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【精品】发酵工程总结 绪论 一、概念发酵工程（Fermentation Engineering）指在最适发酵条件下，在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。 二、发酵工程研究的主要内容发酵工程主要包括代谢工程和发酵工艺两个主要内容具体来说它一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物，以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。 发酵工艺主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。 如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。 四、发酵工程的特点一个完整的发酵过程包括1材料的预处理2生物催化剂的制备3生化反应器及发应条件的选择与监控第二章菌种的 一、工业化生产菌种的要求?能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物?有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强?遗传性能要相对稳定?不易感染它种微生物或噬菌体?产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）?生产特性要符合工艺要求 二、自然界中菌种分离的一般过程(步骤):土样的采取预处理培养菌落的选择产品的鉴定.目的高效地获取一株高产目的产物的微生物. 三、采样时要注意的问题:气候、水分、空气;要广;结合产品的特点;标签地点、时间、气候等 四、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 富集的三种方案?定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。 ?当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑，?不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法.定向培养的方法物理方法加热、膜过滤等但主要是通过培养的方法定向培养的富集方法 1、底物 2、pH条件 3、培养时间 4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。 五、菌落的选出1.从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素2.从形态的角度菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。 如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。 六、菌株选育、分子改造方法基因突变自然选育、诱变育种基因重组:杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等第三章:发酵培养基 一、发酵培养基所需成分 1、碳源1)、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分2)、糖类、油脂、有机酸、正烷烃3)、工业上常用的糖类葡萄糖糖蜜淀粉、糊精 2、氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。 常用的氮源可分为两大类有机氮源和无机氮源。 1)、无机氮源选择合适的无机氮源有两层意义满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH2)、有机氮源成分复杂除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子 3、无机盐和微量元素C、N源，以盐的形式补充使用注意点A对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑B使用时注意盐的形式（pH的变化） 4、生长因子、前体和产物促进剂前体作用前体有助于提高产量和组份用法前体使用时普遍采用流加的方法 5、水 三、发酵培养基的设计和优化 1、培养基成分选择的原则菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导、合适的C、N比1000.22. 0、pH的要求 2、成分含量的确定1）、理论转化率与实际转化率理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。 实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小2）、实验设计培养基成分的含量最终都是通过实验获得的合理的实验方法多因子实验均匀设计、正交实验设计、响应面分析等 3、培养基设计的步骤根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。 4、摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶培养基设计的第一步反应器最终的优化的基础配方 5、培养基设计时注意的一些相关问题:原料及设备的预处理、原材料的质量、发酵特性的影响、灭菌第四章种子的扩大培养 一、种子扩大培养的概念:处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中 二、种子扩大培养的目的生产水平 三、种子的要求强，移种至发酵后，能够迅速生长 四、种子制备的技术概要1接种量的需要2菌种的驯化3缩短发酵时间、保证1总量及浓度能满足要求2生理状况稳定，个体与群体3活力4无杂菌污染主要包括实验室阶段、生产车间阶段实验室阶段1培养物选择的原则2培养基选择的原则3起始接种物的传代问题1培养物选择的原则目的种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物2培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。 3起始接种物的传代问题目的使菌种的传代次数尽可能的少。 1细菌保藏斜面活化斜面2产孢子保藏母斜面子斜面生产车间阶段: 1、培养物的选择原则 2、培养基选择的原则 3、发酵级数的确定 4、接种量的确定 5、种龄 6、种子的质量要求1培养物的选择原则?缩短发酵时间?有利于获得好的发酵结果 2、培养基选择的原则目的获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。 3、发酵级数的确定?级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响?级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。 ?在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面 4、接种量的确定接种量移入种子的体积/接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。 但是一般认为大一点好。 5、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 种龄短菌体太少；种龄长易老化。 6、种子的质量要求量要求达到一定的浓度质:形态（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标C、N、P的含量，pH，酶活等无污染第五章发酵过程动力学的基本概念 一、发酵过程的反应描述及速度概念1.发酵过程反应的描述:X S（底物）X（菌体）P（产物）2发酵研究的内容菌种的找到一个好的菌种发酵过程的工艺控制最大限度发挥菌种的潜力单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称为比速，是生物反应中用于描述反应速度的常用概念3.发酵过程反应速度的描述:X S（底物）X（菌体）P（产物）比生长速率，单位为时间的倒数，有一个精确的生物学含义它表示在固定的生长时间内由已有的数量确定的个体产生的新个体数。 数值越大，群体中产生新个体的速率也越大。 4.微生物生长动力学的基本概念一)微生物在一个密闭系统中的生长情况dsrdt=?rdsdt=?二)微生物的生长动力学、Monod方程?微生物的生长速度f(s,p,T,pH,)?在一定条件下(基质限制)f(S)Monod研究了基质浓度与生长速度的关系Monod方程 (1949)米氏方程:S菌体的生长比速S限制性基质浓度Ks半饱和常数max:最大比生长速度单一限制性基质就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。 2.Monod方程的参数求解(双倒数法)sKS+将Monod方程取倒数可得这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。 二、反应动力学的应用连续培养的操作特性1.连续反应器流入速度=流出速度=F反应器内(V)全混流溶质浓度处处相等基于细胞量的物料平衡dtdXXXXVFXV=?+?0F细胞的进入速率细胞的流出速率细胞的生长速率细胞的死亡速率细胞的积累速率在连续培养系统达到稳定状态时，上式可变为:maxsSKS?=+maxsvvKS=+maxS?=dtdXXXVF=+?（没有加入菌体、连续培养达到稳定时，菌体浓度和基质保持不变）2.D在连续培养技术中称为稀释速率，用符号“D”表示FD(等于培养液在罐中平均停留时间的倒数）在稳定?=V状态下，细胞的比生长速率等于稀释速率。 3.基于限制性营养成分的物料平衡dtdsYXqmXYXSVFSVFspp=?/0?养分进入系统的速率养分流出系统的速率用于生长的养分消耗的速率用于维持的养分消耗的速率用于产物形成的养分消耗的速率养分在系统中积累的速率4.物料衡算（连续培养的反应器特性）第六章氧的供需及对发酵的影响溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。 在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。 一微生物对氧的需求一）描述微生物需氧的物理量1.比耗氧速度或呼吸强度（QO2）单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，单位mmol O2g菌-1h-12.摄氧率(r)单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。 单位mmol O2L二）溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响-1h-1r=QO2.X1.CCr:临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。 2.定义氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度1.三）影响需氧的因素(菌体浓度和QO2)r=QO2.X QO2与遗传因素、菌龄、营养的成分与浓度、有害物质的积累、培养条件有关二反应器中氧的传递一）发酵液中氧的传递方程N传氧速率kmol/m2.h kg:气膜传质系数kmol/mKL:液膜传质系数m/h调节Kla是最常用的方法，kla反映了设备的供氧能力，一般来讲大罐比小罐要好。 二)发酵液中氧的平衡1.发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中2.h.atm Nv体积传氧速率kmol/m3.h Kla:以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数h-1三影响Kla的因素Kla反映了设备的供氧能力，发酵常用的设备为摇瓶与发酵罐。 一）、影响摇瓶kla的因素为装液量和摇瓶机的种类二）影响发酵罐中Kla的因素1.已知在通风发酵罐中，全挡板条件下提高搅拌，调节kla的效果显著 2、实际上对于转速的调节有时是有限度的通风的增加也是有限的蒸发量大、中间挥发性代谢产物带走 3、小型发酵罐和大型发酵罐调节kla的特点?小型发酵罐，转速可调?大型发酵罐，转速往往不可调（大型反应器的合理设计、对现有设备一定要注意工艺配套） 4、影响Kla的其它因素空液体的粘度、气分布器五溶氧浓度的变化及其控制一）典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定Kla下）一般有一个低谷，在对数生长的末期二）发酵过程中溶氧的控制 1、溶氧控制的策略微生物反应(发酵):X SP+X Pirt方程=a+b发酵过程的控制一般策略前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成溶氧控制的一般策略前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。 但是通气增大的时间一定要把握好。 （分阶段控制）三）发酵过程中溶氧浓度监控的意义 1、考察工艺控制是否满足要求 2、其它异常情况的表征染菌、噬菌体、设备和操作故障 3、间接控制的措施第七章发酵过程的代谢控制第 一、二节控制难点过程的不确定性和参数的非线性 一、发酵过程的种类:分批培养、补料分批培养、半连续培养、连续培养了空气的通入和排气。 整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。 微生物生长分为迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。 发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。 在工厂的实际生产中采用这种方法很多。 续培养。 某些品种采取这种方式，如四环素发酵的体积维持恒定 二、排气氧、排气CO2和呼吸熵小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。 二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，有的进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。 CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量呼吸熵 三、产物量的测定:化学法:滴定法、比色法、测压法物理法:许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。 生物法:适用于抗生素效价的测定生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准 四、菌浓测定方法:密度测定法OD600660适合于细菌、酵母 五、酶活力表示法:规定在250C下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。 1分批培养:简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除2补料分批培养:在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的3半连续培养:在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连4连续培养:发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内1排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大2排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成3测粘度、压缩体积法（离心）、静置沉降体积法、光OURCERRQ=第三节发酵过程的pH控制pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。 发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否. 一、发酵过程pH变化的原因 1、基质代谢 （1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。 糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一 （2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 （3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降 2、产物形成某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。 如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。 3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。 二、pH对发酵的影响1.pH对发酵的影响 （1）pH影响酶的活性。 当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻 （2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行 （3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用 （4）pH影响代谢方向pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 2pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响pH对菌体生长影响比产物合成影响小3最佳pH的确定配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况 三、pH的控制 1、调节好基础料的pH。 基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。 若要控制消后pH在6.0，灭菌前pH往往要调到6.56. 82、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等 3、通过补料调节pH在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。 在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH 4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 5、选择合适的pH调节剂 6、发酵的不同阶段采取不同的pH值第四节温度变化及其控制 一、温度对生长的影响不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长,每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。 在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。 在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。 微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。 这就是菌种保藏的原理。 二、微生物与温度相关性的原理 1、微生物对温度的要求不同于它们膜的结构、物理化学性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态。 (1)什么是液晶状态？液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态。 由固态转变为液晶态的温度称为熔点，以T1表示；由液晶态转变为液态的温度称为清亮点，以T2表示。 T1与T2之间的温度称为液晶温度范围。 (2)那么为什么不同微生物对温度的要求不同呢？根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。 嗜热菌只含饱和脂肪酸，而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。 三、温度的影响与控制（一）温度对发酵的影响 1、温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。 2、温度影响发酵方向四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。 温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。 因此对发酵过程中的温度要严格控制。 （二）最适温度的选择 1、根据菌种及生长阶段选择1）微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。 2）根据生长阶段选择在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。 因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。 发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。 (1)如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在 2、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时，温度也该低些。 因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。 3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。 培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。 总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。 要通过反复实践来定出最适温度. 四、发酵过程引起温度变化的因素（一）发酵热Q发酵发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。 所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。 什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。 这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。 发酵热引起发酵液的温度上升。 发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。 1、生物热Q生物在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。 微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。 培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。 生物热的大小与呼吸作用强弱有关在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。 菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。 培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。 如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。 如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大 2、搅拌热Q搅拌在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。 3、蒸发热Q蒸发通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。 此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。 4、辐射热Q辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。 辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。 Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射（二）发酵热的测定一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。 另一种是根据罐温上升速率来计算第五节防止染菌及染菌 一、防止染菌及措施 1、防止种子带菌制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。 沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁。 无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌 2、防止设备渗漏试漏方法可采用水压试漏法。 阀门渗漏可以用集气桶来试漏。 3、防止培养基灭菌不彻底培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌分批灭菌1210C，30分钟连续灭菌罐温1251300C，3045分钟培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。 为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。 防止方法缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。 灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角”。 这些死角蒸汽不能有效达到，常会窝藏耐热芽孢杆菌，所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。 4、防止空气引起的染菌 5、发酵染菌后的措施?染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。 灭菌方法可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。 否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。 ?凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。 ?染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。 特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。 染噬菌体表现为 1、镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则，严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自溶。 2、发酵pH值逐渐上升，48小时之内可达8.0以上，不再下降。 3、发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。 4、生产量甚少或增长缓慢或停止有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验产生噬菌体的原因主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。 染噬菌体对发酵的影响发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。 噬菌体的防治 1、必须建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。 2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面 3、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程，认真地进行种子保管，不使用本身带有噬菌体的菌种。 感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间 4、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。 严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。 对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排放。 5、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种。 6、发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。 发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌染菌对发酵的危害干扰生产菌的正常代谢，降低产量改变pH，降解某些产物污染不同的微生物，不同阶段染菌危害染菌对提炼的危害过滤困难而大幅度降低过滤收率有机溶剂萃取时发生乳化染菌原因设备渗漏、空气带菌、种子带菌、灭菌不彻底、技术管理不善染菌后的措施发酵液必须灭菌后才可放下水道寻找染菌的原因染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒产生噬菌体的原因活菌体随意排放，造成噬菌体的感染源噬菌体的防治建立工厂环境清洁卫生制度感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。 环境用漂白粉消毒选育抗噬菌体第六节发酵过程泡沫的形成与控制泡沫发酵过程起泡的利弊气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的。 （一）泡沫形成的原因 1、气液接触因为泡沫是气体在液体中的粗分散体，产生泡沫的首要条件是气体和液体发生接触。 而且只有气体与液体连续、充分地接触才会产生过量的泡沫。 气液接触大致有以下两类情况 （1）气体从外部进入液体，如搅拌液体时混入气体 （2）气体从液体内部产生。 气体从液体内部产生时，形成的泡沫一般气泡较小、较稳定。 2、含助泡剂在未加助泡剂，但并不纯净的水中产生的泡沫，其寿命在0.5秒之内，只能瞬间存在。 摇荡纯溶剂不起泡，如蒸馏水。 只有摇荡某种溶液才会起泡。 在纯净的气体、纯净的液体之外，必须存在第三种物质，才能产生气泡。 对纯净液体来说，这第三种物质是助泡剂。 3、起泡速度高于破泡速度起泡的难易，取决于液体的成分及所经受的条件；破泡的难易取决于气泡和泡破灭后形成的液滴在表面自由能上的差别；同时还取决于泡沫破裂过程进行得多快这一速度因素。 高起泡的液体，产生的泡沫不一定稳定。 体系的起泡程度是起泡难易和泡沫稳定性两个因素的综合效果。 泡沫产生速度小于泡沫破灭速度，则泡沫不断减少，最终呈不起泡状态；泡沫产生速度等于泡沫破灭速度，则泡沫数量将维持在某一平衡状态；泡沫产生速度高于泡沫破灭速度，泡沫量将不断增加。 4发酵过程泡沫产生的原因 （1）通气搅拌的强烈程度通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。 应先开小通气量，再逐步加大。 搅拌转速也如此。 也可在基础料中加入消泡剂。 （2）培养基配比与原料组成培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。 （3）菌种、种子质量和接种量菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。 菌种生长慢的可以加大接种量，减少泡沫。 （4）灭菌质量培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。 二）起泡的危害 1、降低生产能力在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量 2、引起原料浪费 3、影响菌的呼吸 4、引起染菌 二、泡沫的控制（消泡剂消泡） 1、.消泡剂可使泡沫液局部表面张力降低，因而导致泡沫破灭研究发现低浓度的，表面张力比起泡液低的物质，如果与起泡液成为均相，则促进起泡；如果呈饱和状态，而且被均匀分散在起泡液中，就可能有消泡作用。 2、破泡剂与抑泡剂的区别破泡剂是加到已形成的泡沫中，使泡沫破灭的添加剂抑泡剂是发泡前预先添加而阻止发泡的添加剂 （2）作用机理上的区别破泡过程中，破泡剂不断失效、消耗，而助泡剂却不受影响 3、对消泡剂的要求 （1）在起泡液中不溶或难溶只有不溶或难溶才易于达到过饱和状态 （2）表面张力低于起泡液只有消泡剂分子间作用力小，表面张力低于起泡液，消泡剂微粒才能够在泡膜上浸入及扩展。 值得注意的是，起泡液的表面张力并非溶液的表面张力，而是助泡溶液的表面张力。 （3）与起泡液有一定程度的亲和性消泡过程实际上是泡沫崩溃速度与泡沫生成速度的竞争，所以消泡剂必须能在起泡液中快速分散。 使消泡剂扩散较快，消泡剂活性成分须与起泡液具有一定程度的亲和性4）与起泡液不发生化学反应 （5）挥发性小，作用时间长第八章生物反应器1.发酵罐进行微生物深层培养的装置2.微生物反应器可分为:需氧微生物反应器（通气发酵罐）厌氧微生物反应器（嫌气发酵罐）3.自吸式发酵罐:自吸式发酵罐是一种不需要空气压缩机，而在搅拌过程中自吸入空气的发酵罐。 工作原理自吸式发酵罐的构件主要使自吸搅拌器和导轮，又称转子及定子。 转子由罐底向上升入的主轴带动，当转子转动时空气则由导气管吸入。 在转子启动前，先用液体将转子浸没，然后启动马达使转子转动，由于转子高速旋转，液体或空气在离心力的作用下，被甩向叶轮外缘，在这个过程中，流体便获得能量，若转子的转速愈快，旋转的线速度也愈大，则流体的动能也愈大，流体离开转子时，由动能转变为压力能也愈大，排出的风量也越大。 当转子空膛内的流体从中心被甩向外缘时，在转子中心处形成负压，转子转速愈大，所造成的负压也愈大，由于转子的空膛用管子与大气相通，因此大气的空气不断地被吸入，甩向叶轮的外缘，通过导向叶轮而使气液均匀分布甩出。 由于转子的搅拌作用，气液在叶轮周围形成强烈的混合流（湍流），使刚离开叶轮的空气立即在循环的发酵液中分裂成细微的气泡，并在湍流状态下混合，翻腾，扩散到整个罐中，因此自吸式充气装置在搅拌的同时完成了充气作用。 发酵工程百度试题 一、填空（一） 1、生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种制备、种子培养、发酵和提取精制等下游处理几个过程。 2、根据过滤介质截留的物质颗粒大小的不同，过滤可分为粗滤、微滤、超滤和反渗透四大类。 3、微生物的育种方法主要有三类诱变法，细胞融合法，基因工程法。 4、发酵培养基主要由碳源，氮源，无机盐，生长因子组成。 5、青霉素发酵生产中，发酵后的处理包括过滤、提炼，脱色，结晶。 6、利用专门的灭菌设备进行连续灭菌称为连消，用高压蒸汽进行空罐灭菌称为空消。 7、可用于生产酶的微生物有细菌、真菌、酵母菌。 常用的发酵液的预处理方法有酸化、加热、加絮凝剂。 8、根据搅拌方式的不同，好氧发酵设备可分为机械搅拌式发酵罐和通风搅拌式发酵罐两种。 9、依据培养基在生产中的用途，可将其分成孢子培养基、种子培养基、发酵培养基三种。 10、现代发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用。 11、发酵工程的主要内容包括生产菌种的选育、发酵条件的优化与控制、反应器的设计及产物的分离、提取与精制。 12、发酵类型有微生物菌体的发酵、微生物酶的发酵、微生物代谢产物的发酵、微生物转化发酵、生物工程细胞的发酵。 13、发酵工业生产上常用的微生物主要有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。 14、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢调控育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 15、根据操作方式的不同，液体深层发酵主要有分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。 16、分批发酵全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐，所需的时间总和为一个发酵周期。 17、分批发酵中微生物处于限制性的条件下生长，其生长周期分为延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期。 18、根据搅拌的方式不同，好氧发酵设备又可分为机械搅拌式发酵罐、通风搅拌式发酵罐。 19、下流加工过程由许多化工单元操作组成，通常可以分为发酵液预处理和固液分离、提取、精制及成品加工四个阶段。 20、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢调控育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 21、微生物发酵产酶步骤为先选择合适的产酶菌株、后采用适当的培养基和培养方式进行发酵、微生物发酵产酶、酶的分离纯化、制成酶制剂。 (二)1.淀粉水解糖的制备可分为酸解法、酶解法和酸酶结合法三种。 2.糖酵解途径中的三个重要的关键酶是己糖激酶、磷酸丙糖激酶、丙酮酸激酶。 3.甘油的生物合成机制包括在酵母发酵醪中加入亚硫酸氢钠与乙醛起加成反应和在碱性条件下乙醛起歧化反应。 4.微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率两种方法来表示5.发酵热包括生物热、搅拌热、蒸发热和辐射热等几种热。 6.发酵过程中调节pH值的方法主要有添加碳酸钙法、氨水流加法和尿素流加法。 7.微生物工业上消除泡沫常用的方法有化学消泡；机械消泡两种。 8.谷氨酸等电点提取工艺是根据在等电点时氨基酸的溶解度最小的原理确定的。 9.固定化酶的制备方法可分物理吸附法、载体偶联法、交联法和包埋法等。 10.可比喻成细胞内流通的能量货币是ATP。 11.一条典型的微生物群体生长曲线可分为迟滞期、对数期、稳定期、衰亡期四个生长时期。 12.常用菌种保藏方法有斜面保藏法、沙土管保藏法、液体石蜡保藏法；真空冷冻保藏法等。 13.培养基应具备微生物生长所需要的五大营养要素是碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。 14.电子通过电子传递链传递的最终命运是和_氧（O2）分子结合。 15.提高细胞膜的谷氨酸通透性，必须从控制磷脂的合成着手或者使细胞膜受损伤。 16.根据微生物与氧的关系，发酵可分为有（需）氧发酵、厌氧发酵两大类。 17.在三羧酸循环和糖酵解反应中，一个吸收电子的重要辅酶是_NAD+_。 18.工业微生物育种的基本方法包括自然选育、诱变育种、代谢控制育种、基因重组定向育种等。 19.肠膜明串珠菌进行异型乳酸发酵时，产物为乳酸、乙醇、CO2。 20.诱导酶指存在底物时才能产生的酶，它是转录水平上调节酶浓度的一种方式。 21.谷氨酸对糖的重量理论转化率为81.7%。 22.发酵工业的发展经历了自然发酵，纯培养技术的建立，通气搅拌的好气性发酵技术的建立，人工诱变育种代谢控制发酵技术的建立，开拓新型发酵原料时期，与基因操作技术相结合的现代发酵工程技术等六个阶段。 23.去除代谢终产物主要是通过改变细胞的.膜的通透性来实现。 24.谷氨酸的生物合成的途径包括EMP，HMP，TCA循环，DCA循环，CO2固定作用。 25.获得纯培养的方法有稀释法，划线法，单细胞挑选法，利用选择培养基分离法等方法。 26.生长因子主要包括维生素，氨基酸，碱基，它们对微生物所起的作用是供给微生物自身不能合成但又是其生长必需的有机物质。 27.微生物生长和培养方式，可以分为分批培养，连续培养，补料分批培养三种类型。 28.影响种子质量的主要因素包括培养基，种龄与接种量，温度，pH值，通气和搅拌，泡沫，染菌的控制和种子罐级数的确定。 29.抗生素形成的主要代谢调节机制有分解代谢物调节，磷酸盐调节，NH4+的抑制作用，次级代谢的反馈调节和次级代谢的能荷调节等。 30.空气除菌的方法有.加热杀菌法，静电除菌法，介质过滤除菌法。 31.发酵产物的浓缩和纯化过程一般包括发酵液预处理，提取，精制。 32.菌种扩大培养的目的是为每次发酵罐的投料提供数量相当的代谢旺盛的种子。 33.碳源物对微生物的功能是构成细胞物质和代谢产物、异养微生物的主要能源物质_。 34.微生物的营养类型可分为光能自养型，光能异养型，化能自养型，化能异养型。 35.在微生物研究和生长实践中，选用和设计培养基的最基本要求是_目