第十三章 抗体库

第十三章抗体库 单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑 在诊断 治疗 预防和蛋白质提纯等方面显示出重要作用和广阔的应用前景 然而在体内的应用 由于是异源性蛋白易引起人抗小鼠抗体反应 影响应有的疗效 在小鼠杂交瘤技术建立不久 就开始了人杂交瘤技术的研究 但历经20多年这项技术尚未获得真正的突破 其主要原因有 1 难于获得稳定分泌人抗体的杂交瘤细胞 2 难于获得分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞 人源抗体的生产在技术上难以克服融合率低 建株难 不稳定 产量低 人体不能随意免疫等问题 随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学的深入研究 应用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗的基因 其着手点在于尽量减少抗体中的鼠源成分 但又尽量保留原有的抗体特异性 从而创造出新型抗体 基因工程抗体 eg 将鼠源性单抗可变区与人恒定区基因拼接起来形成的嵌合抗体 通过置换人源单抗中的CDR区的改形抗体以连接肽将VH和VL连接起来的单链抗体 抗体库特别是噬菌体展示技术的创建 被誉为又一次革命性进展 由于目前大部分基因工程抗体还是基于小鼠杂交瘤 鼠源蛋白的问题尚未彻底解决 抗体库技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体 不经细胞融合 甚至不经免疫 针对制备任何抗原的单克隆抗体 它为人单抗的制备提供了一条非常有效的方法 基因工程抗体的进展已使抗体的制备和应用进入了又一个全新的时代 噬菌体展示技术的形成 1982年 Dulbecco首次提出源于致病因子的具有免疫原性的外源抗原决定簇或多肽可以在噬菌体或其它病毒表面被展示的概念 1985年 Smith第一次证实丝状噬菌体fd的基因组能够通过基因工程手段将外源抗原决定簇与其次要外壳蛋白融合并同时展示在噬菌体表面 1990年 Smith小组又证明展示的抗原决定簇能被相应的抗体所识别 从而创建了噬菌体展示技术 丝状噬菌体的生物学特征 丝状噬菌体主要包括大肠杆菌丝状噬菌体M13 fd f1等 它们的亲缘关系十分密切 特征相似 都包含一个单链环状DNA分子 DNA同源性高达98 这种噬菌体只能通过大肠杆菌的性菌毛才能将其DNA注入细菌 因此它只侵染含F因子的雄性大肠杆菌 外源多肽或蛋白在丝状噬菌体外壳蛋白上的展示 噬菌体展示技术是将目的基因与编码噬菌体外壳蛋白基因相连 并插入到噬菌体表达载体 使多肽或蛋白与其外壳蛋白氨基端融合并展示在噬菌体表面 被展示的多肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性 从表达各种各样外源蛋白的噬菌体群体 库 中筛选出带有特异外源蛋白的重组噬菌体 一般采用亲和筛选 即利用在噬菌体表面上展示的多肽可以与特定的选择体进行亲和结合 从而得以分离 先将选择体固相化 然后使文库中重组噬菌体所展示的目的多肽与固相化选择体亲和结合 通过洗脱就可以收集到带有目的多肽或蛋白的重组噬菌体 并可利用噬菌体再感染大肠杆菌得以进一步扩增 通过一轮亲和结合 洗脱 扩增 即所谓淘筛的过程 可以使噬菌体富集约100 1000倍 经过几轮淘筛可以从噬菌体文库中筛选到带有目的基因的重组噬菌体 Elutedpoolofphageisamplified andtheprocessisrepeatedforatotalof3 4rounds After3 4rounds individualclonesisolatedandsequenced 生物淘筛示意图 噬菌体展示的重要意义在于 1 被选择的多肽展示在噬菌体表面 在获得多肽的同时也得到了编码该多肽的基因序列 2 亲和选择可以得到亲和力强的重组噬菌体 整个过程与动物体内抗原对抗体克隆选择原理相同 噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白 融合 使之表达于噬菌体颗粒的表面 这就形成了噬菌体抗体 将全套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来 组建到表达载体内 再表达到许多噬菌体颗粒表面 则得到噬菌体抗体库 它可以使人们在体外模拟体内抗体产生过程 制备出针对任何抗原的单克隆抗体 噬菌体展示肽库构建原理图 合成随机片段载体噬菌体RFDNA或噬菌粒PCR扩增酶切目的片段连接插入外源基因的噬菌体DNA或噬菌粒DNA多次电转化大肠杆菌转化菌肽库培养产生病毒子辅助噬菌体侵染噬菌粒肽库 天然抗体库和抗体的获得 从未经免疫的动物或人外周血淋巴细胞 骨髓细胞 脾细胞获得B淋巴细胞 减少因抗原刺激所引起的B细胞谱的变化 从这些细胞中提取RNA 反转录成cDNA 用与抗体VH VL支架序列FR1 FR4互补的寡核苷酸为引物 以PCR方法获得V基因 克隆到噬菌体或噬菌粒载体中表达并展示 这种噬菌体抗体库称为天然抗体库 天然噬菌体抗体库的主要优点 1 建一个抗体库 可用于多种不同抗原2 可得到人源抗体3 可得到针对自身抗原 非免疫原性的或毒性物质的抗体4 抗体产生用2 4轮筛选 仅需两周左右的时间5 当抗体库容量很大时 可得到高亲和力抗体 天然噬菌体抗体库的主要不足 1 抗体库库容量小时 得到的抗体亲和力较低2 建库费时 费力3 所谓 天然 并非真正完全天然 受个体发育限制如对自身反应性克隆的抑制或对自身抗原的免疫耐受 B细胞供者的不明确免疫史 激活的B细胞及浆细胞可能存在 它们的抗体可变区基因已经历了超突变 影响了B细胞的多样性 合成抗体库和抗体的获得 随着人们对机体内抗体产生过程中DNA重排复杂过程的清楚认识 以及对许多抗体结构的研究 业已证明大多数抗体的抗原结合位点位于互补决定区内 这为完全脱离自然个体构建抗体分子奠定了基础 在V基因组装时 引入人工合成的部分随机CDR 即利用错配PCR 循环多次的PCR扩增 在V区或CDR区诱发随机点突变 V基因可以是源于胚系的V基因段或是经重排的V基因 这种方法构建的噬菌体抗体库称合成库 其最大的优点是V基因局部可变性 全库的多样性是可控的 合成抗体库也存在技术上的难题 如CDR3长度变化多 氨基酸组成10 30个 随机合成产生的组合达天文数字 远远超过目前构建抗体库的能力 另外 机体内CDR区某些部位氨基酸有一定要求 随机合成构建的抗体库中有相当一部分不能形成有效抗体分子 因此 有待于人们对抗体分子结构更深入了解和技术上进一步改进 免疫抗体库和抗体的获得 从免疫动物或某些情况下人的免疫B细胞中 如经抗原免疫的小鼠脾淋巴细胞或致敏的人PBLs提取mRNA 获得V基因 由此