大豆制品脲酶活性测定

大豆制品中尿素酶 脲酶 活性的测定 2016 4 8 一 测定的原因 生大豆含有多种能被热破坏的抗营养因子 如抗胰蛋白酶 大豆中脲酶的含量与抗胰蛋白酶成正相关 且能很快 很经济地予以测定 所以 测定脲酶的活性 UA 就可以预测大豆饼粕的加工程度是否适当及营养品质的优劣 二 影响大豆制品脲酶活性的因素 大豆加热过程中的温度 大豆原料最初的水分含量 大豆粒度的大小 加热时所用压力的大小 大豆加热时间的长短 高温 高湿 高压 粒度小 时间长脲酶活性低 但是 加工过度 一些氨基酸会被破坏 所以脲酶活性过高 豆制品过生 或过低 豆制品过熟 都表明豆制品质量较差 三 测定原理 脲酶活性测定实际上是在一定条件下 pH 7 0 T 30 测定每克试样 每分钟分解尿素所产生的氨的量 脲酶NH2CONH2 2NH3 CO2 四 测定方法 一 定性法 1 酚红法 1 原理 酚红指示剂在pH6 4 8 2时由黄变红 大豆制品中所含的脲酶pH 7 0 T 30 时可将尿素水解产生氨 释放的氨可使酚红指示剂变红 根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小 2 仪器和试剂 粉碎机 粉碎时不产生强烈发热分析天平 感量0 01g25ml纳式比色管恒温水浴锅0 1 酚红指示剂 0 1g苯酚红溶于100ml95 乙醇溶液结晶尿素 分析纯 3 方法 粉碎 称取0 05 0 001g 放入试管 加入尿素0 2g 指示剂5滴 加蒸馏水25mL 摇动10s 立即置于30 0 5 水浴锅 计时观察溶液变红时间 5min后取出试管 摇匀继续观察 空白试验 不加尿素 其他同上 品质判定 如果溶液为明显的粉红色 则认为该大豆制品脲酶活性超标 为不合格产品 0 1min变红 活性非常强 1 0 1 2min变红 活性大概0 5 1 0 2 5min变红 活性大概0 3 0 5 4 注意事项 1 粉碎样品时 不应产生大量热 否则会影响结果判定 2 称量样品时 一定要将样品混合均匀 否则会造成试验误差 3 试样和空白试验同时操作 过程要迅速 防止时间影响 2 尿素酚红法 1 原理 酚红指示剂在pH6 4 8 2时由黄变红 大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨 释放的氨可使酚红指示剂变红 根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小 2 仪器和试剂 表面皿 0 2N氢氧化钠溶液 称取0 8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水 1 0N硫酸溶液 移取14 0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水 尿素 酚红试剂 用500ml烧杯将0 8g酚红溶于20ml0 2N氢氧化钠溶液 用蒸馏水稀释至约300ml 加入60g尿素 并溶解之 转移至2L容量瓶 冲洗烧杯数次 加蒸馏水至约1 5L 加入9 4ml1 0N硫酸溶液 用蒸馏水定容至2L 此时溶液应具有明亮的琥珀色 过段时间溶液会变为深橘红色 可滴入稀硫酸溶液搅拌之 直至溶液再次变为琥珀色 3 方法 将一满匙样品放入表面皿中 摊平 将以调好的尿素 酚红试剂滴入表面皿中的样品上 直至完全浸湿 停留5min 观察样品的颜色反应 如果红斑面积多于20 则认为该样品脲酶活性超标 为不合格产品 4 注意事项 1 对于样品较粗 具有大块状的样品 最好将其稍微粉碎 亦不可太细 否则不容易观察 2 样品一定要铺平 容易观察 3 溶液保质期为3个月 最好1个月内用完 4 此方法容易受颗粒度影响 二 定量法1 pH增值法 1 原理 脲酶水解尿素产生氨 使溶液的pH值升高 通过测定样品溶液的pH值和空白的pH值之差来计算脲酶的活性 脲酶活性定义为 在30 和pH 7的条件下 每分钟每克大豆制品分解尿素后所释放的氨态氮的毫升数 2 仪器与器皿酸度计 pH计 具有玻璃电极 甘汞电极恒温水浴 须能保持温度30 0 5 试管 20 150mm并配有橡皮塞 50mL 3 试剂磷酸缓冲液0 05mol L 称取3 403gKH2PO4溶于100mL蒸馏水中 再称取4 355gK2HPO4溶于100mL蒸馏水中 合并两者并配成1000mL 用强酸或强碱调节pH 7 0 尿素缓冲液 称取15g尿素 溶于500mL磷酸缓冲液中 调节pH 7 0 样品粉碎 至少60 通过400微米试验筛 4 操作步骤准确称取0 400 0 00lg样品2份 分别置于2支试管中 一支试管加入20mL磷酸缓冲液 作为空白试验 A管 另一支加入20mL尿素缓冲液 B管 盖塞混匀 在30 恒温水浴中准确保持30min 在此期间 每隔5min摇匀一次 取出立即在流水中冷却 5min内测定溶液pH值 5 计算UA pH B管 pH A管 2 滴定法 1 原理 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合 在30 保持30min后 尿素酶催化尿素水解产生氨 用过量的盐酸溶液中和氨 再用氢氧化钠标准溶液回滴 2 脲酶活性定义在30 和pH 7的条件下 每分钟每克大豆制品分解尿素后 所释放的氨态氮的毫克数 3 仪器与设备样品筛 孔径200 m酸度计 精度0 02pH 附有磁力搅拌器和滴定装置恒温水浴 可控温30 0 5 试管 直径18mm 长150mm 有磨口塞子 精密计时器粉碎机 粉碎时应不生强热 如球磨机 分析天平 感量0 1mg移液管 10m1 4 试剂尿素 分折纯 磷酸氢二钠 分析纯 磷酸二氢钾 分析纯 尿素缓冲液 pH6 9至7 0 4 45g磷酸氢二钠和3 40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL 再将30g尿素溶于此缓冲溶液中 盐酸 分析纯 0 1mol L溶液氢氧化钠 分析纯 0 1mol L标推溶液 按GB601 77 标准溶液制备方法 的规定配制 5 操作方法称取0 2g试样 转入试管 加入10mL尿素缓冲液 立即盖塞 剧烈摇动 马上置于30 0 5 恒温水浴 准确计时30min 加入10mL0 1mol L盐酸 迅速冷却到20 内容物全都转入烧杯 立即用氢氧化钠标淮溶液滴定到pH4 70 空白试管 加入10mL尿素缓冲液 加入10mL0 1mol L盐酸 称取0 2g试样加入试管 立即盖塞 剧烈摇动 马上置于30 0 5 恒温水浴 准确计时30min 迅速冷却到20 内容物全都转入烧杯 立即用氢氧化钠标准溶液滴定到pH4 70 6 计算结果UA 14 C V0 V 30 m C 氢氧化钠标准溶液