例子1：产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽

1 产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽研究 2 有关谷胱甘肽的基本知识 生物活性三肽化合物 小分子硫醇类化合物 含有 肽键 主要有还原型 GSH 和氧化型 GSSG 两种形态 3 谷胱甘肽的形态转换 图1 1酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程 4 谷胱甘肽在自然界中的分布情况 动物 肝脏 肾 红细胞和眼睛晶状体植物 蔬菜 豆类 谷物 薯类 菇类微生物 酵母 主要为Saccharomyces属和Candida属 谷胱甘肽主要以GSH形式存在 大多数生物细胞中GSH与GSSG的比例约为100 1 5 谷胱甘肽的功能 维持生物体内适宜的氧化还原环境 广泛用于生物化学 医学 生物学和化学的研究测定 GSH可以迅速增强机体的免疫力 对消化系统 呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助 GSH具有消除疲劳的作用 近年来还发现GSH具有抑制艾滋病病毒的功效加拿大麦基尔大学教授古特曼博士这样预测 GSH很快就会象胆固醇一样深入民心 成为人们衡量健康的指标之一 6 GSH多用于治疗肝脏疾病 解毒 抗辐射 抗肿瘤 癌症 抗氧化衰老 协调内分泌疗效明显且无副作用 这些同类药物所不具有的优点使得GSH在临床医药领域有着极为广泛的用途 谷胱甘肽应用于临床 7 表1 1GSH的生理功能及其在临床上的应用 8 谷胱甘肽应用于食品行业 GSH具有独特的生理功能 被称为长寿因子和抗衰老因子 GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用 它在食品行业的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂 表1 2GSH在食品加工业中的用途 9 谷胱甘肽的应用前景 医药工业食品工业体育运动生物研究 昂贵的市场价格 GSH在各领域中的广泛应用 限制 10 谷胱甘肽的制备方法 有机溶剂萃取法 化学合成法 生物技术法 酶转化法 发酵法 11 酶法合成谷胱甘肽 谷胱甘肽合成酶系酶活的提高ATP再生系统的构建E coli细胞中的乙酸激酶反应S cerevisiae细胞中的糖酵解途径固定化酶 细胞 技术的应用提高ATP的转移效率以及增加ATP在反应体系中的稳定性 以实现ATP再生系统的高效运行 12 发酵法生产谷胱甘肽 高产菌株的选育发酵过程的优化及控制基因工程菌在谷胱甘肽生产中的应用 13 高产菌株的选育 图1 3高产GSH酵母菌株的选育方法与结果 14 发酵条件优化营养成分的选择培养条件的优化 发酵过程控制控制葡萄糖的浓度 流加发酵控制细胞比生长速率 提高比GSH合成速率 前体物质的添加添加策略 一次性添加 连续添加等 发酵过程的优化及控制 15 基因工程技术的应用 提高GSH合成酶系的酶活 增加质粒的拷贝数 降低酶系对GSH的敏感性 构建脱敏菌株 需要考虑质粒的稳定性 16 发酵法生产谷胱甘肽研究中仍存在的问题 对C utilis发酵生产GSH的细胞生长规律和GSH合成特性还缺乏了解 还没有发现从发酵动力学的角度 来分析并获得GSH发酵过程中出现的规律性结果 在流加发酵中 高细胞密度和高GSH合成能力的矛盾还没有解决 未见运用代谢理论及其手段为GSH合成过程中发生的变化寻求合理的解释 如何将胞内GSH分泌至胞外也需要深入研究 17 发酵法生产谷胱甘肽研究的意义 日本协和发酵和味之素公司在上世纪80年代就已实现GSH的工业化生产 并基本垄断国际市场 我国在该方面的研究相对滞后 日本以明显的差价将GSH销往欧美和我国 欧美250美元 kg 我国450美元 kg 因此 大力研制开发并获得具有自主知识产权的GSH生产技术 对于我国功能食品和医药工业的发展都具有重要的意义 18 发酵过程优化原理 外因 基于微生物反应原理的培养环境优化技术内因 基于代谢特性的分阶段培养技术外因定量化 基于动力学模型分析的优化和控制技术内因定量化 基于代谢通量分析的过程优化技术 19 微生物细胞 基于微生物反应原理的培养环境优化技术 外因 创造一个适于微生物生长和代谢的环境 关键技术1 在一个生物反应体系中 20 基于代谢特性的分阶段培养技术 内因 基于微生物反应原理的培养环境优化技术 外因 创造一个适于微生物生长和代谢的环境 关键技术2 在一个生物反应体系中 控制细胞代谢特性 与优化的环境相适应 21 基于代谢特性的分阶段培养技术 内因 基于动力学模型分析的优化和控制技术 外因 定量化 关键技术3 在一个生物反应体系中 控制细胞代谢特性 与优化的环境相适应 基于微生物反应原理的培养环境优化技术 外因 22 基于代谢特性的分阶段培养技术 内因 基于动力学模型分析的优化和控制技术 外因 定量化 关键技术4 在一个生物反应体系中 基于微生物反应原理的培养环境优化技术 外因 基于代谢通量分析的过程优化技术 内因 定量化 23 本研究的主要内容 课题来源 江苏省高校高新技术产业发展项目 微生物发酵法生产谷胱甘肽 研究目标 酵母细胞和GSH的高产量 高得率和高生产强度研究内容 6个部分 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 24 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 25 碳源种类对谷胱甘肽发酵的影响 表2 1各种碳源对细胞生长及GSH合成的影响 26 图2 2糖类碳源对细胞生长及GSH合成的影响 Glucose Sucrose Fructose 27 氮源种类对谷胱甘肽发酵的影响 图2 3各种氮源对细胞生长及GSH合成的影响 Beefextract Peptone Yeastextract Urea NH4 2SO4 NH4Cl NaNO3 28 混合氮源对谷胱甘肽发酵的影响 图2 4混合氮源 硫酸铵 尿素 对细胞生长及GSH合成的影响Mixednitrogensourceconcentration 6g L 1 8g L 1 10g L 1 29 KH2PO4和MgSO4对谷胱甘肽发酵的影响 图2 5不同浓度磷酸二氢钾和硫酸镁对GSH生物合成的影响 GSHconcentration DCW GSHcontent 30 谷胱甘肽发酵的营养条件正交优化试验 表2 2L16 45 正交试验因素水平表 31 表2 3正交试验数据及BP神经网络处理结果 32 图2 6正交试验结果直观分析 GSHconcentration DCW GSHcontent 以提高GSH产量为目的 即Y2最大化 通过直观分析图获得的较优化的营养条件组合为A2B3C2D4E2 即葡萄糖浓度30g L 1 NH4 2SO4浓度4g L 1 尿素浓度4g L 1 KH2PO4浓度3g L 1 MgSO4浓度0 25g L 1 这与BP神经网络预测的结果是一致的 33 环境条件对谷胱甘肽发酵的影响 图2 7环境条件对C utilisWSH02 08细胞生长及GSH合成的影响 GSHconcentration DCW GSHcontent 34 C utilisWSH02 08生产谷胱甘肽的摇瓶发酵过程 图2 8C utilisWSH02 08摇瓶发酵生产GSH过程曲线 Residualglucose pH GSHconcentration DCW GSHcontent 35 摇瓶分批补糖方式对谷胱甘肽发酵的影响 表2 4摇瓶中不同补糖方式对GSH发酵的影响 36 本章小结 1 确定了C utilisWSH02 08发酵生产GSH培养基的营养成分及其浓度组合 2 以实现细胞的高产和GSH的高合成为目标 获得了较优的环境条件组合 3 摇瓶发酵结果表明 DCW最大值达9 0g L 1 GSH最大浓度208 3mg L 1 胞内GSH含量2 35 4 总糖浓度固定的情况下 适当的补糖策略对GSH的合成有一定的促进作用 37 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件 谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 38 溶氧对谷胱甘肽分批发酵的影响 图3 1不同搅拌转速下发酵过程的溶氧变化趋势1 350r min 1 2 300r min 1 3 250r min 1 4 200r min 1 39 图3 2不同搅拌转速下的GSH分批发酵过程 200r min 1 250r min 1 300r min 1 350r min 1 40 不控制pH的谷胱甘肽发酵过程 图3 3不同pH控制方式下GSH发酵过程曲线 glucose DCW extracellularGSH intracellularGSH pH totalGSH intracellularGSHcontent PanelA C nopHcontrol PanelD F pH5 5 发现低pH培养环境下 产朊假丝酵母胞内合成的GSH大量向胞外渗漏 41 控制恒定pH时的谷胱甘肽发酵过程 图3 4不同恒定pH条件下GSH发酵各过程参数比较 DCW PGSH qP GSHcontent GSHconcentration YX S YP S 42 基于动力学模型解析pH对谷胱甘肽发酵的影响 表3 2不同pH下GSH分批发酵动力学参数模拟结果 KI表示底物浓度对细胞生长的抑制程度 且KI值越高则抑制效应越低 43 图3 5不同pH条件下GSH合成能力及细胞生长比较pH为5 5时GSH总量达到最大 从动力学角度分析 是因为在这一pH下兼具了KI值高 底物对细胞生长的抑制效应小 值低和 值高 细胞生长过程中和生长结束后均可保持较高的比GSH合成速率 的特点 为直线斜率 表示在 相同的条件下 细胞合成GSH能力的强弱 为截距 反映生长停止后 0 细胞继续合成GSH能力的高低 44 不同温度下的谷胱甘肽发酵过程分析 图3 6不同温度条件下GSH发酵过程及动力学参数随时间变化情况 andcurve1 32 C andcurve2 30 C andcurve3 28 C andcurve4 26 C andcurve5 24 C 45 表3 3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较 46 细胞生长动力学模型及其参数估计 表3 4不同温度下细胞生长动力学参数模拟结果 47 谷胱甘肽合成动力学模型及其参数估计 表3 5不同温度下GSH合成动力学参数模拟结果 48 图3 7温度对C utilisWSH02 08细胞生长动力学参数的影响及其模拟 不同温度和葡萄糖浓度下的细胞浓度随时间变化情况 49 图3 8C utilisWSH02 08细胞生长动力学模型的验证A Temperature29 C initialglucoseconcentration28 3g L 1B Temperature30 C initialglucoseconcentration33 2g L 1 50 分阶段温度控制策略的提出与实现 表3 8不同温度下分批发酵8h前后的平均比生长速率和平均比GSH合成速率比较结果 51 图3 9分阶段温度控制策略下的GSH发酵过程曲线 Glucose GSH DCW 52 表3 3不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较 53 本章小结 1 在满足细胞生长的范围内 溶氧对胞内GSH含量影响不大 在葡萄糖浓度为30g L 1且通气量1 2vvm的情况下 将搅拌转速恒定在300r min 1即可满足细胞生长和GSH合成对溶解氧的需求 2 不控制pH时 发酵液pH迅速下降 至pH1 5时胞内合成的GSH开始向胞外渗漏 最终DCW和GSH产量比pH5 5时的发酵结果分别低27 和95 且GSH的胞外渗漏量约占GSH合成总量的50 3 在pH4 0 6 5范围内 pH5 5时最有利于GSH的合成 从分批发酵动力学角度进行分析 解释了pH对细胞生长和GSH合成的影响这一生理学现象 54 4 在24 C 32 C范围内 较高温度对C utilisWSH02 08细胞生长有促进作用 而较低温度更有利于GSH的合成 5 根据细胞生长动力学参数 得到24 C 32 C范围内GSH分批发酵过程中细胞浓度同温度以及底物浓度之间的一般关系式 验证实验结果表明 该模型在24 C 32 C范围内可用于预测不同温度下的细胞生长情况 6 提出分阶段温度控制策略 发酵起始温度30 C 8h后切换至26 C并保持到发酵结束 结果表明 分阶段温度控制策略的实施可以进一步提高GSH的合成能力 其中GSH产量分别比在26 C和30 C时提高了5 和23 而胞内GSH含量更是高达2 61 因此 该策略具有很好的实用性 55 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学 流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 56 初糖浓度对谷胱甘肽分批发酵的影响 图4 1不同初糖浓度下的GSH发酵过程 17 2g L 1 25 2g L 1 33 2g L 1 41 8g L 1 49 9g L 1 57 表4 1不同初糖浓度下的GSH发酵过程参数比较 58 分批补料培养生产谷胱甘肽的发酵过程 图4 2分批补料培养方式下的GSH发酵过程 Glucose DCW GSH GSHcontent 59 恒速流加发酵对谷胱甘肽生产的影响 图4 3葡萄糖恒速流加下的GSH发酵过程 Glucose DCW GSH GSHcontent A B 4 2g L 1 h 1 C D 5 0g L 1 h 1 E F 6 4g L 1 h 1 60 指数流加发酵对谷胱甘肽生产的影响 图4 4葡萄糖指数流加培养下的GSH发酵过程 Glucose DCW GSH GSHcontent 61 不同培养方式下谷胱甘肽生产情况比较 表4 2不同培养方式下细胞生长和GSH合成过程参数比较 aFed batch 1 2 3 wererepresentativeforglucosefeedingatconstantrateof4 2g L 1 h 1 5 0g L 1 h 1and6 4g L 1 h 1 respectively whileFed batch 4 wasrepresentativeforthecultivationmodeofglucosefeedingataexponentialrate bqPreferstospecificGSHproductionrate 62 本章小结 1 不同葡萄糖浓度下的实验结果表明 仅通过分批培养难以实现细胞和GSH高产量 高得率和高生产强度的有机统一 2 分批补料 恒速流加和指数流加等几种培养方式都可以实现酵母细胞和GSH的高产量 其中指数流加还可以同时提高细胞和GSH的生产强度 经过48h的指数流加培养 DCW达到40 9g L 1 GSH产量和胞内GSH含量均达到最大值857 2mg L 1和2 25 63 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽 前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 64 L 谷氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5 1L 谷氨酸的添加对GSH发酵的影响 0h 6h 12h 16h 65 甘氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5 2甘氨酸的添加对GSH发酵的影响 0h 6h 12h 16h 66 L 半胱氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5 3L 半胱氨酸对GSH摇瓶发酵的影响 0h 4h 8h 12h 16h 67 分批发酵中L 半胱氨酸对谷胱甘肽过量合成的作用 图5 4L 半胱氨酸对分批发酵过量合成GSH的影响 Glucose DCW GSH Residualthiols Totalthiol GSHcontent A B 添加8mmo L的L Cys C D 添加16mmo L的L Cys 68 流加发酵中添加L 半胱氨酸促进谷胱甘肽的合成 图5 5L 半胱氨酸对流加发酵培养生产GSH的影响 Glucose DCW GSH Residualthiols Totalthiol GSHcontent 69 L 半胱氨酸对不同培养方式下GSH生产影响的比较 表5 1L 半胱氨酸添加对不同培养方式下GSH合成的影响 aAverageqPherereferstotheaveragespecificGSHproductionrateafterL cysteineaddition bAverageqPherewasrepresentativefortheaveragespecificGSHproductionrateofthewholeprocess 70 本章小结 1 L 谷氨酸和甘氨酸在细胞不同生长阶段的添加对GSH发酵过程并无太大的影响 L 半胱氨酸虽然对细胞生长有抑制作用 但可以大幅度提高GSH产量和胞内GSH含量 2 对于分批发酵来说 在L 半胱氨酸添加前后 GSH的合成量约各占总量的50 对于流加发酵 最终GSH产量可以高达1150mg L 1 3 总体上来看 L 半胱氨酸对GSH发酵的影响主要表现在GSH产量和胞内GSH含量提高的幅度上 以及添加前后GSH平均比合成速率变化的差异上 71 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用 谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 72 代谢工程的概念起源于上世纪90年代初 实质是对细胞代谢通量及其控制进行定量分析 并对代谢进行合理改造 以最大限度提高目的代谢产物的产率 涉及生理学 分子生物学 生物化学及生物途径工程学等多门学科 常用的定量方法有代谢控制分析 代谢通量分析 生化系统理论 途径分析 控制论模型等 代谢通量分析模型 MFA 是代谢工程基础研究中最主要的计算代谢途径中各物质通量的手段 MFA假定细胞内的物质 能量处于拟稳态 在测定胞外代谢物浓度和菌体组成的基础上 根据物料平衡和已知的代谢途径计算细胞内的代谢通量 代谢工程的基本知识 73 图6 1C utilisWSH02 08分批培养合成GSH的代谢网络结构模型 74 代谢通量的计算 代谢通量分析 MFA 最主要的基础是拟稳态假设 采用化学计量方程对各代谢物的质量平衡进行计算 A r X 计算原则1 矩阵A中元素的确定遵循 反应为负 生成为正 和 1C mol基准 原则 2 代谢物通量都是以消耗葡萄糖的比速率为基准的相对碳摩尔通量 葡萄糖的摄入 r1 以100计 75 图6 2GSH分批发酵第一阶段的代谢通量分布 0 6h 76 图6 2GSH分批发酵第二阶段的代谢通量分布 6 14h 77 5 6 图6 2GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布 14 30h 78 5 3 图6 3分阶段温度控制策略下GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布 79 5 0 图6 4L 半胱氨酸添加后GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布 80 本章小结 1 分析了C utilisWSH02 08细胞生物合成GSH的代谢网络 发现在分批发酵前期 HMP途径代谢活跃 为细胞的生物合成提供足够的NADPH 在发酵中后期 EMP途径和TCA循环代谢加强 产生更多的NADH和FADH2进入呼吸链被氧化而产生ATP以供给细胞代谢维持的需要 2 温度的切换 30 C 26 C 使更多的NADPH参与到CYS的合成成为可能 而经过SER进入CYS碳通量的增加 直接的结果是流向GC和GSH碳通量的增加 因而提高了GSH的产量 3 L 半胱氨酸的添加使HMP途径近似于关闭 碳通量直接进入EMP途径和TCA循环 同时外加的L 半胱氨酸使经过CYS的碳通量大增 最终GSH产量提高将近1倍 81 产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽的营养及环境条件谷胱甘肽分批发酵生产及其动力学流加发酵法生产谷胱甘肽前体氨基酸在谷胱甘肽过量合成中的作用谷胱甘肽分批发酵过程代谢网络分析 表面活性剂对谷胱甘肽胞外积累的影响 82 表面活性剂对细胞生长的影响 图7 1不同类型表面活性剂对细胞生长的影响 83 低浓度离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响 图7 2低浓度离子型表面活性剂对GSH合成的影响 IntracellularGSH ExtracellularGSH TotalGSH GSHcontent 84 高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响 图7 3高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响 ExtracellularGSH IntracellularGSH DCW GSHcontent TotalGSH TGSH DCW8h 16h 24h 85 非离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响 图7 4非离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响 IntracellularGSH ExtracellularGSH TotalGSH TGSH DCW 0h 16h 86 本章小结 1 离子型表面活性剂SDS和CTAB对酵母细胞生长存在临界浓度现象 醚类非离子表面活性剂Brij30只有在高浓度时才对细胞生长产生部分抑制 而酯类非离子表面活性剂Tween80对细胞生长几乎没有负面影响 2 低于临界浓度的离子型表面活性剂影响了酵母细胞的GSH合成能力 但不能促进GSH向胞外积累 高于临界浓度时 对于培养后期的酵母细胞内GSH的胞外分泌具有积极的作用 3 Brij30在一定浓度下对细胞生长和GSH合成表现出与离子型表面活性剂相似的特点 但对GSH的胞外积累贡献不大 Tween80对GSH发酵过程以及酵母细胞合成GSH的能力几乎没有影响 87 结论 1 以C utilisWSH02 08作为微生物发酵法生产GSH的出发菌株 在单因素实验的基础上 采用L16 45 正交表安排发酵培养基中各营养组分及其浓度的正交优化试验 结合BP神经网络的预测 得到以提高GSH产量为目标的营养条件组合为 葡萄糖30g L 1 NH4 2SO44g L 1 尿素4g L 1 KH2PO43g L 1 MgSO40 25g L 1 进一步获得了GSH摇瓶发酵较优的环境条件组合为 初始pH6 0 装液量50mL 500mL 接种量10 2 在C utilisWSH02 08发酵生产GSH的摇瓶培养过程中 26h时DCW达最大值9 0g L 1 28h时GSH积累至最大浓度208 3mg L 1 胞内GSH含量2 35 在总糖浓度固定的情况下 合适的摇瓶补糖方式对GSH合成具有促进作用 最多可以提高GSH产量约10 胞内GSH含量也高达2 52 88 3 在7L搅拌式发酵罐中进行C utilisWSH02 08分批培养生产GSH 搅拌转速对胞内GSH含量影响较小 因此 当葡萄糖浓度为30g L 1且通气量控制在1 2vvm时 搅拌转速只要不低于300r min 1即可满足细胞生长和GSH合成对溶解氧的需求 4 不同pH控制方式对GSH分批发酵的影响有较大差异 不控制pH时 不仅会引起发酵后期GSH向胞外渗漏 而且最终DCW和GSH产量均比恒定pH条件下的结果低 通过对pH4 0 6 5范围内的各GSH分批发酵过程参数