【毕业学位论文】（Word原稿）人胸腺素α1基因及乳铁蛋白基因在番茄中表达的研究-植物基因工程博士论文

密级：无 论文编号： 学位论文 人 胸腺素 1基因及 乳铁蛋白 基因 在 番茄 中表达 的研究 F 国农业科学院博士学位论文 摘要 i 摘 要 胸腺素 1(人体中枢免疫器官胸腺所分泌的一种免疫活性极强的多肽激素， 其主要功能是促进 T 细胞功能，促进特异性抗体和细胞素的产生，起着加强免疫系统功能的作用，可以治疗自身免疫疾 病如红斑 狼疮 、慢性乙肝、丙肝等，还可作为治疗癌症的辅助药物 。但是，人体胸腺 到 20 岁前后即开始萎缩， 量也随之下降，因此本研究将 因导入番茄，以期开发通过口服方式增加人体免疫力的新型保健产品。同时 ，我们还将大量存在于人初乳中， 具有广谱抗菌 、 调节机体免疫 机能、 抑制人体肿瘤细胞 生长等多种功能的人乳铁蛋白（ 码基因也导入了番茄。 本研究首先 根据植物偏爱密码子优化了人 后人工合成了 由于 因非常小，为了增加其在植物中的表达量，我们尝试将它首尾相连形成四联体 ，每个单体之间由肠激酶识别位点编码序列隔开，表达出的四联体小肽通过口服进入肠道后会被肠激酶分解成单体小肽而发挥作用。 因 、 基因及经过密码子优化的 因被克隆到双元 载体 ，构建了植物表达载体 时我们还根据已报道的番茄果实成熟过程中受乙烯调控的果实特异性表达的 因启动子序列设计了引物，克隆了番茄中蔬 5 号的 动子，并构建了由 动子驱动 因表达的载体 及分别由 动子 驱动 因 和 因基因表达的双价植物表达载体 建好的植物表达载体利用冻融法转入农杆菌菌株 ，并侵染了番茄子叶外植体，经过卡那霉素筛选，最终得到了再生植株 67 株。 再 生植株经 测，确定了转基因植株。除了使用 动子的植株由于果实尚未成熟不能检测以及 分子量太小不能进行电泳分析外，对其它转基因植株的果实进一步进行了 测，证明有多株植株分别表达了 和 茄果实的 量分析显示，转化了 果实中 量 为 g 果实鲜重 ，转化了和 果实中 量为 g 果实鲜重 。串联的 因不 但在番茄中表达了，而且平均表达量比含单体 因的番茄高出 g 果实鲜重 。 转基因番茄中表达的 和 别经过淋巴细胞增殖实验和抑菌实验，已经初步检测到了生物活性，为 开发 增加人体免疫力的 保健食品 苗打下了良好的墓础，具有 一定的 理论意义和实践意义。 关键词：番茄，胸腺素 1，乳铁蛋白，转基因 植物 ， 遗传转化 ，生物反应器 中国农业科学院博士学位论文 摘要 is an 8 of of in , to 1 in to a in So we 1 of At we LF s us It is s In we 1 a in to 1 in a 1 , by lf an to We in lf of 8 by CR 1 lf of by in of of of in of F .9 g 1 .0 g We 1 in is 1 F by of of to is an 国农业科学院博士学位论文 摘要 1; 国农业科学院博士学位论文 目录 录 第一章 绪论 物生物反应器研究进展 . 1 物生物反应器的优势 . 2 物 生物反应器 存在的问题与展望 . 3 腺素 究进展 . 3 述 . 3 腺素 1的结构 . 5 腺素 1 的受体 . 5 腺素 1的生物学活性 . 6 腺素 1的临床应用 . 6 腺素 1的生产 . 6 铁蛋白的研究进展 . 7 述 . 7 铁蛋白的功能 . 7 铁蛋白的结构及铁结合位点 . 8 铁蛋白的提取纯化方法 . 9 铁蛋白的检测方法 . 10 因工程方法生产乳铁蛋白 . 10 基因番茄研究进展 . 10 基因植物的生物安全性 . 12 于转基因植物的生物安全性的争论 . 12 基因生物环境释放风险评估的基 本原则 . 14 茄果实特异性启动子 . 14 8 基因启动子 . 15 4 启动子 . 15 G 启动子 . 15 动子 . 15 物遗传转化研究进展 . 16 物遗传转化方法 . 17 物遗传转化存在的问题与对策 . 21 研究的目的、意义及研究方案 . 24 研究的目的、意义 . 24 究方案 . 24 第二章 因番茄表达载体的构建 26 料与方法 26 料 26 法 27 中国农业科学院博士学位论文 目录 v 果与分析 33 1基因的设计合成及克隆 . 33 实特异性 动子的克隆 . 34 础质粒的酶切图谱及鉴定 . 35 粒载体的构建及其鉴定 . 38 结 46 第三章 利用农杆菌介导法 将人 因及 47 料与方法 47 料 47 法 49 果与分析 60 茄外植体的转化及再生植株的获得 60 生植株的 测 63 生植株的 交鉴定 66 基因植株的 测 68 源蛋白的 量检测 70 源蛋白活性检测 72 结 74 第四章 讨论和结论 75 论 . 75 外源目的基因在番茄中的表达量 . 75 价转基因番茄 . 75 动子的选用 . 75 码子的优化 . 76 1基因的串联 . 76 基因植物产品的生物安全性及应用前景 . 77 论 . 77 研究的创新点 . 78 参考文献 . 79 附录 . 91 致谢 . 92 作者简历 . 93 中国农业科学院博士 学位论文 缩略词表 略词表 腺素 1 铁蛋白 35s P 5S 椰菜病毒 35S 启动子 苄青霉素抗性 那霉素抗性 福平 硫酸链霉素 鱼碱合成酶基因终止子 I 霉素磷酸转移酶基因 光值 合酶链式反应 乙二醇 -(4,52,5甲基偶氮唑盐 牛血清 二烷基磺酸钠 联免疫吸附测定 苯二胺 落数 中国农业科学院博士学位论文 第 一 章 绪论 1 第一章 绪 论 近代的生物技术 ， 尤其是 70年代初重组 展非常迅速，已经在医药、农林、轻工、环境保护等方面起到重要的作用。不少人认为生物技术将是未来 10年高新技术发展的十大重点之一，更有人认为生物技术是解决 21世纪不断膨胀的人口 所带来的 粮食问题 及医疗保健问题 的关键技术。 自从 生物技术从实验室研究走向产业， 已经 经历了 几次发展高潮 ： 生物技术最初应用在 医药领域 ，并创造了大量的利润 ，被称为生物技术的第一次浪潮 ； 在 20世纪 90年代中期，生物技术在农业领域的应用迅猛发展，被称为生物 技术的第二次浪潮。随着时间的推移，生物技术在环境、能源、材料、信息等领域的运用和结合将不断扩大和加强，还会出现一个又一个新的浪潮。 到目前为止，世界生物技术产业的最大板块仍然是医药生物技术 产业 （ 占 70%以上） 。 我国人口众多，城市化进程迅速，正在逐步进入老龄化社会， 因此开发廉价、高效的疾病治疗及加强自身免疫能力的医药产品 显得愈来愈重要。 植物生物反应器技术就是满足了这种社会需要而迅速发展起来的新型生物技术。植物生物反应器可以大规模、低成本的生产外源蛋白，而且像马铃薯、番茄、香蕉、胡萝卜等植物的可食部位可以直接食 用，省去了外源蛋白的分离纯化过程，有广阔的应用前景。本研究将利用番茄作为生物反应器，表达对人体免疫发挥重要作用的胸腺素和乳铁蛋白，从而为开发新型保健食品奠定基础，以下综述将围绕相关研究领域展开。 物生物反应器研究进展 植物 生物反应器 （ 技术是上世纪 90年代初才出现的一种利用植物个体作为生物工厂来大规模生产可供人类疾病治疗和保健使用的药用蛋白的生物技术 。由于它高效、廉价的特点，现在已成为转基因植物研究的一个热点。目前利用植物生物反应器已经表达出多种外源蛋白，如霍乱毒素（ 苗 （ 1998） , 结核病疫苗（李忠明， 2001；杨国峰等， 2001），痢疾疫苗 (李轶女等， 2002)， 乙型肝炎疫苗 ( ,1992； ,1999； 995)， 苗（ ,1996； ,2000），口蹄疫病毒 (苗 ( ,1998； ,1999)，狂犬病毒 (苗（ 1995； 等， 1998）等细菌病和病毒病疫苗 ，现在人们还在研制避孕疫苗（ ， 1995），糖尿病疫苗（ 004）等。 20世纪 90年代后 ,为加大我国植物生物反应器研究力度 ,国家 863计划已经把“植物生物反应器”列为重点项目。 越来越多的 科学家和企业家 坚信 ，生物反应器将在 21世纪末 成为 低投入、高产出的巨大产业，是生物技术中充满活力和前景最为灿烂的高技术领域之一。 中国农业科学院博士学位论文 第 一 章 绪论 2 物生物反应器的优势 相对于微生物发酵系统、动物细胞培养及动物乳腺生物反应器而言，利用植物生产重组蛋白具有以下优点： 准确翻译、加工重组蛋白质 植物是高等生物 ，它能够对表达的蛋白质进行准确的翻译及糖基化、磷酸化等翻译后修饰，使蛋白质的三维空间结构更趋于自然状态，表达产物具有与动物抗原相似的免疫原性和生物活性。它不仅能够表达和组装低分子量 (小于 结构简单的单链肽或肽片段，如抗 2003），还能表达和组装大分子量 (大于 80结构复杂的多聚体蛋白质（ 2002）。有文献报道，采用转基因植物技术可以实现完整结构的重组抗体分子的表达和组装（ 1999），如 功能的分泌型免疫球蛋白，这充分说明了植物细胞对外源蛋白的加工能力。相比之下，细菌等微生物对外源蛋白的表达和组装能力较低。即使用表达能力较强的大肠杆菌，欲表达双链结构的重组抗体分子，也十分困难，目前尚未有重组多聚体蛋白质用细菌表达系统成功表达的报道。 高效、廉价地生产转基因产品 生产口服疫苗的植物表达系统与传统作物种植并无差异，稳定的转基因农作物品系大规模种植就可以生产大量的口服疫苗，它不需要技术、设备和种植条件上的巨大投资 ； 农作物可以当地生产，还易于贮存和运输，而且植物栽培、收获、贮藏、加工程序已经形 成产业化。相比之下，原核生物反应器与动物生物反应器生产时需要昂贵的设备、大量的人力物力，表 1一方面转基因动物发展成一个种群，与得到遗传稳定的转基因植物相比，需要花费更多的时间。 表 1同表达系统生产生物药品的费用比较 of to a s ) ) in of ) in ) WP of 625/250000 500615/25自： 食用安全 近年来，口蹄疫、疯牛病、霍乱、禽流感等畜禽传染病在一些国家的再度流行，使人们认识中国农业科学院博士学位论文 第 一 章 绪论 3 到利用植物生产口服疫苗也许是一种更为安全可靠的方法。植物不是肝炎、艾滋病病毒等许多人类和动物致病性病原体的天然宿主，这就避免了通过疫苗传播病原。同时，转基因植物生产的口服疫苗还可以避免落后地区注射疫苗时因注射器消毒不彻底而产生的交叉感染，为疾病的治疗和预防提供了一个更为安全方便的模式，可以在医疗设 施不完备以及医护人员缺乏的发展中国家安全应用。 物生物反应器存在的问题与展望 利用植物生物反应器，人们已经成功的表达了多种外源蛋白，并且得到了一些蛋白免疫活性的实验数据，这些研究成果令人欢欣鼓舞。但是，用植物生产口服疫苗目前还处于研究阶段，对于应用还有一些需要继续研究的课题。表达量低。在现有的研究中，外源基因所表达的重组蛋白大约只占植物中可溶性蛋白的 (1995)，即使以高表达量者为标准，此表达量作为疫苗仍然很低。这是植物表达系统普遍存在的问题，解决这一问题对于 植物口服疫苗的应用及产业化具有重要意义。免疫耐受性 （ 。是 指免疫活性细胞接触抗原性物质时所表现的一种异性的无应答状态（ a of ，口服疫苗也有可能导致人和动物产生口服耐性，从而不再对疫苗抗原产生免疫反应，疫苗失去了作用。因此必须系统研究口服疫苗的有效剂量和服用时间表，从而最大限度发挥口服疫苗的作用。口服疫苗还面临着在消化道被降解，不能发挥作用的问题。 虽然植物表达系统还存在一些有待改进之处，但是它安 全、廉价的优点还是会吸引越来越多的研究者与开发商的目光，在未来的疫苗市场上有着广阔的应用前景。 腺素 究进展 述 胸腺 (机体的中枢免疫器官，是 与 节机体的细胞免疫和体液免疫功能。 1966年 之为胸腺素，又称胸腺素组分 3（ 在 972年分离出了分子量为 于 1975年又进一步提 纯得到了供临床试用的胸腺素组分 5 ( 一种有效的免疫增强剂，它的纯化流程如下：胸腺组织 10000 800C( 一丙酮沉淀 ( 25酸胺沉淀 ( 7)三组，每组中的成分按分离的 先后顺序命名为 1 、 2， 1、 2等。从 和 4活性最强，其中 10 1000倍。表 1 表 1种胸腺素成分的性质及功能 or of (of in in in a of 12 8 to a1 in 8 .2,IF,dT 5 8 to to a1 in 4 3 W 4396, dT in in in in dT in of H 中国农业科学院博士学位论文 第 一 章 绪论 5 对于 来源问题，目前还存在着一些分歧。大部分人认为它并非是一个天然肽，而是前体物胸腺素 端的蛋白裂解产物 (. ， 1987)，由 等， 1993)，人的 10个氨基酸残基，其 8 个氨基酸残基是 35个则为 的细胞中都有高水平的表达，其表达水平随细胞增殖状态的改变而变化，对细胞增殖起着重要作用 (997)。 腺素 1 的结构 70年代末期由 过胰蛋白酶解、糜蛋白酶解、 一级结构已被确定 (1983)(图 1 一种由 28 个氨基酸残基组成的酸性多肽，富含酸性氨基酸，在 80热稳定 (2003)。 论分子量为 二硫键与糖基化修饰 ,惟一的修饰就是 1999）。人和牛的 有相同的一级结构 (1982)。 1腺素 的一级结构 of 对于 级结构的报道甚少。