环境生物技术2(3)-现代生物技术与环境污染治理(司)

环境生物技术 主讲司万童电 mailsiwt02 污染治理生物技术 第二章现代生物技术在环境污染中的应用 现代生物技术概况基因工程与环境污染治理细胞工程与环境污染治理酶学工程与环境污染治理发酵工程与环境污染治理生态工程与污水处理系统 第一节现代生物技术概述 一 生物技术生物技术 Biotechnology 是指利用生物有机体或组成部分发展新产品或新工艺的一种技术体系 基因工程 核酸的分离 提取 体外剪切 拼接重组以及扩增与表达等技术 细胞工程 细胞的离体培养 繁殖 再生 融合 细胞核 质 器的移植改建 酶工程 利用酶的特异催化功能 借助固定化 生物反应器等新技术生产特定产品的技术发酵工程 为微生物提供最适宜的发酵条件 生产特定产品的技术 生物技术 生物技术的依据和出发点 生物在生长 发育与繁殖过程中进行物质合成 降解和转化的能力 生物技术的核心基础是基因工程和细胞工程 优越性 不可取代快速 精确低耗 高效副产物 副作用小安全性好 二 现代生物技术的发展 目前发达国家中经营石油 化工 医药 酿造和种子等产业的公司无一例外地都竞相开展生物技术的研究和发展生物技术产业 我国生物技术目前发展的重点 为进一步发展农业培育高产优质和抗逆的动植物新品种 为防治严重疾病研制新型疫苗和药物 为医药 食品化工和农业生产开辟新途径开发蛋白质工程技术 7 1 2 现代生物技术在环境科学中的应用前景 环境生物技术就是应用于认识和解决环境问题过程的生物技术体系 包括对环境污染效应的认识 环境质量评价和环境污染的生物处理技术等 生物技术最早应用于环境污染治理的是利用农业废物沤制堆肥 废水生物处理主要方法 活性污泥法已经过80余年的历程 第二节基因工程与环境污染生物治理 7 2 1 基因工程分子生物学基础 回顾 遗传物质分子 脱氧核糖核酸DNADNA是由大量的脱氧核糖核苷酸组成的生物大分子 可变部分是其碱基序列 嘌呤和嘧啶碱基携带遗传信息 糖和磷酸基则起结构作用 四种碱基 腺嘌呤A 鸟嘌呤G 胸腺嘧啶T 胞嘧啶C 回顾 基因基因是DNA分子上的一个特定的片段 不同基因的遗传信息有各自片段的碱基排列顺序所决定 基因通过转录出的信息是核糖核酸指导mRNA合成特定的蛋白质 使基因的以表达 完成特定的生命活动 7 2 2 基因工程的基本过程 一 基因工程的工具酶要进行基因片段的剪切和拼接 首先需要能在特定位置上切割DNA分子的限制性内切酶核能将DNA片段连接在一起的DNA连接酶 每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列 并在其中特定的切点上切割DNA分子 把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切 然后让两者的末端粘起来 在用DNA连接酶将其连接起来 就可以组成重组DNA分子 二 基因工程载体要将一个外源的基因送入受体细胞 需要有运输工具 这就是载体 常用载体有 质粒 噬菌体 动植物病毒 质粒是基因工程最常用的载体 农杆菌质粒 1 首先由于其上有某一限制酶的单一切点 用同种酶切断的外源DNA片段插入该质粒的切口 就组成了重组DNA分子 2 其次由于质粒上有选择性标记 可以根据受体细胞是否具有该种标记来判断受体细胞是否获得了该重组质粒 因此质粒在基因工程中得以广泛应用 三 目的基因的分离1 从基因组直接分离目的基因常用鸟枪法 用限制酶将某种生物的DNA切成片段并分别加入载体 对受体细胞进行转化 让外源DNA所有的片段都在宿主细胞中大量扩增 在筛选出有目的基因的转化细胞 该法有一定的盲目性 工作量大 2 酶促合成法将真核细胞基因转录的全部RNA提取出来 在体外经反转录酶的作用 生成与mRNA互补的DNA 即cDNA 再将cDNA酶切后载入载体 建立cDNA文库 筛选出目的基因 或对已知核苷酸顺序的目的基因 通过聚合酶链反应 PCR 技术直接合成 四 目的基因与载体的重组工艺用同一种限制酶切割含有目的基因的外源DNA和载DNA 产生相同的粘性末端 在DNA连接酶的作用下 形成完整的重组DNA分子 五 将目的基因导入受体在体外完成的DNA的重组后 一般将重组的DNA分子导入受体细胞让目的基因在受体细胞中表达 基因工程中常用的受体细胞是大肠杆菌 枯草杆菌 酵母菌和动植物细胞 六 对目的基因的筛选和检测将目的基因在入载体 导入受体细胞后 必须对目的基因进行检测 确认细胞中以摄入重组的DNA分子 检测方法一般有遗传学方法 原位杂交法和免疫学方法 七 目的基因在受体细胞中的表达目的基因在受体细胞中的表达 受到许多因素的表达 目的基因的阅读框架必须与载体DNA的启示密码相吻合 要有适当的启动子保证目的基因的正确转录 基因的蛋白产物有时还需要经过修饰和加工才能成为有活性的功能蛋白 7 2 3基因工程在环境生物处理中的应用 应用基因工程菌处理污染物的主要优势 集中与创造与目的基因 提供综合性代谢新污染的通路和杂种细胞 提高代谢通路结构基因的表达 针对新的污染物 改变表达的调节方式 控制降解途径的限制性步骤 提高分解代谢酶的合成或其他生化反应过程效率防止有毒污染物的产生 防止非需要产品的出现 用确定的基因实现最初的目的 主要应用 环境监测 DNA探针 抗病毒植物育种 减少农药使用量 螟虫水稻 降解卤代芳烃的基因工程菌分解尼龙寡聚物的基因工程菌分解多糖的基因工程菌抗金属基因工程菌除草剂降解基因工程菌杀虫剂降解基因工程菌 基因工程在环境保护中的应用 科技的发展充分证明基因工程是环境保护的理想武器 这一技术在解决环境问题过程中所显示的独特功能和显著优越性充分体现在它是一个纯生态过程 从根本上体现了可持续发展的战略思想 基因工程在处理环境污染物方面具有速度快 消耗低 效率高 成本低 反应条件温和以及无二次污染等显著优点 在石油污染方面 水和土壤污染方面 农药方面 温室效应方面 有毒有害物质的降解 清洁可再生能源的开发 等环境保护的各个方面 发挥着极为重要的作用 石油污染方面2 水和土壤污染方面3 在温室效应方面4 在农药方面 1 石油污染方面 随着石油工业的迅速发展石油这种含有多种烃类的混和物 不断对陆地与海洋造成污染 而烃类是难分解的物质 某种特定的细菌只能降解有限的几种石油成分 对其他成分却不能分解 1975年美籍印度人查克拉搏特等科学家依据似单胞杆菌对石油中有毒成分具有很强分解力这一特性 把4种能吃浮油的假单胞杆菌的基因拼接起来 合并成一种假单胞菌种 组成了所谓的 超级菌 它能分解各种石油烃 消除浮油的效率高 速度快 只需几小时就能除掉自然菌种需几年才能消除的原油污染 经不断改进 这种超级细菌已成功地用于实际环境治理中 2 水和土壤污染方面 2 1科学家依据Psenclomorlas的改良菌具有分解樟脑 水杨酸脂 萘的功能把分解甲苯基因导入活性污泥中分离出来的具有絮凝能力的菌中 就能得到具有分解甲苯和起到絮凝作用的改良菌 从而使废水中的碳氢化合物得以分解 使污泥得以沉淀 2 2目前 人们正在利用基因工程进一步解析聚磷基因和硝化基因 将这2个基因重组后导人大肠杆菌中 构建重组工程菌 从而使废水中过高的N P得到有效地去除 降低水体的富营养化 减少赤潮发生 科学家已经用基因工程方法培养出了 吞噬 汞和降解土壤中DDT的细菌 以及能够净化镉污染的植物 DDT细菌 2 3美国加利福尼亚大学的微生物学工作者培育出了一种以PCBs 聚氯联苯 为食物的细菌 PCBs是一种污染环境的致癌物质 它不能被一般的自然过程破坏 这种从实验室中培育成的细菌被认为是有效解决这一难题的工具 该大学的研究人员是将一种一般土壤细菌 恶臭假单胞菌 的两个菌株的DNA进行交换 产生一种杂交的突变菌株 该基因交换菌株能破坏联苯基 而联苯基正是构成PCBs分子的一个关键基因 它由两个苯环组成的 有剧毒 在它们紧密结合时便成为潜在的致癌物 日本的学者从土壤中培养出了两种酵母菌 一种是红酵母属菌株 另一种是蛇皮癣菌 实验证明前者可分解40 的多氯联苯 后者可分解30 的多氯联苯 大量培养可以用来处理工业废水和土壤中的多氯联苯 美国的学者利用灰氧菌来吞噬多氯联苯 效果较显著 PCBs进入人体后 不能被人体的新陈代谢过程破坏 且能传给下一代 这种物质也能长期保存在土壤中不会被分解 新培育出的这种两个菌株的遗传物质发生交换的突变菌株则能分解PCBs 可使这种有毒害的物质变成无害的物质 水 二氧化碳和盐类 用植物净化被污染的水体和土壤等技术被学者们称为 植物修复环境技术 日本科学工作者在对大约3000种植物进行调查研究后发现 颠茄这种植物有吸收和分解污染源物质多氯化联苯的能力 在此基础上他们对该植物进行转基因处理 即把加速根部生长的功能基因导入颠茄细胞中 培育出了生长速度快 根部发达的重组基因颠茄 从而大大提高了其吸收和分解污染物质的能力 生产实践表明 严重超标的工厂废水能够被它吸收80 以上 转基因技术育出环保猪 在国际上 如北美 欧洲和亚洲的一些国家和地区 都有这样一种规定 如果猪粪中磷的平均含量能够降低35 从规定要求来说 养猪户就能够多养35 的猪而不会违反环保规定的要求 WHY 转基因猪 肌醇六磷酸 肌醇 肌醇六磷酸酶 提高饲料利用率 减少排泄 猪通常被认为是对环境有危害的家畜 它排泄的粪便中含有磷元素 能促使藻类生长 使水域很快形成富营养化状态 会造成河流 湖泊污染 并会使鱼类缺氧而大量死亡 加拿大安大略省古尔弗大学的科学工作者利用基因工程技术培育出了一种猪 其粪便中的含磷量比普通猪少20 50 这种基因工程猪是把老鼠和一些细菌的基因转导到猪的DNA中培育成的 这个规定的唯一根据就是猪排泄到地下水中的磷含量 加拿大科学家的这项研究成果对国际上的养猪业起了很大的促进作用 对促进环境保护有强有力的作用 用 基因剪切 酶接 培育成功抗放射性核废物细菌 该项研究利用了一种耐放射性异常的土壤细菌 这种细胞已被确认为抗放射性能力最强的微生物 它的生理特性是够修复自身的DNA 从而使其机体在不断遭受放射性物质攻击的情况下仍能生存下来 不仅如此 这种细菌还含有一种能分解化学物质的功能基因 在这一发现的基础上 研究者又将其他 版本 的功能基因剪切 酶接到该细菌体内 从而使这种基因工程微生物进一步具备了分解甲苯 氯苯 三元低共溶氯化物等放射性化学物质和其他有毒化学物质的功能 一批科学家试图查清位于佐治亚州Savanna River地区的一处核废料堆积场的放射性强度时 他们意外地在测量仪器的探头上发现了一些不知何时粘上的橙黄色粘稠透明物质 在外形上非常像浆果 科学家们称其为Kineococcus 目前 这中细菌95 的基因都已被破解 然而研究人员至今也未弄明白为什么它们会具有如此顽强的生命力 通常情况下 强烈的射线会破坏掉生物的基因结构 但它们似乎对Kineococcus一点作用也没有 到现在为止 科学家们已发现了大约10种与Kineococcus类似的超级生物 其中 第一种于1956年在俄勒冈州被发现 它已被命名为Deinococcus 不过遗憾的是 尽管第一种被发现的超级细菌Deinococcus能够承受很强的辐射 但它们却并不以核废料堆积场中存在的大量有毒化学物质为食 为此 美国能源部在1997年时开始着手对其进行基因改良 现在 改良后的Deinococcus已基本达到了能源部的相关要求 但美政府非常担心将它们释放到自然界后可能造成的不良后果 植物植物除了通过转化作用将所吸收的有机污染物转化成无毒的其它有机物外 也可以通过降解作用使其分解为无毒的小分子化合物 最理想的方式是将大分子的有机化合物经生物降解转化成H2O和CO2 杨树在人工控制的现场实验中能够去除湿地中99 的三氯乙烯 Newman等1999 热带豆科树木Leuceanaleticocephalavar K636能降解EDB 二溴乙烷 和TCE 二氯乙烯 Doty等2003 3 在农药方面中的应用 微生物农药基因工程技术的发展 为防治农林害虫提供了有效的新技术手段 微生物农药因此在世界范围受到广泛重视 微生物农药是指非化学合成 具有杀虫防病作用的微生物制剂 如微生物杀虫剂 杀菌剂 农用抗生素等 这类微生物包括杀虫防病的细菌 真菌和病毒微生物杀虫剂对人畜安全无毒 不污染环境 杀虫作用具有一定的特异性和选择性 不会致死天敌和非目标昆虫 易和其他生物手段结合综合防治害虫 维持生态平衡 由于杀虫活性蛋白的多样性 昆虫产生抗性较缓慢 可以通过发酵法生产 生产成本较低 可以通过基因工程技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产应用的需要等 用昆虫毒素基因制杀虫剂取得成功美国犹他公司的基因工程研究人员从蜘蛛体内发现并成功分离出了毒素基因 他们运用转基因工程技术将毒素基因导入一种侵染毛虫的病毒中 获得了表达 当毛虫这种害虫吞下了这种转基因病毒 该基因随至侵染细胞 继而杀死毛虫 检测和进一步实验表明 用该基因工程技术制成的杀虫剂 不仅杀虫效果明显 而且具有高度的专一性 对植物及其他动物无任何危害 在这项基因工程成功试验的启迪下 阿森斯的佐治亚大学又成功地从螨虫中得到了生产毒素的基因 英国牛津自然环境调查研究理事会 NERC 的病毒学和环境微生物学研究所与美国戴维斯的加利福尼亚大学使用的蝎子毒素基因 通过基因工程生产出的杀虫剂 具有极好的杀虫效果 特别是它不会对环境产生污染 基因工程作物可以不施肥或少施肥墨西哥科技工作者路易 海勒 易切拉用转基因工程技术进行作物改良并取得了良好的成效 他将一种产生柠檬酸的功能基因导入生长在碱性土壤中的烟草 然后进行少施肥和不施肥的实验 结果均有明显的增产效果 分别增产30 和20 该课题组在研究报告中指出 运用此基因工程后 作物只用普通作物的一半肥料就能取得最好的长势和增产效果 易切拉小组还为水稻和玉米进行了转基因实验 初步结果表明其效果更为显著 4 在温室效应方面 转基因技术还可以提高替代化石燃料的生物燃料的产量 国际能源机构 IEA 于2011年4月21日发布路线图指出 到2050年 生物燃料有望提供世界总的运输燃料需求量的27 尤其将会对柴油 煤油和喷气燃料替代作出贡献 这将使生物燃料的使用从目前5500万吨石油当量 占运输燃料2 增加到2050年7 5亿吨石油当量 当生产实现可持续性时 预计使用生物燃料可望每年避免约21亿吨的二氧化碳排放 有效的控制了温室效应的发展 温室效应带来的气候变化的最大影响之一是全球降水重新分配 一些地方的旱情将会更加严重 而应对这种危机的最重要方法就是培育能够抗旱 减少用水量的作物 转基因方法可以把其他生物的基因转到作物中 从而达到很好的抗旱效果 孟山都公司的抗旱玉米 MON87460 主要是转入了土壤中常见的细菌枯草杆菌 Bacillussubtilis 的一个基因序列 产生一种叫 冷激蛋白B CspB 的蛋白质 可以让它在缺水的情况下仍然能够保持机体结构不被破坏 现在该玉米已经在美国和智利试验种植并获得美国法规监管部门 美国农业部 美国食品与药品管理局 的批准 如果抗旱转基因玉米大量种植 和非抗旱品种相比预计能够增产30 同时 转基因玉米商业化种植之后 其种子不会比传统玉米贵很多 另外 正在研制之中的提高作物的氮肥合用效率 改善植物光合作用效率等转基因技术也可以大幅增加粮食产量 减少碳排放 减少砍伐森林的可能性 基因工程在环境保护中的前景 随着工业发展 人口高度密集环境中有毒有机污染物的数量 品种越来越多 原有的治污手段满足不了现实的需要 利用基因工程的手段将人们希望的遗传基因转入易培养的微生物体内 得以表达识别 使其起到净化环境的特殊功能 最大限度地消除环境污染 尚需做大量的研究工作 研究利用基因工程 使禾本科作物本身具有固氮能力 这样就可以大大降低化肥的生产和使用 从根本上消除化肥的污染 利用光合细菌许多种类在代谢过程中都能释放氢气的特点 利用基因工程开发生物制氢新能源 供车辆和机械发动机用 这样不仅节约了能源 还减少了煤 石油等燃料不完全燃烧时对大气环境造成的污染 根据一些藻类等水生物植物具有从水环境中大量积累重金属离子的能力 利用基因工程消除水体中重金属的污染 研究生产甲烷的基因 提高甲烷发酵的效率 解决甲烷发酵反应速度慢 时间长 需用大反应容器进行储存的难题 继续构建系列基因工程菌 筛选出絮凝 降解性能好 遗传特性好和成本低的系列双功能基因工程菌株 并将该技术应用于染料生产废水的处理或其他领域 采用基因工程的方法建立无害化生产工艺过程 实现废水循环利用 同时将部分无毒有机污染物转化为副产品 如单细胞蛋白 生物农药等 充分实现废物资源化 通过基因重组构建新的杀虫剂 以取代生产过程中耗能多 又易造成环境污染的农药 并试图通过基因工程的方法回收和利用工业废物 基因工程技术的掘起 为技术进步增添了新的活力 为解决资源短缺 生态破坏等全球性环境问题带来了新的曙光 为21世纪的环境保护展现出绚丽多彩的应用前景 因此 随着人们对基因的深人研究和对遗传密码的破译 基因工程定会在各个领域发挥越来越显著的作用 基因工程在环境保护中的展望 基因工程技术是发展迅速的一项污染环境治理技术 实践证明 采用基因工程技术治理污染环境 可以最大限度地去除环境中的污染物 是保障可持续发展的一项最有力的措施 随着基因工程菌的出现 基因工程技术将不断应用于更多的污染环境的治理工程中 培养出新的特效物种并进一步提高其应用效率 降低应用成本 运用各种相关技术加以优化组合 尤其是高效 低能耗 易普及的特种微生物与特殊工艺的最佳结合 加强不同专业 不同学科之间的合作 如将毒理学和微生物学和环境工程学相结合 从根本上消除污染源 充分协调人与自然之间的关系 充分实现废物资源化 引入DNA扩增和其它生物技术的环境监测方法等将是基因工程技术研究的侧重方向 基因工程技术作为一种新兴技术以极快的速度发展 以下两方面的研究将对环境保护有着重要意义 一是对基因工程菌的深入研究 如基因工程菌对污染物的代谢途径 控制目的基因表达的启动子基因序列 降解基因表达的调控条件的优化等方面的研究 二是对环境中微生物的习性及基因工程菌与环境中微生物和污染物之间的相互作用进行研究 从而使基因工程菌在治理有机物污染方面的实际应用成为可能 目前的研究主要是利用单一的基因工程菌对污染物进行处理 随着研究的不断深入 利用多种基因工程菌相结合对污染物进行处理 将对环境保护起到更为重要的作用 第三节细胞工程与环境污染生物处理 1 细胞工程细胞工程是将细胞或原生质体在离体条件下进行培养 繁殖和精细的人工操作 使其某些特性人为地发生改变 从而达到生产生物制品及其组分 改良生物品种或创造新物种的目的 一 基本概念 迄今为止 人们已经从基因水平 细胞器水平以及细胞水平开展了多层次的大量工作 在细胞培养 细胞融合 细胞代谢物的生产和生物克隆等诸多领域取得一系列令人瞩目的成果 其中代表细胞水平的细胞工程研究也显示其巨大的应用前景 1838 哈泊兰德预言了植物细胞的全能性 1907 美国哈里森培养了蛙胚神经组织 1934 荷兰温特发现生长素 1960 英国诺丁汗大学科金教授使用酶解方法从番茄幼苗根部制备得到大量原生质体 二 细胞工程的发展历史 1972 美国卡尔森等用NaNO3为融合诱导剂 将来自不同种的烟草原生质体进行融合 获得世界上第一个体细胞杂种植株 1977 英国胚胎工程技术 首例试管婴儿 1997 多莉克隆羊 2001 首例克隆猪 动植物细胞与组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 三 主要研究内容 优质植物快速培育与繁殖 动物胚胎工程快速繁殖优良 濒危品种 利用动植物细胞培养生产活性产物 药品 新型动植物品种的培育 供医学器官修复或者移植的组织工程 转基因动植物的生物工程反应器 在遗传学 发育学等领域的理论研究 在能源 环保等领域的应用 四 细胞工程重要应用 2 原生质体融合是指将两个亲株的细胞壁分别通过酶解去除 然后在高渗条件下使两原生质体融合 从而获得发生了基因重组融合子的过程 3 原生质体技术包括原生质体制备 培养 融合 再生 原生质体转化等过程 优点是将两亲本的整个基因组强迫性混杂在一起 为异源DNA片段交叉互换创造一个优良的环境 4 原生质体制备制备原生质体过程一般采用酶解法细菌等微生物没有坚固的细胞壁 而且细胞外周的化学成分因种属不同而差异甚远 但制备原生质体过程一般也采用酶解法 酵母菌原生质体制备一般取对数生长早期的细胞 菌悬液浓度为107个 mol 在高渗缓冲溶液中用蜗牛酶处理去壁 此外 对酵母细胞进行酶解处理前 用某些含巯基化合物如 巯基乙醇进行预处理可以松动细胞壁结构蛋白 有利于酶解 对于原核生物中的革兰氏阳性菌 制备原生质体时应针对不同的种属采用不同的溶菌酶浓度处理 革兰氏阳性菌细胞壁较厚 约20 80nm 肽聚糖含量丰富 有15 50层 小球菌属只需用1 g ml 枯草甘菌属则需要高达50 g ml 有时还需要加一定浓度的青霉素 丝状真菌一般采用含葡萄糖苷酶 几丁质酶 纤维毒素酶及果胶裂解酶复合物处理 以6mol LMgSO4作为原生质体稳定剂 曲霉属 有人推荐使用Bacil luscirculanIAM1165酶和几丁质酶处理 用含有0 8mol L山梨醇 0 6KCL及0 8Mininol做原生质体稳定剂 再生频率大于30 5 促融因子常用的有聚乙二醇 PEG 及Ca2 作为促融剂 细菌一般用30 50 m V PEG 同时可加入Ca2 和DMSO进一步促进融合 时间仅需1min 真菌则采用25 30 高相对分子质量的PEG pH9 0较好 同样Ca2 可提高融合效率 PEG用于细胞融合中的优点为 通用性强 可用于动 植物和微生物各种细胞 缺点是 有效浓度范围较窄 50 55 但此时对细胞较毒 不能在显微镜下观察到细胞的融合过程 诱导产生杂交细胞的频率较低 约1 10 5 细胞融合技术在废水处理工程菌研究中的应用始于20世纪80年代 利用原生质体融合技术 可将多个细胞的优点集中于一个细胞内 五 细胞融合构建环境工程菌 程树培等将真核微生物酿酒酵母Y9407与原核微生物光合细菌球型红假单胞菌P9479的原生质体 经跨界融合构建出的融合细胞Foa和Fzl 通过链霉素和制霉菌素的抗性实验 细胞形态学观察 DNA含量分析和对捕光蛋白基因pucBA进行聚合酶链反应 证实该细胞为真正的融合细胞 融合细胞在耐酸耐热 絮凝性 降解效率 菌体得率多方面综合了双亲的优势 可望较好的应用于高浓度污水生物处理 第四节酶工程与环境污染生物处理 1酶学研究基础 酶是生物体内一切生物化学反应的催化剂 是生命活动的重要组成1878年 Kunne提出酶的名称 enzyme1896年 Buchner发现发酵是酶的作用的化学本质1894年 Fisher提出锁匙模型 解释酶的专一性1913年 Michaelis和Menten提出米氏方程1926年 Sumner确立了酶的本质是蛋白质酶 具有生物催化活性的特殊蛋白质 酶学研究基础 1958年 Koshland提出 诱导契合 理论 以解释酶的催化理论和专一性1961年 Monod提出 变构模型 用以定量解释酶活性的调节1969年 由氨基酸单体化学合成牛胰核糖核酸酶重组DNA技术用于酶学研究 能够通过定点突变法改变酶的催化活性和专一性 酶学研究进展 酶并不一定就是蛋白质 某些RNA也具有催化活性 酶是特殊的催化剂抗体酶 把抗体的高度选择性与酶的高效催化性进行结合酶的应用 从现成的动植物或微生物的组织或细胞中进行提取 发酵法生产 酶工业 酶工程 利用酶的催化作用进行物质转化 将酶学理论与化工技术相结合 研究领域涉及酶的生产 酶的分离纯化 酶固定化 酶反应动力学 酶反应器 酶的应用等 酶的催化特性 酶是催化剂 改变化学反应的速度 但不改变化学反应的性质 即不改变反应的方向和平衡点 反应前后酶的组成和质量不发生变化 酶是特殊的催化剂 高效率 高度专一性 活性可调节 反应条件温和 产物易纯化非酶催化反应的速度可能相差1016倍 但酶催化反应相差无几 酶可以极大地降低反应所需的活化能 多种催化因素协同作用 酶的专一性 活性可调节 一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型的反应高度的选择性绝对专一vs 相对专一酶的活性可调控 其是代谢调控的基本方式酶浓度的调节生理调节或激素调节共价修饰调节酶原的活化抑制剂的调节反馈调节金属离子和其他小分子化合物调节 酶催化反应的影响因素 最适pH 一定范围 一定条件 A 最适pH6 8 反应速率最大B 稳定pH5 8 最适温度 一定范围 多种因素 酶催化反应动力学 酶 底物浓度的影响 研究内容包括酶催化反应速度以及影响此速度的各种因素 酶反应速度与底物浓度的关系 中间产物假说1913年 依据快速平衡法推导出米氏方程1925年 依据拟稳态方法推导出Briggs Haldane方程 米氏常数的意义 Km值的物理意义 其是酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度 单位与底物浓度一致Km值是酶的特征常数之一 只与酶的性质有关 而与酶的浓度无关同一种酶对不同底物的Km值不同Km值受到pH和温度的影响对同一种酶而言 Km值最小的底物是其最适底物Km不同于Ks 酶的抑制作用 分为可逆抑制与不可逆抑制竞争性抑制 抑制剂与底物竞争和酶活性中心结合 vmax不变 Km增大非竞争性抑制 酶可同时与底物和抑制剂结合 两者无竞争作用 vmax减小 Km不变反竞争性抑制 酶只有与底物结合后 才可和抑制剂结合 vmax减小 Km减小底物抑制作用 底物抑制时的速度曲线 酶的生产及分离纯化 微生物是主要的酶源 酶源广泛 产量高 生长周期短 成本低 易管理 易提取酶必须经过纯化才可使用 一般认为黑曲霉 酵母 枯草芽孢杆菌等是安全的酶生产菌株酶生产菌的选择 不是致病菌 不产生毒素不易退化 不易感染噬菌体产量高 胞外酶原料廉价 发酵周期短 易培养 酶的分离纯化 一般包括预处理与酶抽提 粗分离 细分离 结晶等 酶分离纯化的常用方法 酶提取 生物材料的破碎 机械法 物理法 化学法 酶解法酶的提取 相似相溶 酸 碱 盐溶液 有机溶剂沉淀 盐析法 PEG沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 热处理沉淀法等层析 利用混合物中各组分的物理化学性质不同 使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离 包括凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 高效液相色谱层析等电泳 由于蛋白质分子表面电荷的差异 可用电泳方法将其分离开来 常用的区带电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电点聚焦等 酶固定化 游离酶的稳定性差 且不利于其和目标产物分离和回收利用 固定化技术应运而生固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶 其既保持了酶的活性 又可反复使用 且易于分离固定化方法包括吸附法 结合法和包埋法 固定化方法 酶反应器 以酶为催化剂进行反应所需要的设备称为酶反应器根据反应类型 动力学性质 反应器类型和流体流动状态 热传递及温度的影响 生产量和工艺流程 操作稳定性等选择适当的反应器反应器的设计目标应该达到 容积生产率高 条件易控制 耗能低 污染少 反应器加工简便 酶反应器的类型 2酶工程在环境污染治理中的应用 腈化物降解酶氨氧化酶酶在废水处理中的应用含芳香族化合物废水处理造纸废水处理含氰 腈 废水处理食品加工废水处理酶在土壤修复中的应用 2 1腈化物降解酶 腈化物是指含有腈基的有机化合物 R CN 是重要的化工原料 但其也具有强烈的生物毒性 致癌性和致突变性 因此是一种急需治理的有机污染物采金矿使用量大 腈化物酶催化转化的产物R和R 分别代表烷基和芳基 腈化物降解酶的分布及应用 包括腈化物水解酶 腈化物水合酶和酰胺酶 细菌中常见 植物和真菌中少见 可利用腈化物为唯一碳源和氮源进行代谢 微生物代谢机理尚不完全清楚已应用于腈化物的生物转化以及腈化物污染环境的生物修复等领域 腈化物的酶水解途径 腈化物的酶水解通过两条途径进行腈化物水解酶直接水解腈化物 形成相应的有机酸和氨腈化物水合酶催化有机腈水合 形成中间产物酰胺 然后在酰胺酶的作用下转化为相应的有机酸和氨 腈化物水解酶 可将腈化物直接水解成有机酸和氨是一个可溶性的金属酶 在催化活性部位含有一个非血红素铁原子或非类可啉钴原子 此外还含有相对分子质量约为23000的两个亚基 几乎都以杂四聚体形式存在一些铁类的腈化物水解酶的活性受光调节 光复活 的作用机制根据底物专一性可分为 芳香腈水解酶 杂环腈水解酶和脂肪腈水解酶 腈化物水合酶 可将腈化物转化为酰胺是含有钴和铁的金属酶可能的反应机理腈化物接近与金属结合的氢氧根离子 该离子作为亲核试剂进攻腈化物的碳原子与金属结合的氢氧根离子作为一般的碱 激活水分子 然后进攻腈化物中的碳原子 形成酰亚胺 最终重排成酰胺 2 2氨氧化酶 硝化反应是氮循环的重要步骤 氨氧化过程是其限速步骤氨氧化细菌属于专性化能自养菌 从氧化NH4 为NO2 的过程获得能量 利用CO2为碳源进行细胞合成NH4 氧化为NO2 的过程经过两个步骤氨单氧合酶 AMO 催化的反应 2H NH4 2e O2 NH2OH H2O 2H 羟胺氧化还原酶 HAO 催化的反应 NH2OH H2O HONO 4e 4H 2 3酶在废水处理中的应用 酶法处理污染物与生物法相比的优势 可以处理生物难降解化合物可以处理各种浓度污染物 尤其是低浓度有机污染物可以在各种pH 温度 盐度环境下使用不存在冲击负荷效应不存在与生物生长及其适应相关的滞后效应不产生污泥过程控制简易 含芳香族化合物废水处理 芳香族化合物 包括酚 如 激素 类激素 和芳香胺 属于优先控制污染物 很多酶可用于芳香族化合物废水处理酶具有高度选择性 能处理低浓度废水不易被有生物毒性的物质所抑制可在较大浓度范围内发挥作用停留时间较短 过氧化物酶 是微生物或植物产生的一类氧化还原酶 在过氧化物的激活下 才可用于氧化底物辣根过氧化物酶 HRP 是酶处理废水领域中应用最多的一种酶 可催化多种芳香族化合物 包括酚 苯胺 联苯胺 及其异构体等 反应产物是沉淀 易去除 pH值和温度范围较广木质素过氧化物酶 LiP 可处理很多难降解芳香族化合物和多环芳烃 酚类物质 稳定性是其应用的关键 固定化是有效方法植物来源的酶 过氧化物酶 属于另一类能够催化酚类物质氧化的氧化还原酶酪氨酸酶 也叫酚酶或儿茶酚酶 催化两个连续的反应单分子酚与氧分子通过氧化还原反应形成邻苯二酚邻苯二酚再脱氢形成苯醌 苯醌不稳定 通过非酶催化聚合反应形成沉淀 褐色 漆酶 由真菌产生 通过聚合反应去除酚类 且能同时对多种酚类产生作用 造纸废水处理 废水漂白过程中会产生黑褐色废水 且含有有毒和致突变的氯化物 辣根过氧化物酶和木质素过氧化物酶均可用于造纸废水脱色 造纸制浆和脱墨操作中产生的污染 含有大量的纤维素 可由纤维素酶 纤维二糖水合酶 葡萄糖酶等组成的混合酶系脱除并产生乙醇等有用能源物质 含氰 腈 废水处理 氰化物是新陈代谢抑制剂 具有致命危害氰化物酶能够把氰化物转化成氨和甲酸盐 一步反应硫氰化物可以通过常规废水处理工艺得到处理 但降解机理尚不完全清楚含腈废水可以通过腈化物水解酶 腈化物水合酶和酰胺酶去除 硫氰化物水解酶的可能作用机理 食品加工废水处理 易于分解或转化为饲料等经济价值产品蛋白酶 水解酶 可水解蛋白质得到营养饲料 在鱼肉加工工业废水中得以广泛应用淀粉酶 多糖水解酶 将多糖转变为单糖 可用于发酵产酒精等 可用于大米加工等含淀粉废水处理 淀粉酶和葡萄糖酶还可用于光降解和生物降解塑料的生产脂酶 用于脂类物质 三酰甘油酯 的转化 可用于水 有机两相反应 可用于被污染环境的生物修复及废物处理 如石油泄漏 餐饮废物等 废水酶处理的注意事项 酶处理或预处理过程应使其下一流程中污染物更易于去除 而且不能产生有毒物质产生的沉淀物要妥善处理 燃烧处理时要控制有害气体的产生高浓度污染物不适合采用酶法处理 低浓高毒的较适宜由于其价格较高 必须考虑酶的费用 2 4酶在土壤修复中的应用 生物修复主要利用微生物 植物以及微生物 植物的联合作用 特别是其强大的酶系统催化功能 改变有机污染物的结构和毒性 或者使它们完全矿化 形成无害的无机终端产物生物修复在环境中有害化学物质的清除方面发挥着非常重要的作用 是现代环境生物技术的主要内容 土壤污染物的生物转化过程 常见污染物可分为 易生物降解的化合物 简单的碳氢化合物 醇类 酚类 胺类 酸类 脂类 酰胺类等难生物降解的化合物 多氯联苯 多环芳烃以及农药等污染物的细胞转化可以划分为 细胞释放的胞外酶作用 使大分子化合物降解为可以进入细胞内部的小分子化合物进入细胞内部后在细胞的新陈代谢作用下进行进一步降解 污染物必须与微生物的酶系统接触才能发生降解 不溶性的物质通常先由胞外酶进行催化 速率较慢 胞外酶在细胞代谢中的作用 胞外酶 胞外酶包括大量的氧化还原酶和水解酶植物根区胞外酶 通常与细胞壁有关 可将污染物转化为更易被植物根部或根际微生物吸收的中间产物 如过氧化物酶 漆酶 单酚单氧合酶 脂酶等微生物胞外酶 白腐真菌产生木质素降解酶系 包括木质素过氧化物酶 依赖锰的过氧化物酶 含铜的酚氧化酶 漆酶等 可与纤维素酶 半纤维素酶等协同降解木材水解酶 蛋白酶 纤维素酶等 污染物的无细胞酶生物降解 胞外酶用于土壤修复的要求 有充足的酶源 可大量获得 遗传稳定 非致病性 性能好 可利用静止细胞或提纯的酶 活性高 专一性灵活 不发生副反应 稳定性好 能够进行固定化 无细胞酶降解土壤中的污染物 转化效率不高 尚无实际应用 酶法土壤修复的局限性 污染物的局限 污染物不单一 其他污染物对酶的转化效率的影响可能是正面的 但一般是负面的酶本身的局限 污染物转化过程中可能发生酶的失活 如酶被土壤 天然包埋 土壤结合的酶 第五节发酵工程在环境污染治理中的应用 114 46 1发酵工程概述 发酵工程是现代生物技术的重要组成部分 是生物技术产业化的重要环节 发酵工程是将微生物学 生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来 利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术 又称微生物工程 发酵是指利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其他代谢产物的过程 目前也扩展为培养生物细胞 动植物细胞和微生物细胞 来制得产物的所有过程 115 46 发酵工业回顾 几千年前 人类开始酿酒 制酱 制奶酪等1675年 列文虎克发明了显微镜 观察到了微生物巴斯德证明酒精发酵是由于酵母菌引起的 发酵现象是由微生物所进行的化学反应柯赫建立了单种微生物的分离和纯培养技术 新的发酵产品不断出现 以固态发酵和浅层液态发酵为主上世纪40年代 抗生素大规模深层发酵工艺建立随着新型发酵设备 发酵工艺和育种技术的发展 现代发酵工程达到了一个新的高度 116 46 微生物发酵的历史 117 46 发酵工程的内容 发酵工程由三部分组成 上游工程 发酵工程和下游工程上游工程包括优良菌种的选育 最适发酵条件 pH 温度 溶氧和营养组成 的确定 营养物的准备等发酵工程主要指在最适发酵条件下 在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术 要求严格的无菌生长环境 可分为分批发酵 补料分批发酵和连续发酵下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术 包括固液分离技术 细胞破壁技术 蛋白质纯化技术 和产品的包装处理技术 还要考虑发酵后的菌体与废物处理问题 118 46 发酵工程的优点 生物工程真正能应用于工业化生产的 主要是发酵工程 基因工程 细胞工程 酶工程等往往也需要通过微生物才能转化为生产力以生物为对象 不完全依赖有限资源 可再生反应温度较低 生产可连续化 成本低安全有效 所得生物产品价格低廉 纯净能解决传统化学工业技术的一些难题可定向创造新品种 新物种投资小 收益大 见效快 119 46 发酵工程的应用 现代发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产 还包括微生物机能的利用 发酵法生产的物质 120 46 发酵的基本过程 121 46 菌种选育 发酵工业的生产水平取决于三个要素 生产菌种 发酵工艺和设备菌种选育的目的是为了改良菌种的特性 使其符合工业生产的需要提高其生产能力能适应特定的工艺条件 如能利用廉价的原料 耐受性好目前主要采用自然选育和诱变育种的方法 工作量大 有一定盲目性基因工程 细胞工程等育种方法具有定向性 122 46 菌种分离 筛选的原则与步骤 菌种分离过程中需要考虑的主要因素营养特性 能够利用廉价 来源丰富的原料生长温度遗传和生产能力的稳定性转化能力和产物浓度高易分离 本身无毒 也不产毒筛选菌种的具体步骤可分为 采样 富集与分离 发酵与性能测定等 123 46 菌种分离纯化及筛选步骤 124 46 自然选育 不经过人工诱变 利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育变异的实质是DNA序列的变化自然突变的原因宇宙射线 短波辐射 诱变物质等碱基的互变异构作用 造成配对错误自然突变的几率大约是10 9 10 8自然突变可能导致菌种退化或对生产有益的转化效率较低 容易退化 125 46 诱变育种 诱变育种是诱发突变与随机筛选相结合的一种育种技术 是工业微生物育种中使用最多的菌种改良手段人为利用物理 化学因素 使诱变的细胞内遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失 易位 倒位 重复等畸变 或DNA的某一部位发生改变 点突变 从而使微生物的遗传物质DNA或RNA的化学结构发生变化 引起微生物的遗传变异诱发突变的频率远大于自然突变 126 46 常用的诱变剂及其类型 127 46 诱变育种方案设计 诱变育种的环节突变的诱发突变株的筛选突变高产基因的表现制定筛选目标要考虑高产性状和其他有利性状制定筛选方案综合考虑出发菌株和诱变剂的选择 并选择合适的诱变方法和剂量 128 46 微生物诱变育种流程 129 46 诱变育种的筛选 130 46 初级代谢产物和次级代谢产物的比较 131 46 补料分批发酵的优势 解除营养基质的抑制 产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应对于好氧发酵 避免在分批发酵中因一次性投入基质过多而造成细胞大量生长 好氧过多 以致通风搅拌设备不匹配的状况某些情况下 还可以减少菌体生产量 提高产物的转化率与连续发酵相比 它不会产生菌种老化和变异问题 其适用范围也比连续发酵广加入物质和如何添加仍然需要经验确定 有盲目性 132 46 连续发酵的优点 操作条件的稳定有利于微生物的生长代谢 从而使产率和产品质量也相应保持稳定机械化和自动化能降低劳动强度减少非生产占用时间 提高设备利用率细胞生长状态一致 产物生产的持续性好生产同样量产物所需生物反应器比分批发酵的小测量仪器探头寿命延长过程优化容易 有效提高发酵效率 133 46 发酵生物反应器 发酵罐是最重要的微生物细胞反应器染菌率低大型化 有利于提高经济效益过程优化可提高产量和降低成本利于提高产品回收率和质量生物反应器的基本类型搅拌式生物反应器 stirredtankreactor 鼓泡塔式反应器 bubblecolumn 气升式反应器 airliftreactor 134 46 几种常见的生物反应器 135 46 发酵罐的结构 136 46 发酵过程监测 物理参数温度 压力 流量 转速 粘度 泡沫位等化学参数pH 溶氧 尾气 发酵液成分 离子浓度等生物参数生物量 ATP 蛋白质等在线与非在线测量间接测量 137 46 发酵动力学 细胞生长和死亡动力学基质消耗动力学氧消耗动力学CO2生成动力学产物合成和降解动力学代谢热生成动力学 138 46 微生物生长动力学 微生物分批培养生长曲线 139 46 发酵过程优化及控制 建立发酵过程模型 实现过程优化控制 描述细胞群体的数学模型 140 46 发酵过程控制 141 46 下游处理流程 142 46 发酵与产物分离耦联技术 在反应过程中及时将产物或有害物质从反应系统中移出 可以保证生化反应高效进行 简化下游处理真空发酵 真空减压 易挥发组分分离 只适用于厌氧发酵气体发酵 氮气 氢气或二氧化碳作为气提载体 将发酵蒸气压大于水的挥发性产物带出 主要用于厌氧发酵吸附发酵 吸附剂回收产物或副产物 减少抑制膜分离发酵 膜分离设备与发酵设备耦联 膜生物反应器萃取发酵 双水相萃取 143 46 代谢控制发酵 利用遗传学的方法或其他生物化学方法 人为的在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢 使有用目的产物大量生成和积累 微生物细胞氨基酸 核苷酸的调节机制 144 46 代谢控制发酵的设计思路 改变代谢流加快速度限制反应改变分支代谢途径流向构建代谢旁路改变能量代谢途径扩展代谢途径转移或构建新的代谢途径 145 46 2发酵工程在环境污染治理中的应用 废水生物处理装置实际上可以看作一个大型发酵罐 有机污染物在微生物作用下 转化成CO2和水固体废物的堆肥 垃圾的填埋以及废物资源化过程均为发酵过程 146 46 固态发酵 又称固体发酵 是指微生物在没有或几乎没有游离水的固体的湿培养基上生长 繁殖 代谢的发酵过程 固态发酵的优缺点 147 46 固态发酵生物反应器类型 浅盘式生物反应器填充床生物反应器流化床生物反应器转鼓式生物反应器搅拌生物反应器 148 46 浅盘生物反应器 149 46 搅拌生物反应器 150 46 堆肥 依靠自然界广泛分布的细菌 真菌等微生物 有控制的促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化学过程好氧堆肥 发热阶段 中温微生物 高温阶段 好热纤维素分解菌 降温和腐熟保肥阶段 中温微生物 预处理 一次发酵 二次发酵 后处理厌氧堆肥 不设通气系统 温度低 腐熟及无害化所需时间较长 151 46 污泥堆肥中的微生物相 第六节生态工程与污水处理系统 7 6 1生态工程简介 一 生态工程的定义及其应用生态工程 EcologicalEngineering 指由人工