分子生物课件文档.doc

绪论 了解 分子生物学的发展简历 分子生物学的发展展望 掌握 分子生物学的主要内容 分子生物学的地位及其与其他学科的关系发展简史 创世说与进化论 三个问题 生命是怎样起源的 为什么“有其父必有其子” 动、植物个体是怎样从一个受精卵发育而来的 两种解答 创世说 进化论 (揭开生命神秘的面纱细胞学说 列文虎克(Leeuwenhoek )(16321723) 世界上第一个用放大镜看到细菌和原生动物的人 1684年，他通过观察血液，准确地描述了血红细胞 他发现微生物不是从河泥或沙子中产生的，而是和动物一样，有卵、幼虫等完整的繁殖过程 细胞学说 细胞是有机体， 一切动植物都是由单细胞发育而来， 即生物是由细胞和细胞的产物所组成； 所有细胞在结构和组成上基本相似； 新细胞是由已存在的细胞分裂而来；现代生物学（进化论与细胞学说相结合产生，为分子的产生奠定基础） 现代生物学（主要包括两个分支） 生物化学：分离纯化鉴定细胞内含物质 分析细胞组成成分 弄清细胞内各成分与细胞内生命现象的联系 遗传学：研究动、植物遗传变异规律 孟德尔：分离律，自由组合律 摩尔根：连锁交换律1.1 准备和酝酿阶段 两大理论： 生命的物质基础是蛋白质 生命的遗传物质基础是DNA 埃弗里（Avery）：肺炎双球菌转化实验 T4噬菌体感染实验1.2 建立和发展阶段 1953年Watson和Crick，提出DNA双螺旋模型,1962年获诺贝尔生理和医学奖 意义： 确立了核酸作为信息分子的结构基础 碱基配对是复制和遗传信息传递的基本方式发展阶段还包括半保留复制，遗传密码子的破译，中心法则的确定和修正到此为止，分子生物学理论领域的三大发现完成了 三大理论： 生物的遗传物质是DNA（核酸） DNA双螺旋结构和半保留复制机理 遗传信息传递方式：中心法则1.3 分子生物学的深入发展阶段 以认识和深入改造生命为主： 三大重要技术： 工具酶 载体（例如质粒） 逆转录酶 一些重要的成就： Sacob提出操纵子分子机制 1980.SangerDNA序列测定法 基因表达与调控 转座子的发现 PCR,生物芯片克隆 2. 分子生物学的研究内容 分子生物学： 从分子水平上研究蛋白质核酸等生物大分子的结构特征，功能及其重要性、规律性和相互关系的学科； 主要内容： 大分子的结构功能 基因的表达调控 分子生物学的研究方法 基因和生物信息学发展展望3.1 研究机理（基因表达调控）：3.2 研究物种（物种的基因库）：3.3 基因工程3.4 生物信息科学3.5全人工合成生命分子生物学的地位与关系 分子生物学的地位 处于核心和前沿的地位 与其他学科的关系： 各生物学科可借用分子生物学的原理与方法， 从分子水平研究生命的本质与规律 分子生物学也不能离开其他生物学而独立存在参考书 生物化学（第三版），王镜岩等，高等教育出版社 分子生物学基础，杨歧生，浙江大学出版社 分子遗传学，孙乃恩等，南京大学出版社 第二章 染色体、基因与基因组 了解l 核酸的生物包装、基因的分区；l 真核、原核基因组的区别； 掌握l 染色体、基因、基因组；l C值、C值佯谬；l 断裂基因、内含子、外显子；l 操纵子、单基因、多基因；l 卫星DNA、真核生物DNA序列分类； 染色体（chromosome） 1.1 核酸的生物包装(pack)l 概念 核酸在生物体内与其他生物分子相互作用而形成存在形式的过程。l 核酸的包装比 核酸的理论长度与其形式长维长度的比值。 理论长度：提纯的核酸在生理pH和离子强度环境下的长度 生物进化的级别越高,其核酸的包装比越大1.2 染色体的概述 定义l 细胞生物学上指真核生物细胞有丝分裂期在显微镜下可见的致密小体。l 分子生物学上指的是基因组的核酸分子，一个核酸分子就是一条染色体。l 细菌染色体：l 共价闭合环状双链DNA分子l 只有少量DNA疏松结合l 具有放射环结构，为转录活性单位病毒染色体 衣壳与核酸相互作用，衣壳组装的同时将核酸包裹起来：烟草花叶病毒 先组装衣壳，组装完成后插入核酸：T2噬菌体。1.3 真核染色体的组成 1.3.1 蛋白质l 包括组蛋白和非组蛋白，蛋白与DNA的比值约为2:1，组蛋白与非组蛋白约为1:1l 组蛋白可以用2mol/LNaCl或0.25mol/L的HCl或H2SO4与核酸分离，再通过离子交换柱分离出来。l 组蛋白按其凝焦电泳性质分为：H1、H2A、H2B、H3、H4，在鸟类血细胞中由H5代替H1 组蛋白有进化上的极端保守性l H4最稳定，H2A、H2B、H3较稳定，H1最不稳定 肽链上氨基酸分布的不对称性l 端富含碱性氨基酸（结合DNA）l 端疏基团，与其他组蛋白非组蛋白结合。1.3.2.染色质与核小体 染色质是由许多核小体构成的念珠状结构l 染色质每3070kb形成一个环，环的基部称为锚定元件l 锚定元件（anchorageelement）：l 真核生物染色质环结构基部的DNA片段，成对存在基因两端，结构上环在细胞中的固定，功能上是调控句号。核小体组成 1.3.3 细胞中染色体生存的三大必需件l 着丝粒（centromere）l 复制原点：富含AT序列l 端粒（telomere）：l 短的重复序列l 线形DNA末端完全复制的必需品l 端粒与人寿命的长短有关 基因和基因组 2.1 基因 2.1.1 基因的概念l 广义：生物的全部遗传信息或遗传物质，是存在于基因组核酸分子中的全部核苷酸顺序，包括：编码性的，控制性的和结构性的遗传信息。l 狭义：控制一条多肽链或一条RNA遗传变异表达的遗传信息单位。2.1.2 基因的分区 (1)根据结构分区l 5旁侧区l 3旁侧区l 中心区 可通过剔除实验确定分区：l 从基因一侧剔除序列，剔除后对基因表达没影响，则称为旁侧区，反之为中心区(2)从功能上分区 编码区 控制区 前导顺序：基因转录元中5端不编码蛋白的一段核苷酸顺序 作用：对翻译的效率产生影响l 如SD顺序：原核生物蛋白基因前导顺序中距离第一个起始密码子7个bp的一部分或全部多聚嘌呤核苷酸顺序。 尾随顺序：基因转录元中3端不编码蛋白的一段核苷酸顺序。 开放阅读框（open read frame，ORF)l 一个核苷酸顺序有3种阅读框架（RF），一般只有一种RF能翻译成蛋白，称开放阅读框。当一个基因被识别、其DNA序列被解读时，人们往往仍然无法 弄清相应的蛋白序列是什么。这是因为在没有其它信息的前提下，DNA序列可以按六种框架阅读和翻译 （每条链三种，对应三种不同的起始密码子）。 ORF Finding 针对小基因序列，搜索并报导可能的蛋白质编码区，它检测这六个阅读框架，并寻找以启动子和 终止子为界限的DNA序列，符合这些条件的序列有可能对应一个真正的单一的基因产物。在构成基因的核苷酸序列中存在着一些最终翻译成蛋白的碱基段，每三个连续碱基(即三联“ 密码子”） 编码相应的氨基酸。其中有一个起始“密码子”-AUG/ATG和三个终止“ 密码子”，终止“ 密码子”提供 终止信号。当细胞机器沿着核酸合成蛋白链并使其不断延伸的过程中遇到终密码子时，蛋白的延伸反应终止，一个成熟（或提前终止的突变）蛋白产生。因此开放阅读框是基因序列的一部分，由于拥有特殊的起始密码子和直到可以从该段碱基序列产生合适大小蛋白才出现的终止密码子，该段碱基序列编码一个蛋白。2.1.5 基因的分类 据产物性质分类据终产物作用分类据转录所需RNA聚合酶分类 2.2 间隔顺序(spacer sequence)l DNA分子上的非基因顺序l 如着丝粒、复制原点、端粒、锚锭元件 2.3 基因组l 一种生物的单倍体或二倍体细胞所含有的决定该生物遗传性状的整套遗传物质2.4 真核生物基因组的特点 2.4.1.有大量序列是不编码蛋白的(非功能序列)l C值(Content Value)：一个生物单倍体基因组核酸的总量(基因组大小)l C值佯谬(C-Value-Paradox)：一个物种生物C值的大小与该物种生物复杂性程度不一致的现象2.4.2 有很多重复序列l 单一序列（不重复序列）：l 只有一个拷贝的序列l 蛋白质基因几乎全部是单一序列l 所有真核生物的单一序列在40%80%之间l 重复序列：l 轻度重复序列：210个拷贝（也可归入单一序列）l 中度重复序列：10104个拷贝l 高度重复序列：105个拷贝中度重复序列 组蛋白基因、rRNA基因、tRNA基因都是中度重复序列。 中度重复序列往往分散于不重复序列之间 种类：l 短散在元件（SINEs,short interspersed elements）：重复单位小于500bp;l 长散在元件（ LINEs,long interspersed elements ）：重复单位长57kb;高度重复序列卫星DNA 真核生物的DNA片段用CsCl或Cs2O4 作密度剃度离心后出现在主带DNA前或后的DNA 重复单元110bp 重复程度105107bp 富含AT或GC（26%74%之间）l 含G+C比较多称为重卫星DNA，称基因丰富序列l 含A+T比较多称为轻卫星DNA，称基因贫乏区小卫星DNA及微卫星DNA2.4.3.真核生物的蛋白基因大多为断裂基因 断裂基因（不连续基因）：真核生物基因中与成熟的RNA对应的核苷酸序列不连续 外显子（外元，exon）：真核生物基因中转录后形成的成熟RNA有对应代表物的DNA片段 内含子（内元，intron）：真核生物基因中转录后形成的成熟RNA无对应代表物的DNA片段 GT-AG规律：内含子常以GT开始，AG结束； 2.4.4 真核生物蛋白基因多为单基因 单基因（monogenic gene）：转录的mRNA只有一个蛋白质编码区。 2.4.5.真核生物基因组中有很多间隔顺序，功能相关的基因可以串联成簇基因簇，也可隔得很远。 2.4.6.染色体外遗传因子 叶绿体和线粒体DNA 2.5 原核生物基因组特点 绝大多数序列编码蛋白，通常是单拷贝。但也有多拷贝，例rRNA有7个拷贝 DNA序列与编码蛋白的序列呈一一对应的线性关系 原核生物有多基因（多顺反子）存在l 多基因：原核中功能相关基因往往形成特定的功能单元，可以一起转录成含多个mRNA的分子l 真核生物多聚蛋白基因十多个蛋白一起转录并翻译成一条肽链，在经过切割成为多个蛋白，而多基因几个蛋白是分别翻译的 （ 4 ）功能相关的基因组成操纵子l 操纵子：原核生物中，有功能相关的基因构成的表达和调控的高级单位 （4）间隔顺序少，大部分是基因核苷酸顺序l 在x174中只有4%为间隔序列 （5）有重叠基因存在l 重叠基因：一个基因的核苷酸顺序与另一个基因的核苷酸顺序部分或完全重叠l 意义： 有利于协调控制 可以包含更多的遗传信息第三章DNAw DNA的结构w DNA的变性与复性w DNA分子的形式w DNA序列多态性w 损伤、修复、突变w 重组1. DNA的结构w 要求 了解DNA的一、二、三级结构和拓扑学公式 掌握DNA分子的特殊结构、线性双链结构、末端结构、回文、发夹结构等DNA作为遗传物质的原因w 储存遗传信息量大。1Kb的序列41000种遗传信息w 碱基互补及双螺旋结构可以保证复制转录遗传稳定性w 核糖的2OH脱氧，在水溶液中稳定性高于RNAw 可以突变以求不断进化w 方便修复 以求稳定遗传1.1 一级结构1.2.二级结构1.3.三级结构（超螺旋）w 拓扑学公式：L=T+W L：DNA两条链交叉的次数 T：产生的螺旋数（每10.4bp为一圈） W：超螺旋数 w 拓扑异构体:仅L不同的两种DNA分子互为拓扑异构体w 拓扑异构体的电泳性质不同 迁移率：超螺旋环型线型1.4 DNA结构中特殊组织w 1.4.1 线型双链DNA末端结构 端粒 粘性末端(stickey end): 线性双链DNA末端有3或5 单链突出，能形成反向平行互补 末端重复(terminal repeat): 线性双链DNA两个末端核苷酸顺序相同的片段 如T4噬菌体 与蛋白的共价结合： 例如腺病毒以蛋白质为引物从头合成1.4.2.发夹结构（hairpin structure）w 单链DNA或RNA中两个相邻的反折后能互补形成反向平行的核苷酸顺序。1.4.3.回文结构(Palindrome)或反向重复序列(Inverted repeatw 回文结构：双链DNA中含有两个结构相同方向相反的序列2. DNA变性和复性w 要求 了解变性、复性的定义、影响因素、Tm计算、DNA分子形式 掌握DNA顺序多肽性、DNA指纹 根据cot，判断基因组大小或DNA复杂性2.1 变性w 定义：DNA双螺旋区氢键断裂成单链w 2.1.1 引起变性的因素 热变性 pH变化引起变性 有机溶剂、尿素、酰胺等物、化因素w 2.1.2.检测方法：紫外光光谱变化 双链DNA：A260=1.0 单链DNA：A260=1.3 游离核苷酸：A260=1.60 结构越有序,吸光度越小 变性后，碱基暴露吸光增强w 2.1.3 Tm 加热变性DNA双螺旋结构失去一半时的温度 G+C含量越多，Tm越高（G、C之间为三个氢键） XG+C=(Tm-69.3)2.44 （ XG+C 为G+C的百分含量）2.2 复性w 定义：已变性DNA在一定条件下重新恢复双链结构的过程w 2.2.1 主要影响性因素 温度：低于Tm值2025之间 DNA浓度：单位体积单链DNA越多，碰撞几率越大，复性越快 DNA片段越大，扩散机会越小，复性越难 DNA序列越复杂（碱基种类多少及均匀程度），复性速度越慢2.2.2 复性动力学w 核心区（互补区）：互补性高，易于复性的部分，是复性最先发生的区域 核心区复性速度与初始DNA浓度的平方成正比二级动力学公式C0t1/2可以用来：1)表示DNA的复杂性(DNA,kinetic complexing)表示单一序列DNA分子大小3)判断原核基因组大小对于真核生物的重复序列有：化学复杂性(Chemi-complexing): DNA重复序列的总长度动力学复杂性(Kinetic-complexing): 每个重复单元的长度例一：某生物基因组大小为7108bp，含30% 中度重复序列，已知其cot为0.57,求其重复频率Chemi-complexing： 7108bp30% =2.1108bp则kinetic-complexing= 0.574.2106 bp/4 = 6105bp则重复频率=2.1108bp/6105bp 3503.DNA的分子形式w 线形双链：核DNAw 线形单链：动物MVMw 环形双链：质粒，噬菌体(复制时) 共价闭合的环双（cccDNA） 缺口或切割部分开口的环双 Gap:双链DNA上有3端和5端两个磷酸单酯键断裂 Nick：双链DNA一条链或两条链不同位置上一个3或5端一个磷酸单酯键断裂 环连体(多发生于复制过程中）w 环形单链：X174噬菌体4.DNA顺序多肽性和DNA指纹w DNA顺序多肽性（DNA sequence poly morphism）：一个物种或种群中不同个体来源的DNA顺序有一定差别w DNA指纹（DNA finger print）：DNA多肽性在各个个体中的类型，该类型在不同个体的基因组中不同，可用来鉴定个体身份5.损伤、修复、突变w 要求： 了解：损伤修复机制 突变后果 掌握：损伤定义、突变定义、原因、意义5.1.损伤（injury,damage）w 定义:任何性质的DNA正常结构的改变或破坏w 5.1 引起损伤的因素 体内因素： .体外因素：5.1.2 损伤的类型5.1.3.损伤后果w 复制抑制w 细胞应急反应（SOS response ）： 由损伤DNA或DNA复制抑制而引起的一些列复杂的细胞表现型改变的反应， 包括细胞分裂抑制，DNA损伤修复，DNA突变，溶源性细菌释放噬菌体四个效应。 其中诱导损伤修复有两种 避免差错修复：诱导产生切除修复和重组修复的关键酶或蛋白质 倾向差错修复：DNA聚合酶IV和V产生突变，提高存活率，增加存活机会w DNA损伤的修复w DNA突变 突变：能够遗传的生物性状的改变或能够遗传的DNA结构的改变w DNA降解，细胞死亡5.2.安全保障体系w 安全保障体系 复制修复系统 损伤修复系统 限制-修饰系统w 5.2.1.复制修复系统 复制酶的校对功能，w 错配修复系统： 错配矫正酶 由MutS,MutL, MutH组成，可在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5位置切开子链 Dam甲基化酶 使母链GATC序列中的A(N6)甲基化 DNA聚合酶 DNA连接酶 双向性核酸外切酶 解螺旋酶5.2.2损伤修复系统w 损伤修复系统是指专门修复非复制过程中产生的DNA损伤的系统 诱导修复：光修复、切除修复、重组修复等 非诱导修复：即应急修复 相对光修复其他修复又称为暗修复 重组修复称为复制后修复，其它称为复制前修复1）光修复（photo repair2）碱基切除修复3）重组修复 4）应急修复（SOS修复）5）错配修复系统5.2.3 限制-修饰系统5.3 DNA突变（mutation）w 突变：DNA一级结构上稳定的可遗传的改变w 包括： 碱基替代 转换（嘌呤之间或嘧啶之间转换） 颠换（嘌呤和嘧啶之间转换） 核苷酸或核苷酸片段的缺失以及插入 点突变（point mutation）5.3.1 突变的产生w DNA的损伤是直接原因，DNA损伤不能修复或错误修复造成了突变的产生w DNA突变是否能在生物个体或群体中稳定存在需要自然选择的决定w 基因组DNA分子的突变率不均一，有突变热点存在 突变热点：DNA分子上突变频率大大高于平均频率的位点 诱发突变热点：DNA中5-甲基胞嘧啶在突变剂作用下脱氨氧化为脑胸腺嘧啶，并且不能全部修复 自发突变热点：DNA中存在的短的连续重复序列（复制时，由于模板链或新生链的滑动会发生重复顺序单元的插入或缺失）w 致突变基因或增变基因（mutator gene）：与整个基因组DNA的突变率有关的基因,这些基因的突变使整个基因组DNA的突变率大大增加5.3.3 突变的生物学意义w 是DNA与环境互相作用的结果，是基因适应环境生存所必须的w 为生物进化、产生生物多样性积累素材w 对突变的研究是获取基因知识和认识新基因的主要途径 如乳糖操纵子，通过诱导I基因缺失突变为I，阻遏蛋白消失，证明I为调节基因6 重组w 要求： 掌握：重组定义、生物学意义、转座（子）作用机理，DNA稳定性与流动性 了解几种重要的遗传重组 转座子的类型6.1 定义w 遗传重组（genetic recombination）：又称DNA体内重组，DNA生物重组（相对于DNA人工重组而言），是已存在的遗传物质产生新的组合，涉及DNA分子内断裂-复合或DNA分子的重新组合6.2 分类w 6.2.1.按DNA遗传重组所涉及的细胞现象或细胞过程分类 （1）真核细胞减数分裂中的非同源染色体自由组合 （2）真核减数分裂中同源染色体联会交换 （3）基因转换（gene conversion）：指杂合体产生的两种基因型配子数不均等现象w 4）细菌的转化(bacterial transformation)：一个细菌细胞摄入并表达外源DNA的过程（限制修饰系统缺陷型菌株）w （5）细菌的接合（bacterial conjugation）:通过直接接触而产生的从一个细胞向另一个细胞的遗传信息的直接传递过程。w （6）转座作用w （7）土壤杆菌Ti质粒向敏感植物的转移w （8）噬菌体转导：由噬菌体介导的细菌细胞之间的遗传信息的转移 普遍转导：介导宿主细胞中任何基因转移到另一个细胞的过程 局限性转导：只介导宿主细胞中的某些特定的基因转移到另一个细菌细胞的过程w （9）细胞分化发育中控制基因表达的遗传重组w 6.2.2略，w 6.2.3.略w 6.2.4.略w 6.2.5.按DNA遗传重组是否涉及DNA分子断裂-复合过程分 无DNA分子断裂-复合遗传重组 有DNA分子断裂-复合遗传重组w 同源重组w 位点特异性重组w 转座作用位点特异性重组w 发生在特定的DNA片段上，且有特异性酶和辅助因子对其识别和作用 a.噬菌体DNA的整合与切除 噬菌体与宿主细胞的特异重组位点称为附着点（attachment site） 噬菌体附着点attP长240bp，含P,O,P序列 细菌附着点attB长236bp,含B,O,B序列 两个O序列完全相同 整合时，分别交错7bp将2个DNA分子切开，然后再整合酶和宿主因子协助下完成整合b.细菌的特异位点重组w 鼠伤寒沙门氏杆菌由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种： H1鞭毛蛋白 H2鞭毛蛋白w H片段倒位可决定鞭毛相转变，H片段两端为14bp的特异重组位点（hix）。转座作用（transposition）w 定义：一个DNA单元（转座子）在细胞内DNA分子上位置的改变或增加的过程w 转座子（transposon，Tn）：细胞内DNA分子上位置可以改变或增加的DNA单元w 转座可以发生在分子间也可以发生在分子内w 转座子大小为1kb50kbw 转座子的类型 原核生物转座子:插入序列,复合转座子, TnA家族 真核生物转座子:普通转座子,返座子原核生物转座子w 1.插入序列（insert sequence, IS）：不含有任何宿主基因的转座子 表示：“: IS1”（有插入序列IS1插入到噬菌体基因组内，下标序号是发现的顺序） IS两端是反向重复序列，中间为转座酶基因w 2.复合转座子（ composite transposon）:是一类带有某些抗药性基因（或某些其他宿主基因）的转座子 两端各有一段IS序列，中间为标记性基因w 3. TnA家族:没有IS序列，体积庞大（5kb），含三个基因，两个与转座有关，另一个是抗性基因，两端为38bp反向重复，但不是IS转座酶解离酶-内酰胺酶真核生物转座子w 1.普通转座子: 两端是反向重复,中间为转座酶基因w 2.返座子： 以RNA为介导，通过反转录来移动以cDNA形式整合到基因组中的转座子，为真核生物所特有 如L1因子，人类基因组中有1000多个拷贝，若插入凝血因子VIII中就会导致血友病转座机制w 1.复制型 间接剪切粘贴式,形成交叉中间体w 2. 非复制型 间接剪切粘帖式,形成交叉中间体 直接剪切粘帖式,不形成交叉中间体w 转座的共同点 靶位点错位切割，修复产生短的正向重复序列6.3.重组的生物学意义w 普遍性与特殊性的统一w 产生生物多样性，为生物进化提供途径w 参与表达调控w 参与损伤修复w 参与生物遗传信息的横向转移w 如何理解DNA是稳定性（不变）与流动性（变异）统一体w 稳定性：w 碱基配对原则进行精确复制，w 通过安全保障体系确保遗传稳定w 流动性w 突变和重组，提供了进化的基础第四章分子生物学研究法n 掌握：n 细菌转化；DNA序列测定；基因敲除；RNA干扰；酵母双杂交；cDNA文库n 了解：n 其他相关分子技术1DNA测序技术1.1细菌转化n 定义：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程（1）CaCl2法转化过程中的受体细菌应是限制修饰系统缺陷型菌株并且0低渗CaCl2处理成感受态。通过短暂的热刺激（42）可以使细菌摄入外源DNA（2）电击法外源基因在细菌中的表达n 目的基因体外扩增（PCR若是真核需从CDNA文库扩增）n 与载体连接（酶切）n 转化n 筛选（质粒抗性标记，蓝白斑，菌落PCR）n 诱导表达1.2基因文库（cDNA文库）的建立n gene bank（library）：一个含有基因组各个DNA片段的克隆的集合。n cDNA：以mRNA为摸板在逆转录酶作用下形成的DNA。n cDNA有组织特异性（都是该组织细胞现在表达的基因）n cDNA文库：以mRNA为基础在逆转录酶作用下，逆转录出DNA克隆形成的集合cDNA文库的建立n 1.高质量的mRNA的制备n 利用3polyA尾巴，将用生物素标记的寡聚（dT）引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚（dT）引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNAmRNA体外合成DNA(反转录)克隆n 在组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量是极不相同的，根据mRNA分子含量的多寡（丰度）可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度3种不同的类型n 克隆数量与涵盖概率有如下关系n N=ln(1-P)/ln(1-1/n)n N:克隆数n P：某个基因被文库所包含的概率（要求大于99%）n 1/n：每一种低丰度的mRNA占总mRNA的分数。1.3SNP技术n SNP 单核苷酸多态性n 分子构象由于碱基的不同在电泳或高效液相检测中移动性不同n 作用 解释不同个体对药物敏感性差异 犯罪身份，亲子鉴定，器官移植配对筛选1.4基因敲除n 通过一定途径使机体特有的基因失活或缺失的技术，通常指应用DNA同源重组原理用设计的同源片段代替靶基因片段，从而达到目的基因失活或缺失的目的n 步骤 （1）基因载体构建 与细胞内靶基因片段同源的DNA分子重组到带标记的载体上（2）ES细胞的获得（3）同源重组如：电穿孔法，显微注射法将重组载体导入胚胎干细胞中，使外源DNA与ES细胞中部分发生同源重组，从而整合到内源基因上得到表达n 4）选择筛选已经重组的细胞发生同源重组的比率动物是1/100-100000，植物是1/10000-100000， （用标记；PCR等）（5）表型研究（6）由于同源重组发生在一条染色体上，要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型需要至少两代遗传1.5核酸序列分析n 人工法：适用于小片段DNA,需要放射性物质，安全性低n 酶法（Sanger），又称合成法、末端终止法、双脱氧法n 化学法（Maxam-Gilbert）n 自动法：适用于较大的片段n 序列自动分析仪1.5.1 末端终止法n 原理：n DNA聚合酶能够利用单链DNA作为模板准确合成互补链n 双脱氧的核苷酸可以掺入寡聚核苷酸的末端，但会终止链的继续延伸1.5.2.化学法（直读法）n 原理：利用不同化学试剂对DNA作用产生大小不同的特异DNA片段n DMS（硫酸二甲脂）n 中性作用G（DMS在中性环境中使G上N7位甲基化，后