mm_fs_cng_0485 食品添加剂固定化葡萄糖异构酶制剂.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632MM_FS_CNG_0485食品添加剂 固定化葡萄糖异构酶制剂MM_FS_CNG_0485食品添加剂固定化葡萄糖异构酶制剂1.适用范围本标准适用于微生物发酵法生成的酶经固定化制成的固定化葡萄糖异构酶。2.技术要求2.1.外观：不结块，无异味。2.2.项目和指标项 目指 标酶活力，ug不低于2000生产能力，tkg不低于1.5酶活力保存率（）0.5，三个月不低于85强度合格重金属（以Pb计），不超过0.004铅，不超过0.001砷（以As计），不超过0.0003黄曲霉毒素B，不超过0.0000005大肠菌群，个100g不超过30沙门氏菌不得检出注：生产使用的菌株和固定化酶需经毒性鉴定方能使用。3.试验方法3.1.外观：用目视判定。3.2.酶活力测定3.2.1.酶促反应方法（适用于链霉菌产生的葡萄糖异构酶）.试剂70（WV）葡萄糖溶液：称取70克分析纯葡萄糖加入煮沸的蒸馏水中，再加热使其完全溶解，冷却用蒸馏水定容至100mL；pH7.5磷酸缓冲溶液：0.2M磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O），用蒸馏水溶解并稀释至1000mL；0.2M磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O），用蒸馏水溶解并稀释至1000mL；取一定量上述二溶液混合，用pH计校正pH至7.5；0.5M硫酸镁溶液：称取12.3g硫酸镁（MgSO47H2O），加蒸馏水溶解，用蒸馏水定容至100mL；0.5M高氯酸溶液：量取21mL高氯酸（HClO4），用蒸馏水定容至500mL；.反应：固定称取合适量的酶（用固定化酶完整颗粒，不磨碎），用0.02M磷酸缓冲液（pH7.5）1mL在37浸泡16h，加磷酸缓冲液1.5mL，硫酸镁溶液0.5mL，葡萄糖溶液1.5mL，再加蒸馏水调整至总体积5mL，70反应1h，加高氯酸溶液5mL终止反应，然后测定果糖含量。3.2.2.酶促反应方法（适用于游动放线菌产生的葡萄糖异构酶）。.试剂3.0M葡萄糖溶液：称取分析纯无水葡萄糖54g，加煮沸蒸馏水使其溶解，并定容至100mL；0.3M磷酸缓冲溶液（pH7.0）：称取107.4g分析纯磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O），加蒸馏水溶解并定容至1L（A液）：称取46.3g分析纯磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O），加蒸馏水溶解，并定容至1L（B液）。各取一定量A、B液混合，用pH计校正pH至7.0；0.03M硫酸镁溶液：称取0.739g分析纯硫酸镁（MgSO47H2O），加蒸馏水溶解，并定容至100mL；0.003M硫酸钴溶液：称取0.0843g分析纯硫酸钴（CoSO47H2O），加蒸馏水溶解，并定容至100mL。.反应：固定称取合适量的酶（用固定化酶完整颗粒，不磨碎），用0.03M磷酸缓冲液（pH7.0）1mL在37浸泡16h，加磷酸缓冲溶液0.5mL，硫酸钴溶液0.5mL，硫酸镁溶液0.5mL，葡萄糖溶液2.5mL，加蒸馏水调整至总体积5mL。75反应1h，加高氯酸溶液5mL终止反应，然后测定果糖含量。3.2.3.果糖测定法（半胱氨酸-咔唑法）.试剂1.5（WV）半胱氨酸盐酸盐溶液：称取生化试剂纯半胱氨酸盐酸盐0.375g，用蒸馏水溶解，并稀释定容至25mL；0.12（WV）咔唑酒精溶液：称取咔唑30.0mg，用无水酒精溶解并定容至25mL，放置在棕色瓶中，24h后使用；硫酸溶液：量取分析纯浓硫酸450mL，在不断搅拌下徐徐倒入190mL蒸馏水中；标准果糖溶液：称取预先在55真空干燥至恒重的分析纯果糖125.0mg，用蒸馏水定容至25mL（5mgmL），存放于冰箱中备用。使用时稀释100倍（50gmL）。.测定程序.1.标准曲线的绘制：取25mL比色管分别加50gmL的果糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8mL，再用蒸馏水分别补充至1mL，然后每管中加入0.2mL半胱氨酸盐酸盐溶液，6mL硫酸溶液，摇匀后，立即加入0.2mL咔唑酒精溶液，摇匀，于60水浴中保温10min，取出用水冷却呈红紫色。用10mm光径的比色皿，在560nm波长下比色，以吸光度对果糖作图，即得标准曲线。.2.样品测定：将或的反应终止溶液适当稀释后，准确吸取1.0mL，使其中果糖含量在1040g范围内，然后按.2的后步操作进行。根据获得的吸光度在标准曲线图上查得相应的果糖量。.计算Xu（1）W式中：X 酶活力，ug；u 酶单位，u；W 样品量，g。注：gIU酶单位的规定：酶在上述方法或方法的反应条件下，每小时生成1mg果糖的酶量规定为1个单位，以GIU表示。将其除以10.8即为国际单位，此时以1GIU表示。 果糖（mgh）根据吸光度在标准曲线图上查得的果糖微克数稀释倍数1000。3.3.生产能力生产能力是指在适宜的工作条件下，酶活力降至原来活力的10时，每公斤绝干固定化酶能转化绝干葡萄糖为果葡糖的量，以tkg表示。果葡糖中果糖含量为42（WW）。PS（2）W1000式中：P 生产能力，tkg；S 转化糖量的总和，kg；W 化时所用固定化酶的量，kg。3.4.酶活力保存率X2E100（3）E0式中：X2 酶活力保存率，；E 剩余活力；E0 原酶活力。3.5.强度固定化酶用60蒸馏水浸没，然后缓慢搅动20h，再用两个手指用力压之，放开后不成浆（或极少量成浆）仍硬，为合格。否则，为不合格。3.6.重金属测定3.6.1.试剂硝酸：分析纯；硫酸：分析纯；盐酸：分析纯；6M盐酸：量取500mL盐酸，用蒸馏水稀释至1000mL；1M盐酸：量取83mL盐酸，用蒸馏水稀释至1000mL氨水：分析纯；5M氨水：量取333mL氨水，用蒸馏水稀释至1000mL；1M氨水：量取66mL氨水，用蒸馏水稀释至1000mL；pH3.5的乙酸盐缓冲液：称取25.0g乙酸铵溶于25mL蒸馏水中，加45mL6M盐酸，用稀盐酸或稀氨水调节pH至3.5，用蒸馏水稀释至100mL；1酚酞指示液：按标准配制。饱和硫化氢水：按标准配制（此溶液于使用前制备）。铅标准溶液（每毫升含0.01mg铅）：按标准配制。临用前用蒸馏水准确稀释10倍，使成每毫升相当于0.01mg铅。3.6.2.测定手续.样品处理称取5.0g样品置于250mL凯氏烧瓶或三角烧瓶中，加1015mL硝酸浸润样品放置片刻（或过夜）后，缓缓加热，待作用缓和后稍冷，沿瓶壁加入5mL硫酸再缓缓加热，至瓶中溶液开始变成棕色，不断滴加硝酸（如有必要可滴加些高氯酸）至有机质分解完全，继续加热，至生成大量的二氧化硫白色烟雾，最后溶液应呈无色或微带黄色。冷却后将溶液移入50mL容量瓶中，用水洗涤三角烧瓶，将洗液并入容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混匀，每10mL该溶液相当于1g样品。取同样量的硝酸、硫酸按上述方法作试剂空白试验。.样品测定.1.溶液A：吸取含铅标准液1mL于50mL纳氏比色管中，加水至25mL混匀，加1滴1酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水调节pH至中性（酚酞红色褪去）。加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，用蒸馏水稀释至40mL，混匀备用。.2.溶液B：取一支与溶液A所配套的纳氏比色管，加入20mL样品液，加蒸馏水至25mL混匀，加1滴1酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水调节pH至中性（酚酞红色褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，用蒸馏水稀释至40mL，混匀备用。.3.溶液C：取一支与溶液A、B所配套的纳氏比色管，加入与溶液B相同量的相同的样品液，再加入与溶液A相同量的铅标准液，加蒸馏水至25mL，混匀，加1滴1酚酞指示液，用稀盐酸或稀氨水调节pH至中性（酚酞红色刚褪去），加入pH3.5的乙酸盐缓冲液5mL，用蒸馏水稀释至40mL，混匀备用。.4.向各管中加入10mL新鲜制备的硫化氢饱和液，混匀，放置10min后在白色背景下观察，溶液B的色度不得深于溶液A的色度，溶液C的色度应与溶液A的色度相当或深于溶液A的色度。3.7.铅 二硫腙比色法3.7.1.原理概要 样品经消化后，在pH=8.59.0时，铅离子与二硫腙生成红色络合物，溶于三氯甲烷。加入柠檬酸铵、氰化钾和盐酸羟胺等，防止铁、铜、锌等离子干扰，与标准系列比较定量。3.7.2.主要仪器和试剂.主要试剂氨水(1:1)；盐酸(1:1)；酚红指示液(1 g/L)：称取0.10g酚红，用少量多次乙醇溶解后移入100mL容量瓶中定容；盐酸羟胺溶液(200 g/L)：称取20g盐酸羟胺，溶解至50mL，加2滴酚红指示液，加氨水(1:1)，调pH至8.59.0，用二硫腙-三氯甲烷溶液提取至三氯甲烷层绿色不变为止，再用三氯甲烷洗二次，弃去三氯甲烷层，水层加盐酸(1:1)呈酸性，加水至100 mL；柠檬酸铵溶液(200g/L)：称取50g柠檬酸铵，溶于100mL水中，加2滴酚红指示液，加氨水(1:1)，调pH至8.59.0，用二硫腙-三氯甲烷溶液提取数次，每次1020mL，至三氯甲烷层绿色不变为止，弃去三氯甲烷层，再用三氯甲烷洗二次，每次5mL，弃去三氯甲烷层，加水稀释至250mL；氰化钾溶液(100g/L)：称取10.0g氰化钾，用水溶解后稀释至100mL；三氯甲烷：不应含氧化物； 检查方法：量取10mL三氯甲烷，加25mL新煮沸过的水，振摇3min，分层后，取10mL水液，加数滴碘化钾溶液(150g/L)及淀粉指示液，振摇后不显蓝色； 处理方法：于三氯甲烷中加入1/101/20体积的硫代硫酸钠溶液(200g/L)洗涤，再用水洗后加入少量无水氯化钙脱水后进行蒸馏，弃去最初及最后的1/10馏出液，收集中间馏出液备用。；淀粉指示液；硝酸(1:99)；二硫腙三氯甲烷溶液(0.5g/L)：保存冰箱中，必要时用下述方法纯化。称取0.5g研细的二硫腙，溶于50mL三氯甲烷中，如不全溶，可用滤纸过滤于250mL分液漏斗中，用氨水(1:99)提取三次，每次100mL，将提取液用棉花过滤至500mL分液漏斗中，用盐酸(1:1)调至酸性，将沉淀出的二硫腙用三氯甲烷提取23次，每次20mL，合并三氯甲烷层，用等量水洗涤二次，弃去洗涤液，在50水浴上蒸去三氯甲烷。精制的二硫腙置硫酸干燥器中，干燥备用。或将沉淀出的二硫腙用200，200，100 mL三氯甲烷提取三次，合并三氯甲烷层为二硫腙溶液。二硫腙使用液：吸取1.0mL二硫腙溶液，加三氯甲烷至10mL混匀。用1cm比色杯，以三氯甲烷调节零点，于波长510nm处测吸光度(A)，用式(3)算出配制100 mL二硫腙使用液(70透光率)所需二硫腙溶液的毫升数(V)； (3) 硝酸-硫酸混合液(41)；铅标准溶液：精密称取0.1598g硝酸铅，加10mL硝酸(199)，移入100mL容量瓶中定容；铅标准使用液(10.0g/ml)：吸取1.0mL铅标准溶液，置于100mL容量瓶中，定容。.仪器分光光度计。3.7.3.过程简述.样品预处理.1粮食、豆类去杂物后，磨碎，过20目筛，储于塑料瓶中，保存备用。.2蔬菜、水果、鱼类、肉类及蛋类等水分含量高的鲜样：用食品加工机或匀浆机打成匀浆，储于塑料瓶中，保存备用。.样品消化.1.硝酸-硫酸法：.1.1含水份少的固体食品：称取5.00g或10.00g粉碎样品，置于250500mL定氮瓶中，先润湿，加数粒玻璃珠、1015mL硝酸，小火缓缓加热，待作用缓和，放冷。加5mL或10mL硫酸，再加热，至液体开始变成棕色时，不断滴加硝酸溶液至有机质分解完全。加大火力，至产生白烟，白烟冒净后，瓶内液体再产生白烟为消化完全，该溶液应澄明无色或微带黄色，放冷。加20mL水煮沸，至产生白烟为止，如此处理两次，放冷。将溶液移入50mL或100mL容量瓶中，洗涤定氮瓶，定容。溶液每10mL相当于1g样品，相当加入硫酸量1mL。按同一方法做试剂空白试验。.1.2 蔬菜、水果：称取25.00g或50.00g洗净打成匀浆的样品，置于250500mL定氮瓶中，加数粒玻璃珠、1015mL硝酸，以下按“含水份少的固体”食品自“放置片刻”起依法操作，溶液每10mL相当于5g样品，相当加入硫酸1mL。.1.3 酱、酱油、醋、冷饮、豆腐、腐乳、酱腌菜等：称取10.00g或20.00g样品，置于250500mL定氮瓶中，加数粒玻璃珠、515mL硝酸。以下按“含水份少的固体”自“放置片刻”起操作，溶液每10mL相当于2g或2mL样品。.1.4 含乙醇饮料或含二氧化碳饮料：吸取10.00mL或20.00mL样品，置于250500mL定氮瓶中。加数粒玻璃珠，先用小火加热除去乙醇或二氧化碳，再加510mL硝酸，混匀后以下按“含水份少的固体”自“放置片刻”起依法操作，溶液每10mL相当于2mL样品。按相同操作方法做试剂空白试验。.1.5含糖量高的食品：称取5.00g或10.0g样品，置于250500mL定氮瓶中，先润湿，加数粒玻璃珠、510mL硝酸混合后，摇匀。加5mL或10mL硫酸，待停止起泡沫后，先用小火缓缓加热，不断补加硝酸，待泡沫全部消失后再加大火力，至有机质分解完全，发生白烟，溶液应澄明无色或微带黄色，放冷。以下按“含水份少的固体”自“加20mL水煮沸”起依法操作。.1.6水产品：取可食部分样品捣成匀浆，称取5.00g或10.0g置于250500mL定氮瓶中，加数粒玻璃珠，510 mL硝酸，混匀后，以下按“含水份少的固体”自“沿瓶壁加入5mL或10mL硫酸”起依法操作。.测定 吸取10.0mL消化后的定容溶液和同量的试剂空白液，分别置于125mL分液漏斗中，各加水至20mL。吸取0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50mL铅标准使用液，分别置于125mL分液漏斗中，各加1 mL硝酸至20mL。于样品消化液、试剂空白液和铅标准液中各加2mL柠檬酸铵溶液(20g/L)，1 mL盐酸羟胺溶液(200g/L)和2滴酚红指示液，用氨水(11)调至红色，再各加2mL氰化钾溶液(100g/L)，混匀。各加5.0mL二硫腙使用液，剧烈振摇1 min，分层后，三氯甲烷层经脱脂棉滤入1cm比色杯中，以三氯甲烷调节零点于波长510 nm处测吸光度，各点减去零管吸收值后，绘制标准曲线或计算一元回归方程，样品与曲线比较。3.7.4.结果计算(4) 式中：X3样品中铅的含量，mg/kg或mg/L；m7测定用样品消化液中铅的质量，g；m8试剂空白液中铅的质量，g；m9样品质量(体积)，g(mL)；V6样品消化液的总体积，mL；V7测定用样品消化液体积，mL。3.7.5.允许差 相对偏差10。3.8.砷 银盐法3.8.1.原理概要样品经消化后，以碘化钾、氯化亚锡将高价砷还原为三价砷，然后与锌粒和酸产生的氢生成砷化氢，经银盐溶液吸收后，形成红色胶态物，与标准系列比较定量。3.8.2.主要仪器和试剂.主要试剂硝酸、硫酸、盐酸；氧化镁；无砷锌粒；硝酸高氯酸混合溶液(41)；硝酸镁溶液(150g/L)；碘化钾溶液(150g/L)：贮存于棕色瓶中；酸性氯化亚锡溶液：称取40g氯化亚锡(SnCl2.2H2O)，加盐酸溶解并稀释至100mL，加入金属锡粒；盐酸(11)；乙酸铅溶液(100g/L)；乙酸铅棉花：用乙酸铅溶液(100g/L)浸透脱脂棉后，压除多余溶液，并使疏松，在100以下干燥后，贮存于玻璃瓶中；氢氧化钠溶液(200g/L)；硫酸(694)；二乙基二硫代氨基甲酸银-三乙醇胺-三氯甲烷溶液：称取0.25g二乙基二硫代氨基甲酸银，置于乳钵中，加少量三氯甲烷研磨，移入100mL量筒中，加入1.8mL三乙醇胺，再用三氯甲烷分次洗涤乳钵，洗液一并移入量筒中，再用三氯甲烷稀释至100mL，放置过夜。滤入棕色瓶中贮存；砷标准溶液(0.10mg/ml):准确称取0.1320g在硫酸干燥器中干燥过的或在100干燥2h的三氧化二砷，加5mL氢氧化钠溶液(200g/L)，溶解后加25mL硫酸(694)，移入1000mL容量瓶中，加新煮沸冷却的水稀释至刻度，贮存于棕色玻塞瓶中。此溶液每毫升相当于砷；砷标准使用液(1.0g/ml)：吸取1.0mL砷标准溶液，置于100mL容量瓶中，加1mL硫酸(694)，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于1.0g砷。仪器可见分光光度计；测砷装置：见图1。 图 11150mL锥形瓶；2导气管；3乙酸铅棉花；410mL刻度离心管吸收管：10mL刻度离心管作吸收管用。3.8.3.过程简述样品消化.1硝酸-硫酸法.1.1含水份少的固体食品：称取5.00g或10.00g粉碎样品，置于250500mL定氮瓶中，先润湿，加数粒玻璃珠、1015mL硝酸高氯酸混合液，放置片刻小火缓缓加热，待作用缓和，放冷。沿壁加5mL或10mL硫酸，再加热，至液体开始变成棕色时，不断滴加硝酸高氯酸混合液至有机质分解完全。加大火力，至产生白烟，白烟冒净后，瓶内液体再产生白烟为消化完全，该溶液应澄明无色或微带黄色，放冷。加20mL水煮沸，至产生白烟为止，如此处理两次，放冷。将溶液移入50mL或100mL容量瓶中，洗涤定氮瓶，洗液并入定量瓶内，定容。溶液每10mL相当于1g样品，相当加入硫酸量1mL。按同一方法做试剂空白试验。.1.2蔬菜、水果：称取25.00g或50.00g洗净打成匀浆的样品，置于250500mL定氮瓶中，加数粒玻璃珠、1015mL硝酸高氯酸混合液，以下按(.1.1)自“放置片刻”起依法操作，溶液每10mL相当于5g样品，相当加入硫酸1mL。.1.3酱、酱油、醋、冷饮、豆腐、腐乳、酱腌菜等：称取10.00g或20.00g样品或吸取10mL或20mL液体样品，置于250500mL定氮瓶中，加数粒玻璃珠、515mL硝酸高氯酸混合液。以下按(.1.1)自“放置片刻”起操作，定溶后的溶液每10mL相当于2g或2mL样品。.1.4含乙醇饮料或含二氧化碳饮料：吸取10.00mL或20.00mL样品，置于250500mL定氮瓶中。加数粒玻璃珠，先用小火加热除去乙醇或二氧化碳，再加510mL硝酸高氯酸混合液，混匀后以下按.1.1自“放置片刻”起依法操作，溶液每10mL相当于2mL样品。按相同操作方法做试剂空白试验。.1.5含糖量高的食品：称取5.00g或10.0g样品，置于250500mL定氮瓶中，先润湿，加数粒玻璃珠、510mL硝酸混合后，摇匀。加5mL或10mL硫酸，待停止起泡沫后，先用小火缓缓加热，不断补加硝酸高氯酸混合液，待泡沫全部消失后再加大火力，至有机质分解完全，发生白烟，溶液应澄明无色或微带黄色，放冷。以下按（.1.1）自“加20mL水煮沸”起依法操作。.1.6水产品：取可食部分样品捣成匀浆，称取5.00g或10.0g置于250500mL定氮瓶中，加数粒玻璃珠，510mL硝酸混合液，混匀后，以下按()自“沿瓶壁加入5mL或10mL硫酸”起依法操作。测定吸取一定量的消化后的定容溶液(相当于5g样品)及同量的试剂空白液，分别置于150mL锥形瓶中，补加硫酸至总量为5mL，加水至5055mL。.1标准曲线的绘制：吸取0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL砷标准使用液，分别置于150mL锥形瓶中，加水至40mL，再加10mL硫酸(11)。.2用湿法消化液：于样品消化液，试剂空白液及砷标准溶液中各加3mL碘化钾溶液(150g/L)，0.5mL酸性氯化亚锡溶液，混匀，静置15min。各加入3g锌粒，在测砷装置中反应45min，取下离心管，加三氯甲烷补足4mL。用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长520nm处测吸光度，绘制标准曲线。.3用灰化法消化液：取灰化法消化液及试剂空白液分别置于150mL锥形瓶中。吸取0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL砷标准使用液，分别置于150mL锥形瓶中，加水至43.5mL，再加6.5mL盐酸。以下按(4.2.2)自“于样品消化液”起依法操作。3.8.4.结果计算：(1)式中：X样品中砷的含量，mg/kg或mg/L；m1测定用样品消化液中砷的质量，g；m2试剂空白液中砷的质量，g；m样品质量(体积)，g(mL)；V1样品消化液的总体积，mL；V2测定用样品消化液的体积，mL。3.8.5.允许差相对偏差10。3.9.黄曲霉毒素B1方法一3.9.1.原理概要样品中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。3.9.2.主要试剂三氯甲烷；正已烷或石油醚(沸程3060或6090)；甲醇；苯；乙腈；无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水；丙酮；以上试剂在试验时先进行一次试剂空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸；硅胶g：薄层色谱用；三氟乙酸；无水硫酸钠；氯化钠；苯-乙腈混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀；甲醇水溶液：55:45；黄曲霉毒素B1标准溶液；仪器校正：测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准确称取25mg经干燥的重铬酸钾(基准级)，用硫酸(0.51000)溶解后并准确稀释至200mL，相当于c(K2Cr2O7)0.0004mol/L。再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中，加硫酸(0.51000) 稀释至刻度，相当于0.0002mol/L溶液。再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中，加硫酸(0.51000)稀释至刻度，相当于0.0001mol/L溶液。用1cm石英杯，在最大吸收峰的波长(接近350nm处)用硫酸(0.51000)作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度，并按式(1)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值； (1)式中：E1重铬酸钾溶液的摩尔消光系数；A测得重铬酸钾溶液的吸光度；c重铬酸钾溶液的摩尔浓度。再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数3160比较，即求出仪器的校正因素；(2)式中：f使用仪器的校正因素；E测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。若f大于0.95或小于1.05，则使用仪器的校正因素可略而不计；黄曲霉毒素B1标准溶液的制备：准确称取11.2mg黄曲霉毒素B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光，置于4冰箱保存。该标准溶液约为10g/mL。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值；计算(3)式中：X1黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度，g/mL；A测得的吸光度值；f使用仪器的校正因素；M黄曲霉毒素B1的分子量312；E2黄曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数，19800；根据计算，用苯-乙腈混合液调到标准溶液浓度恰为10.0g/mL，并用分光光度计核对其浓度；纯度的测定：取5L 10g/mL黄曲霉毒素B1标准溶液，滴加于涂层厚度0.25mm的硅胶G薄层板上，用甲醇-三氯甲烷(1:24)与丙酮-三氯甲烷(2:23)展开剂展开，在紫外光灯下观察荧光的产生，必须符合以下条件：在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点。原点上没有任何残留的荧光物质；黄曲霉毒素B1标准使用液：准确吸取1mL标准溶液(10g/mL)于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0g黄曲霉毒素B1。吸取1.0mL此稀释液，置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2g黄曲霉毒素B1。再吸取黄曲霉毒素B1标准溶液(0.2g/mL)1.0mL置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.04g黄曲霉毒素B1；次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO310H2O)溶于500mL温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。3.9.3.主要仪器小型粉碎机；样筛；电动振荡器；全玻璃浓缩器；玻璃板：5 cm20cm；薄层板涂布器；展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm；紫外光灯：100125W，带有波长365nm滤光片；微量注射器或血色素吸管。3.9.4.过程简述.取样样品中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒可以左右测定结果，而且有毒霉粒的比例小，同时分布不均匀。为避免取样带来的误差，必须大量取样，并将该大量样品粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批样品的相对可靠的结果，因此采样必须注意以下几点。.1.根据规定采取有代表性样品。.2.对局部发霉变质的样品检验时，应单独取样。.3.每份分析测定用的样品应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至0.51kg，然后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，混匀。花生样品全部通过10目筛，混匀。或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等样品不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批样品可采取3份大样作样品制备及分析测定用，以观察所采样品是否具有一定的代表性。.提取.1.玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等甲法：称取20.00g粉碎过筛样品(面粉、花生酱不需粉碎)，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜，于65水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却23min后，准确加入1mL苯-乙腈混合液(或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入1mL苯-乙腈混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。乙法(限于玉米、大米、小麦及其制品)：称取20.00g粉碎过筛样品于250mL具塞锥形瓶中，用滴管滴加约6mL水，使样品湿润，准确加入60mL三氯甲烷，振荡30min，加12g无水硫酸钠，振摇后，静置30min，用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于100mL具塞锥形瓶中。取12mL滤液(相当4g样品)于蒸发皿中，在65水浴上通风挥干，准确加入1mL苯-乙腈混合液，以下按(.1.1)自“用带橡皮头的滴管”起，依法操作。.2.花生油、香油、菜油等：称取4.00g样品置于小烧杯中，用20mL正己烷或石油醚将样品移于125mL分液漏斗中。用20mL甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2min，静置分层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，以下按(.1.1)自“振摇2min，静置分层”起，依法操作。.3.酱油、醋：称取10.00g样品于小烧杯中，为防止提取时乳化，加0.4g氯化钠，移入分液漏斗中，用15mL三氯甲烷分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中。以下按()自“振摇2min，静置分层”起，依法操作，最后加入2.5mL苯-乙腈混合液，此溶液每毫升相当于4g样品。或称取10.00g样品，置于分液漏斗中，再加12mL甲醇(以酱油体积代替水，故甲醇与水的体积比仍约为5545)，用20mL三氯甲烷提取，以下按(.1.1)自“振摇2min，静置分层”起，依法操作。最后加入2.5mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4g样品。.4.干酱类：称取20.00g研磨均匀的样品，置于250mL 具塞锥形瓶中，加入20mL正己烷或石油醚与50mL甲醇水溶液。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式快速定性滤纸过滤，滤液静置分层后，取24mL甲醇水层(相当8g样品，其中包括8g干酱类本身约含有4mL水的体积在内)置于分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，以下按(.1)自“振摇2min，静置分层”起，依法操作。最后加入2mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4g样品。.5.发酵酒类：同.3处理方法，但不加氯化钠。3.9.5.测定.单向展开法.1.薄层板的制备：称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量23倍左右的水，用力研磨12min至成糊状后立即倒于涂布器内，推成5cm20cm，厚度约0.25mm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后，在100活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存23d，若放置时间较长，可再活化后使用。.2.点样：将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约3mm。在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：第一点：10 L黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04g/mL)。第二点：20 L样液。第三点：20 L样液10 L 0.04 g/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。第四点：20 L样液10 L 0.2g/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。.3.展开与观察：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮-三氯甲烷(892)，展开1012cm，取出。在紫外光下观察结果，方法如下。由于样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准使用液，可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒素B1荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1为0.0004g，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002g，主要起定位作用。若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5g/kg以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。.4.确证试验：为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。第一点：10L 0.04g/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。第二点：20L样液。于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min后，使热风吹到薄层板上的温度不高于40。再于薄层板上滴加以下两个点。第三点：10 L 0.04g/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。第四点：20 L样液。再展开(同.3)，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。.5.稀释定量：样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量(0.000 4g)的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1含量即为5g/kg。如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下：第一点：10 L黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04g/mL)。第二点：根据情况滴加10L样液。第三点：根据情况滴加15L样液。第四点：根据情况滴加20L样液。.6.计算(4)式中：X2样品中黄曲霉毒素B1的含量，g/kg；V1加入苯-乙腈混合液的体积，mL；V2出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；D样液的总稀释倍数；m1加入苯-乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004黄曲霉毒素B1的最低检出量，g。结果的表述：报告测定值的整数位。.双向展开法如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素B1的荧光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素B1不动，然后再用丙酮-三氯甲烷(892)作纵向展开，样品在黄曲霉毒素B1相应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂质干扰时，则可改用滴加一点法。.1.滴加两点法点样：取薄层板三块，在距下端3 cm基线上滴加黄曲霉毒素B1标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘0.81cm处各滴加10L黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04g/mL)，在距左边缘2.83 cm处各滴加20L样液，然后在第二块板的样液点上加滴10L黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04g/mL)，在第三块板的样液点上加滴10L 0.2g/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干，或根据情况需要时可再重复展开12次。纵向展开：挥干的薄层板以丙酮-三氯甲烷(892)展开至1012cm为止。丙酮与三氯甲烷的比例根据不同条件自行调节。观察及评定结果：在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素B1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素B1含量在5 g/kg以下。若第一板在与第二板的相同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是否与黄曲霉毒素B1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，第一、二、三板可以同时做，也可按照顺序做。如按顺序做，当在第一板出现阴性时，第三板可以省略，如第一板为阳性，则第二板可以省略，直接作第三板。确证试验：另取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘0.81cm处各滴加10L黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04g/mL)及1小滴三氟乙酸；在距左边缘2.83cm处，于第四板滴加20L 样液及1小滴三氟乙酸；于第五板滴加20L样液、10L黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04 g/mL)及1小滴三氟乙酸，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素B1含量高时，则将样液稀释后，按.4做确证试验。稀释定量：如样液黄曲霉毒素B1含量高时，按.5稀释定量操作。如黄曲霉毒素B1含量低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果的判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。计算：同(.6)。.2.滴加一点法.2.1.点样：取薄层板三块，在距下端3 cm基线上滴加黄曲霉毒素B1标准使用液与样液。即在三块板距左边缘0.81cm处各滴加20 L样液，在第二板的点上加滴10 L黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04g/mL)，在第三板的点上加滴10L黄曲霉毒素B1标准溶液(0.2g/mL)。.2.2.展开：同.1.2的横向展开与纵向展开。.2.3.观察及评定结果：在紫外光灯下观察第一、二板，如第二板出现最低检出量的黄曲霉毒素B1标准点，而第一板与其相同位置上未出现荧光点，样品中黄曲霉毒素B1含量在5 g/kg以下。如第一板在与第二板黄曲霉毒素B1相同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上与第一板相同位置的荧光点是否与黄曲霉毒素B1标准点重叠，如果重叠再进行以下确证试验。.2.4.确证试验：另取两板，于距左边缘0.81 cm处，第四板滴加20 L样液、1滴三氟乙酸；第五板滴加20 L样液、10 L 0.04g/mL黄曲霉毒素B1标准使用液及1滴三氟乙酸。产生衍生物及展开方法同.4。再将以上二板在紫外光灯下观察，以确定样液点是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物，观察时可将第一板作为样液的衍生物空白板。经过以上确证试验定为阳性后，再进行稀释定量，如含黄曲霉毒素B1低，不需稀释或稀释倍数小，杂质荧光仍有严重干扰，可根据样液中黄曲霉毒素B1荧光的强弱，直接用双向展开法定量。计算：同(.6)。方法二3.9.6.原理概要样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较来测定含量。3.9.7.主要试剂抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，由卫生部食品卫生监督检验所进行质量控制；人工抗原：AFB1-牛血清白蛋白结合物；黄曲霉毒素B1标准溶液；黄曲霉毒素B1标准溶液的制备：用甲醇将黄曲霉毒素B1配制成1mg/mL溶液，再用甲醇-PBS溶液(2080)稀释至约10 g/mL，紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的光密度值，代入式(5)计算： (5) 式中：X该溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，g/mL；A测得的光密度值；m黄曲霉毒素B1的分子量312；E摩尔消光系数，21 800；f使用仪器的校正因素。根据计算将该溶液配制成10g/mL标准溶液，检测时，用甲醇-PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度；三氯甲烷；甲醇；石油醚；牛血清白蛋白(BSA)；邻苯二胺(OPD)；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG；碳酸钠；碳酸氢钠；磷酸二氢钾；磷酸氢二钠；氯化钠；氯化钾；过氧化氢(H2O2)；硫酸；ELISA缓冲液；包被缓冲液(pH9.6 碳酸盐缓冲液)的制备：Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g加蒸馏水至1000mL；磷酸盐缓冲液(pH7.4 PBS)的制备：KH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g加蒸馏水至1000mL；洗液(PBS-T)的制备：PBS加0.05(V/V)吐温-20；抗体稀释液的制备：BSA 1.0g加PBS-T至1 000mL；底物缓冲液的制备:A液(0.1mol/L柠檬酸水溶液)：柠檬酸(C6H8O7H2O)21.01g，加蒸馏水至1 000mL；B液(0.2mol/L 磷酸氢二钠水溶液)：Na2HPO412H2O 71.6g，加蒸馏水至1000mL；用前按A液B液蒸馏水为24.325.750的比例(体积比)配制；封闭液的制备：同抗体稀释液。3.9.8.仪器小型粉碎机；电动振荡器；酶标仪，内置490nm滤光片；恒温水浴锅；恒温培养箱；酶标微孔板；微量加样器及配套吸头。3.9.9.过程简述.取样，同。.提取.1