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文档简介

Hek293 Lentix细胞传代操作流程Plasmid&DNA制备流程载体包装制备流程种子库主库MCB工作库WCB来源?，鉴定种子库主库MCB工作库WCBE.oli？菌株CD19/CLL33.Hek293 Lentix细胞CAR-T细胞免疫治疗流程患者外周血采集产品批号副批号1收获100mlLB培养过夜的细菌副批号2副批号321FBS+DMEM从患者体内的外周血中分离白细胞在6000g， 4,离心15min。Ficoll复苏10mlBufferP1重悬包装plasmid(pMD2G，pspax2)激活 （active）目的DNA ?CaCl2WaterHBS6hrs冻存（慢冻） Active(速融) or 扩增10mlBufferP2洗涤Il-2、CD3（500IU/ml）剧烈晃动离 心管4-6次使其彻底混匀， 室温放置5min。10days2hrs编码CAR的慢病毒载体转导1ml virus+1.5ml medium+1M Cell10ml冰浴的BufferP3 48hr收获Recovery同上混匀培养洗涤、Il2、培养液检验21FBS+DMEM过滤器冻存室温放置 10min，轻轻挤压活塞将溶菌产物 过滤到50ml离心管中CAR-T cell24hrs扩增病毒粗液过滤0.22m+浓缩(沉降) 48hrs Fab加入2.5mlBufferER充分混匀后 冰孵30min补液，培养分装冻存冻存液（电解质&HSA），300Million，QIAGEN-tip500柱1 dose：1M CAR-T/kg（50kg50M/10%500M） 4 dose病毒粗液过滤0.22m+浓缩(沉降)加入10ml BufferQBT，重力滴下排 空24hrs分析检验表型、活力、无菌、内毒素加入孵育的溶菌液补液，培养重力慢 慢滴下产品放行230mlBufferQC15mlBuffer QN洗脱DNA10.5ml异丙醇病毒液冻存细胞液氮运输至目的地洗 脱 液?标准&检测FAB稳定性15000g ，4离心30min浓缩沉淀输注液解冻回输（速融）5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中)，15000g，4离心10min洗涤跟踪反馈建立针对载体安全性、无菌、纯度、效能、特性以及浓度测定的质量控制试验检测质粒浓度TE重新溶解DNA1. 收到患者血液2. 供着信息3. Ficol
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