游离的 氨基 称为氨基端或N 端 在另一端含有一个游离的 羧基 称为羧基端或C 端 氨基酸的顺序是从N 端的氨基酸残基开始 以C 端氨基酸残基为终点的排列顺序 如上述五肽可表示为 Ser Val Tyr Asp Gln 4 天然存在的活性肽 活性肽 activepeptide 存在于生物体内 具各种特殊生物学功能的肽 谷胱甘肽 GSH GSH GSH GSSG多肽激素 如催产素 加压素 肾上腺皮质激素 胰高血糖素 舒缓激肽等 脑肽 脑啡肽 内啡肽 抗生素 如短杆菌肽 放线菌素D毒素等 活性肽 活性肽 H3N Tyr Gly Gly Phe Met COO H3N Tyr Gly Gly Phe Leu COO Met 脑啡肽Leu 脑啡肽 活性肽 二蛋白质的分子结构 一 蛋白质的一级结构 Primarystructure 1 定义蛋白质的一级结构 蛋白质分子中氨基酸组成 排列顺序及二硫键的位置 包括 1 组成蛋白质的多肽链数目 2 多肽链的氨基酸顺序 3 多肽链内或链间二硫键的数目和位置 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序 它是蛋白质生物功能的基础 2 维持蛋白质一级结构的作用力 化学键 是肽键和二硫键 3 测定蛋白质的一级结构的要求 A 样品必需纯 97 以上 B 知道蛋白质的分子量 C 知道蛋白质由几个亚基组成 D 测定蛋白质的氨基酸组成 并根据分子量计算每种氨基酸的个数 E 测定水解液中的氨量 计算酰胺的含量 4 蛋白质测序的策略 测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子的多肽链断开多肽链内的二硫键分析每一个肽链的氨基酸组成测定多肽链的N 末端和C 末端氨基酸残基将多肽链裂解成较小的片断测定各肽段的氨基酸序列重建多肽链的一级结构确定二硫键的位置 5蛋白质一级结构测定的一般方法 1 确定氨基酸组成 酸解 分离 显色 定量测定 2 氨基酸末端分析 N末端分析 异硫氰酸苯酯 PITC法 2 4 二硝基氟苯法 DNFB 丹磺酰氯法 DNS法 氨肽酶法C末端分析 化学法 羧肽酶法 氨 羧肽酶法 氨 羧肽酶是一种肽链外切酶 它能从多肽链的N C 端逐个的向里水解 从而知道蛋白质的N 末端残基顺序 Ser Gly Tyr Ala Leu 肼解法 此法是多肽链C 端氨基酸分析法 多肽与肼在无水条件下加热 C 端氨基酸即从肽链上解离出来 其余的氨基酸则变成肼化物 肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C 端氨基酸分离 化学法 溴化氰及无水溴化氰 溴化氰水解法 它能选择性地切割由甲硫氨酸羧基所形成的肽键羟胺 NH2OH 断裂断裂Asn Gly之间的肽键 3 将多肽特异地裂解成较小的肽 酶解法 胰蛋白酶 Trypsin Arg Lys羧基端参与形成肽键 糜蛋白酶 Chymotrypsin 芳香氨基酸羧基端参与形成的肽键胃蛋白酶 Pepsin 疏水氨基酸羧基端参与形成的肽键葡萄球菌蛋白酶 Glu蛋白酶梭菌蛋白酶 Arg蛋白酶Vs蛋白酶 Glu 4 用Edman方法分析各小肽的氨基酸序列 与异硫氰酸苯酯 PITC 的反应 5 将已知序列各肽段重叠 确定整个肽链的氨基酸顺序 二 蛋白质的空间结构 1 概念Pro空间结构又称Pro的构象 高级结构 指Pro分子中所有原子和基团在三维空间的排列及肽链的走向 血红蛋白四级结构 2 构型与构象 构型 指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向 构象 指这些取代基团在单键旋转时可能形成的不同的立体异构体 蛋白质的构象 指蛋白质特有的空间结构 蛋白质结构有不同的组织层次 3蛋白质分子中的非共价键 1 氢键 羧基上的氧与亚氨基上的氢原子所形成 作用 链内维持二级结构 链间为三 四级结构所需 2 疏水键 aa非极性侧链形成 作用 维持三级结构 3 盐键 带正负电荷的侧链通过静电引力形成 4 范德华力 中性分子或原子间的作用力 a盐键 离子键 b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键 氢键 范德华力 疏水相互作用力 盐键 均为次级键氢键 范德华力虽然键能小 但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要 二硫键越多 蛋白质分子构象越稳定 离子键 氢键 范德华力 疏水相互作用力 三 蛋白质的二级结构 1 定义 指蛋白质多肽链由于氢键的作用盘旋折叠形成的空间构象 是蛋白质本身的折叠和盘绕形式 2 四种结构单元形式 螺旋结构 折叠结构 转角结构无规则卷曲 1 螺旋 helix 1951年Pauling提出因肽链中aa残基中的 NH与前三个aa的C O间可形成氢键 使得肽链呈螺旋状盘曲 左手和右手螺旋 蛋白质分子多为右手 螺旋 3 6个氨基酸残基螺旋一周 两个氨基酸之间的距离0 15nm 沿轴上升的距离即螺距为0 54nm 肽链内形成氢键 氢键的取向几乎与轴平行 第一个氨基酸残基的酰胺基团的 CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的 NH基形成氢键 稳定性与氨基酸组成有关在有pro处断裂同种电荷的氨基酸处断裂 Fourmodelsofthehelix showingdifferentaspectsofitsstructure 2 折叠 sheet 结构特点 肽链伸展 按层排列 在肽链的不同区段或不同肽链间形成氢键 维持结构的稳定性 折叠 折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列 通过链间的氢键交联而形成的 肽链的主链呈锯齿桩折叠构象 折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的 也可以在同一肽链的不同部分之间形成 几乎所有肽键都参与链内氢键的交联 氢键与链的长轴接近垂直 折叠有两种类型 一种为平行式 即所有肽链的N 端都在同一边 另一种为反平行式 即相邻两条肽链的方向相反 3 转角 turn 链内形成氢键 多肽链出现180 的回折 此回折角称 转角结构 此结构广泛存在球状蛋白中 转角 4 无规则卷曲 指无规律的松散肽链结构 通常酶蛋白的功能部位在此 四 蛋白质三级结构 1 概念 蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋 折叠 从而生成特定的空间结构 2 维持三级结构稳定的主要作用力疏水作用力 肌红蛋白三级结构 3 超二级结构 supersecondarystructures 指若干相邻二级结构单元组合彼此相互作用 形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体 此为二级结构与三级结构间的一种过渡构象 如 等 5 结构域 domains 多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠而成的相对独立的三维实体称结构域 具有部分生物学功能 甘油醛3 P脱氢酶结构域 几种常见的结构域 蚯蚓血红蛋白的结构域四个 螺旋 免疫球蛋白VL的结构域 丙糖异构酶 五 蛋白质的四级结构 1 定义亚基间通过非共价键聚合而成的特定构象 2 亚基 几条肽链以非共价键联结成一稳定的活性单位 这种肽链称该蛋白质的亚基 subunit 亚基单独存在不具活性 血红蛋白 2个 亚基和2个 亚基 蛋白质的四种结构层次 蛋白质的一级结构蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 蛋白质的空间结构一级结构卷曲 折叠而成 通常分为二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构 一级结构决定空间结构 第三节蛋白质分子结构与功能的关系 蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质构象与功能的关系 一蛋白质一级结构与生物功能 1 一级结构不同 蛋白质功能不同 2 一级结构的关键部分相同 功能相同 不同来源的胰岛素都由A B链 51个aa组成 但一级结构的aa种类并不完全相同 一级结构与分子进化 依据细胞色素c建立的系统发生树 3 一级结构改变引起的分子病 如 镰刀型贫血病血红蛋白仅一级结构 6Glu换成 6Val由此引起三级结构多一疏水键 四级结构发生线性缔合 导致红细胞发生溶血 二蛋白质构象与功能的关系 蛋白质构象改变 活性丧失 用化学方法修改Pro或多肽化合物的结构 可提高活性 了解Pro结构中的活性必需片段 可人工合成Pro 三蛋白质的性质 蛋白质的性质与其分子大小 结构及其组成 aa的性质密切相关 一 分子量Mr 道尔顿Pr为高分子有机物 分子量几千 几千万 分子量测定方法 渗透压法 超速离心法 凝胶过滤法 分子筛 SDS 聚丙烯酰胺电泳法 SDS PAGE 等 分子量测定 PAGE分子筛电荷效应浓缩效应SDS PAGE分子筛浓缩效应 SDS PAGE 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比 净电荷 大小 形状 用SDS和巯基乙醇 打开二硫键 处理蛋白质变性 肽链伸展 并与SDS结合 形成SDS 蛋白质复合物不同蛋白质分子的均带负电 SDS带负电 且荷质比相同 蛋白质分子大 结合SDS多 分子小 结合SDS少 不同蛋白质分子具有相似的构象用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量 Typicalcalibrationcurvesobtainedwithstandardproteinsseparatedbynongradientdenaturing SDS discontinuousgelelectrophoresisbasedonthemethodofLaemmli 1970 A Gelwith7 polyacrylamide B Gelwith11 polyacrylamide RedrawnwithpermissionfromSigma Separationofmembraneproteinsby5 1 to20 5 polyacrylamidegradientSDS PAGE 分子量测定 根据化学成分测定最小相对分子质量此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量然后 假定蛋白质分子中该成分只有一个 据其百分含量可计算出最低相对分子质量 最小相对分子质量 已知成分的相对分子 原子质量 已知成分的百分含量如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位 则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数 分子量测定 超速离心法 在60000 80000r min的高速离心力作用下 蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度 用S表示 一个S单位 为1 10 13秒相对分子质量越大 S值越大蛋白质的沉降系数 1 200S由沉降系数S可根据斯维得贝格 Svedberg 方程计算蛋白质分子的相对分子质量 M RST D 1 i R 气体常数T 绝对温度D 扩散系数 溶剂的密度 分子量测定 超速离心法 分子量测定 凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠 其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定 只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部 大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来 洗脱液体积小 小分子在颗粒网状结构中穿来穿去 历程长 后洗脱下来 洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用葡聚糖 商品名 Sephadex测得几种标准蛋白质的洗脱体积 Ve 以相对分子质量对数 logM 对Ve作图 得标准曲线再测出未知样品洗脱体积 Ve 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量 分子量测定 凝胶过滤法 分子筛 凝胶过滤法 二 两性电离与等电点 应用电泳法 分离各种蛋白质 鉴定蛋白质的纯度 此多用于科研 生产 临床诊断等 三 胶体性质 蛋白质水溶液为亲水胶体 不能通过半透膜 分子周围有同种电荷和水化膜 有利于稳定pr胶体系统 水化膜 同种电荷 超滤 透析 四 呈色反应 反应试剂颜色反应基团双缩脲反应NaOH 稀CuSO4紫或粉2个以上肽链Millon反应Millon 硝酸 亚硝酸红色酚基黄色反应HNO3及NH3黄 橘黄苯环乙醛酸反应乙醛酸H2SO4紫红吲哚坂口反应次氯酸钠 萘酚 NaOH红色胍基Folin酚试剂反应CuSO4磷钨酸 钼酸兰色酚基茚三酮反应茚三酮紫兰色游离氨羧基 双缩脲反应 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用 生成粉红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物 能发生同样的反应肽键的反应 肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定 测定蛋白质水解程度 米伦氏反应酪氨酸的显色反应 酚羟基反应 米伦试剂为硝酸 亚硝酸 硝酸汞 亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中 加入米伦试剂 产生白色沉淀 加热后变成红色乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH 将浓硫酸沿管壁缓慢加入 不使相混 在液面交界处 即有紫色环形成色氨酸的反应 吲哚环的反应 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸坂口反应精氨酸的反应 胍基的反应 精氨酸与 萘酚在碱性次氯酸钠 或次溴酸钠 溶液中发生反应 产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸 福林试剂反应酪氨酸 色氨酸的反应 还原反应 福林试剂 磷钼酸 磷钨酸与双缩脲法结合 Lowry法在碱性条件下 蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质 铜络合物 将福林试剂还原 产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸 色氨酸的反应生成黄色化合物指甲 皮肤 毛发考马斯亮蓝G 250本身为红色 与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强 灵敏度高1 1000微克 毫升 SangerFDNBDNP aa测定蛋白质N端氨基酸序列EdmanPITCPTH aa测定蛋白质N端氨基酸序列DNS ClDNS aa测定蛋白质N端氨基酸序列黄绿色荧光 五 沉淀反应 机理 1 利用pr两性电离性质 2 许多化学试剂可减少pr与水的亲和力方法 盐析 醇 酸 重金属离子 生物碱 盐析 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐 NH4 2SO4 Na2SO4 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 这种现象称为盐析 盐析作用是由于当盐浓度较高时 盐离子与水分子作用 使水的活度降低 原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水 从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用 破坏蛋白质分子表面的水化层 不同的蛋白质分子 由于其分子表面的极性基团的种类 数目以及排布的不同 其水化层厚度不同 故盐析所需要的盐浓度也不一样 因此调节蛋白质的中盐浓度 可以使不同的蛋白质分别沉淀 如 血清 球蛋白 清蛋白 NH4 2SO4 50 饱和度 饱和 析出 析出 分段盐析 盐溶 salt in 蛋白质溶液中加入低浓度的中性盐使蛋白质的溶解度增大的现象 等电点沉淀 蛋白质是两性电解质 其溶解度与