【毕业学位论文】（Word原稿）猪表皮干细胞体外分离、培养和建系研究-动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级： 论文编 号 ： 学位论文 猪表皮干细胞体外分离、培养和建系研究 of of I 摘 要 皮肤的表皮终生处于增殖、分化和脱落的不断更新之中，这正是由于其中表皮干细胞(断增殖分化所致。表皮干细胞是一种在体内具有无限更新能 力，且能分化形成全层表皮的细胞，在体外培养具有长期生长潜能。开展分离纯化表皮干细胞建系研究，为表皮干细胞应用于医学临床的组织工程和人类重大疾病的细胞治疗打下技术基础。本研究以五指山实验用小型猪（ 交系的耳组织为材料，分别从不同日龄猪、不同胶原、条件培养基和表皮生长因子等方面对 离培养的影响进行了研究，旨在探索 在该条件下建立三个表皮干细胞系，对所培养的 行了染色及免疫组化鉴定。得出研究结果如下： 1 不同因素对猪表皮干细胞分 离培养的影响研究 采集 4 日龄、 1 月龄、 3 月龄、 12 月龄猪耳组织分离表皮干细胞，分别计算各组细胞的贴率。 结果表明，随着实验猪日龄的增长，表皮干细胞的贴壁率逐渐降低，其中 4 日龄组贴壁率为 1 月龄组为 根据 占表皮细胞约 10%的比例，这两组最适宜作为分离纯化表皮干细胞的材料。 将分离得到的表皮细胞分为两组，一组接种于型胶原包被的六孔板中，另一组接种与型胶原包被的六孔板中， 15洗去未贴壁细胞，计算两组细胞的贴壁率。结果表明，型胶原组贴壁率为 型胶原组贴壁率为 由此可见，型胶原不适宜作为筛选表皮干细胞的基质。 将分离纯化出的表皮干细胞分为两组，一组采用条件培养基培养，另一组采用 12（ 1：1） +15%血清培养。结果表明，条件培养基培养组细胞生长状况良好，呈克隆状生长，且传几代之后也不易发生分化，而有血清培养基培养组细胞生长速度非常缓慢，且从第二天开始就出现了分化现象，以后分化细胞逐渐增多，不能够形成克隆状。因此，在没有饲养层的条件下，表皮干细胞的培养必须添加条件培养基。 分离纯 化出的表皮干细胞分为四组，分别用含 0ng/10ng/20ng/ 30ng/皮生长因子 (培养液培养，绘制每组细胞的生长曲线。结果表明， 10ng/0ng/ 30ng/度的 长曲线没有明显的差别 (P 而不含 培养液细胞增殖速度显著低于其他各组（ P 2 猪表皮干细胞的建系研究 采集 过中性蛋白酶消化获得表皮，再通过 酶 +化制成单个表皮细胞悬液，接种在型胶原包被的培养瓶内，采用条件培养基（ 12（ 1：1） +10%条件培养液 +5 g/mL 0ng/0ng/+g/化可的松）培养， 酶消化传代。 表皮干细胞能够快速黏附在型胶原上，呈克隆状生长，一般传代间隔为 7 天左右。已建立三个表皮干细胞系，均已传至 20 代以上。 3 猪表皮干细胞的鉴定及分化研究 取生长良好的第 10 代表皮干细胞进行 色鉴定，结果呈阳性。 1 整合素免疫组 化染色亦均呈阳 性。证明所分离得到的细胞为表皮干细胞。将消化传代 种在铺明胶的培养瓶中培养 3 周左右，可逐渐分化成表皮膜片。 关键词 表皮干细胞，细胞培养，鉴定 is by of in to in of is by a of a of do on is to of to of to of 1 as 1. of on e 2to on we of of ) )s s t in 10(1:1)+15%in in t be In to GF we as GF ng/0ng/0ng/ml 0ng/is no 0ng/ml 0ng/ml 0ng/ml P ,ng/ml is . 2. he in to 7 in a % 0in 10（ 1：1） ,10% g/mL 0ng/0ng/g/ to 4 of to 0 3. of o 0th 2) 19 of to of 录 第一章 文献综述 . 1 综述一 成体干细胞研究进展 . 1 干细胞概述 . 1 成体干细胞的分类 . 1 成体干细胞的生物学特性 . 2 成体干细胞的可塑性 . 2 成体干细胞的应用 . 4 综述二 表皮干细胞研究进展 . 6 引言 . 6 表皮干细胞的定位和在体分布模式 . 6 表皮干细胞的生物学特性 . 7 表皮干细胞的鉴定及其表面标志 . 9 表皮干细胞与微环境 . 12 第二章 实验研究 . 16 实验一 不同因素对猪表皮干细胞分离培养的影响研究 . 16 前言 . 16 材料与方法 . 16 结果 . 18 讨论 . 21 实验二 猪表皮干细胞体外分离、培养和建系研究 . 23 前言 . 23 材料 . 23 方法 . 23 结果 . 24 讨论 . 26 实验三 猪表皮干细胞的鉴定及分化研究 . 28 前言 . 28 材料和方法 . 28 结果 . 29 讨论 . 30 第三章 全文结论 . 32 附图 . 33 参考文献 . 36 致 谢 . 42 作 者 简 历 . 43 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 性磷酸酶 件培养基 蛋白 s 氏培养液 甲基亚砜 皮生长因子 二胺四乙酸 皮干细胞 纤维细胞 岛素样生长因子 9 角蛋白 19 生牛血清 s 杜氏磷酸缓冲液 暂扩充细胞 指山猪 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 综述一 成体干细胞研究进展 干细胞概述 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群体 （ E et 961） ,这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小 ,同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞 ,从而构成机体各种复杂的组织器官。 根据个体发育过程中出现先后次序不同，干细胞分为胚胎干细胞 (成体干细胞 (胚胎干 细胞是一种高度未分化细胞，它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官。成体干细胞是存在于成年动物的许多组织和器官（如表皮和造血系统）的具有修复和再生能力的细胞。在特定条件下，成体干细胞或产生新的干细胞，或按照一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 介定一个细胞是否是干细胞，有 4条标准 (J et 001), 第一，干细胞可进行多次的、连续的、自我更新式的细胞分裂，这是维持群体稳定的一个首要条件；第二，起源于单一千细胞的子细胞可分化出 1种以上的细胞类型；第三，当干细胞被移植入损伤的受者体内时，它能重建原来组织的功能；最后一条较不易确立的标准是：即使无组织损伤，干细胞也能在体内分化扩增。 成体干细胞的分类 成体干细胞存在于胎儿和成人各种组织和器官中 ,目前发现的成体干细胞主要有造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、皮肤干细胞和肠上皮干细胞等 (Q et 003)。 造血干细胞（ 胚胎早期就已经出现，源于主动脉旁 性腺 步迁移到卵黄囊、肝脏、脾脏及骨髓。 用最为成熟的成体干细胞，它移植治疗血液系统及其他系统恶性肿瘤、自身免疫病和遗传性疾病等均取得令人瞩目的进展，极大地促进了这些疾病的治疗，同时也为其他类型成体干细胞的研究和应用奠定了坚实的基础。间充质干细胞（ 要来源于骨髓，是具有多向分化潜能的成体干细胞。骨髓 达 表面抗原。 生长因子，对体外 et 003)。在合适的条件下， 成骨细胞和其他结缔组织细胞。 细胞和肌肉细胞。神经干细胞（ 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 是一类重要的成体干细胞，分布于成人及胚胎的中枢及周围神经系统。在生长因子、神经递质、激素及损伤、环境因素改变的刺激下，可分化为不同类型的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞也是具有多向分化潜能的成体干细胞。有报道认为神经外胚层来源的神经干 细胞能分化为中胚层来源的细胞如肌细胞等。也有研究发现，神经干细胞可分化为造血细胞。 体干细胞的生物学特性 各种 裂缓慢，在形态学上表现为细胞体积小，胞内细胞器稀少，细胞内 连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。 称分裂形成两个相同的干细胞，非对称分裂生成一个分化细胞，而另一个仍作为干细胞保留下来。干细胞在整个增殖过程中处于相对静 止状态，通常等数分裂为干细胞和定向祖细胞，当受到损伤等情况时，干细胞的分裂方式会发生改变以适应机体的需要。 于一个由干细胞、基底膜和调控细胞组成的微环境之中 ( et 001)。 使在含量最丰富的骨髓中。 多 细胞形态和生长特征来分离 用单克隆免疫吸附能识别细胞类型或细胞谱系表面抗原的特点，经免疫磁珠筛选、流式细胞分离等方法可将 增困难是其临床应用的一大难点，但针对不同来源 利用复合细胞因子大量扩增成人造血干细胞、神经干细胞、间质干细胞等。 体干细胞的可塑性 1998年意大利科学家 骨髓来源的干细胞能向受损的肌肉部位迁移 ,并参与损伤修复和骨骼肌的更新 ( et 998)。这个研究结果激发了关于 此，有关 为包括 内的世界权威杂志的报道热点 。 传统观点认为， 之为 皮肤基底层的表皮干细胞，只能分化产生构成皮肤及其附属器所需几种细胞类型。但近年研究发现， 胞在特定条件下可产生不同组织的细胞，如神经干细胞可转化为血细胞，造血干细胞可转化为神经细胞。在不同研究文献中将成体干细胞这种跨系谱 (或跨胚层 )分化的潜能，称之为 R et 000)，横向分化 ( et 000)或“转决定”(L et 000)。关于成体干细胞为什么有可塑性，目前，主要有以下几种解释：首先，可塑性是干细胞包括成熟细胞的基本属性，只是人们以前没有认识到这一深度而已 (A et 995)。史春梦 (2000)等指出，要重新认识成熟体细胞的发育潜能。他们认为 诞生及 明成熟细胞在一定条件下可回到干细胞状态，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 恢复其发育全能性。斯坦福大学的 某一特定的细胞类型。她认为，即使是高度分化的细胞 (如神经细胞 )，在特定条件下，也能逆转其分化状态而成为干细胞。细胞的分化状态不是一成不变的，而是取决于调节因子介导的分化和去分化两大力量的动态平衡。付小兵 (2001)等研究发现，人表皮细胞在重组人表皮生长因子作用下，逆分化为表皮干细胞。国外也有研究表明，角膜来源的短暂放大细胞 (胞 )逆分化为角膜缘干细胞 ( et 000)。细胞的这种逆分化现象，主要在体内当机体组织受到损伤时 间才出现。其次，有学者认为， 环境刺激使之获得新表型。 可表现出可塑性。由于细胞能保持对原有环境的记忆，因此这种转化需要时间和特定的条件。 评价成体干细胞可塑性的标准 成体干细胞可塑性的发现，对传统发育生物学观点提出了新的挑战。有许多学者认为，很有必要对现有研究进行客观的评价，他们提出了相应的评价标准，以指导今后的深入研究。最有代表性的就是 (2001)在 阐述三个标准 (J et 001)：用于研究的干细胞，必须是采用有效方法分离纯化的单一干细胞。最好是由一个干细胞单克隆产生的细胞群，且不宜在体外长期培养。要研究单个干细胞发生转化的潜能。干细胞是否发生转化，要对转化生成的细胞功能进行评价。如造血细胞被认为可转化为神经细胞。那么，转化的神经细胞是否具备正常神经细胞的生理功能。如对适宜刺激产生反应的能力，能否与其它神经元形成功能性突触等。 对成体干细胞可塑性的质疑性研究 从 2002年 4月始，在 连续刊发了一系列针对成体组织干细胞“可塑性”或“横向分化”这一重大理论问题的最新质疑性研究。其原因部分是：大部分的研究仍有待单独去证实；明显的种系转换现象以低频率出现；大部分的研究尚不能证实可塑性是单一种系干细胞分化为一种以上的有功能特征的种系细胞的结果；也许首先是因为这样的种系转换违背了已建立的生物进化和干细胞的原则 (M et 002)。 2002)以 构成性表达 植其骨髓 未在其中枢神经系统所有部位检测到 便是在施加脑皮质刺伤后亦是如此。因此， 髓变脑”的“横向分化”可能不是一个共性，而是取决于或者有赖于研究者为了验证某种假设所采用的实验系统。 2002)研究表明， 自发地发生神经或造血干细胞与 导神经干细胞或造血干细胞进行“横向分化”为胚胎样干细胞。然后展现出 此使所谓的成年组织干细胞具有了可塑性“潜能”。 2001年 11月， 们将这种细胞命名为多潜能成体先祖细胞 (并先后在小鼠、大鼠及人类骨髓中获得了这种细胞。单一水平的 、外各胚层各种组织定向干细胞。在各种成年组织细胞的体外培养中，必然混杂有 究证实，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 H et 002)。 以上研究表明， 是成年组织中余存的 可能与自发融合有关。塑性”有待更为严谨、科学的实验标准。 成体干细胞的应用 脏病的治疗研究 心脏病目前的治疗包括药物治疗和血管成型术等只能挽救存活的心肌细胞，而对坏死的心肌无能为力。成体干细胞治疗将可能实现心肌的再生，达到改善心肌功能的目的。 心肌的修复包括心肌的再生和血管的再形成。骨髓或外周血干细胞主要包括 3种成分：间充质千细胞 (造血干细胞 (内皮祖细胞 (其中 很好的血管再生底物。因此，理论上讲，骨髓或外周血来源的干细胞治疗心脏病是极为有用的治疗手段。目前已有小规模的临床试验研究评估骨髓干细胞移植治疗缺血性心脏病和心肌梗死的治疗效果。 2002)报道了 10例行冠脉内注射自体骨髓来源干细胞治疗的心梗患者，治疗后与对照组（使用标准药物治疗）相比梗死的范围显著缩小，左室收缩末期体积、收缩能力和梗死部位的心肌灌注均有明显改善。 2003) 报道了 果显示，与对照组相比有整体左室 功能、射血分数的改善和收缩末期体积的缩小。其他临床试验也观察到相似的结果。这些临床试验表明，自体骨髓细胞移植治疗急性心梗或慢性缺血性心脏病是安全而有效的方法。 和脊髓损伤的治疗研究 神经系统疾病中外伤或缺血性疾病引起的脑脊髓损伤最常见，且致残率高，生活质量低下。传统治疗仅限于支持治疗，远不能满足医生和患者的需求。于是人们开始探索其他的治疗方案，其中干细胞治疗前景最为看好。 河南省人民医院采用患者自体 27例脊髓损伤和 25例缺血性脑损伤患者 (步星耀等， 2004)，移植方法为 床试验结果发现 后回访症状均有改善。运动和感觉功能均有不同程度恢复，以伤后 1个月内接受干细胞移植者效果最明显，伤后时间越长疗效越不显著，但均无不良反应。这一全新的课题无疑给脑脊髓损伤的治疗带来了光明的前景，并为其他神经系统疾病如帕金森病等退行性疾病开辟了新的疗法。 表面疾病的治疗研究 眼表面疾病 ( 学或热学损伤、类天疱疮等均能导致角膜浑浊和视觉的严重 损害。其病理过程主要是疾病损伤了具有修复能力的角膜缘干细胞群，导致干细胞缺失（ 角膜表面的“结膜化”。 膜化”诱发血管长入和炎症，从而使传统的异体角膜移植遭遇失败。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 2000）报道了 1细胞取自患者对侧健康角膜缘组织，在体外生物工程羊膜 (培养至多层上皮组织后，移植于预先接受外科处理的患者。治疗过程中未发现外科并发症，有 6例患者移植成功。 2004）改进了体外培养方法，使移植物在 成与体内正常角膜上皮极其相似的 4 5层上皮组织。移植后，接受治疗眼表面清洁平滑，患者最佳矫正后视力由移植前的 8 200增加到 20 20，供体眼无明显的并发症。 这些临床试验显示培养于 自体角膜缘干细胞移植是一种简单有效的重建角膜表面和提高有效视力的治疗方法，只产生较小的供体眼损伤，适用于难治性 肤和骨损伤的治疗研究 慢性皮肤和骨损伤由于病变局部环境的细胞因子或其他因素缺陷，常导致损伤不愈合或延迟愈合。骨髓细胞移植可能提供损伤修复必须的因素而成为新的治疗方案，因为骨髓细胞在创伤 愈合过程中有重要作用，如提供免疫细胞维持免疫系统、参与血管结构的修复 (骨髓细胞中的 分泌多种细胞因子、提供炎症前体细胞以介导炎症反应 (已知炎症细胞参与创伤修复 )等（ V,2004）。临床上已有小规模试验应用骨髓细胞移植治疗缺血性疾病或创伤引起的慢性皮肤损伤。另外有研究表明 ( et 001)，来源于骨髓的成骨祖细胞在体外生物陶瓷支架上生长扩增后移植与骨缺损部位能显著提高大段骨损伤的治疗效果，这一研究成果极大促进了组织工程的新型生物材料和培养方法的出现，应用自体 干细胞联合组织工程治疗骨损伤将成为一种趋势。中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 综述二 表皮干细胞研究进展 引言 皮肤是动物和人体机体最大的器官，约占体重的 16%。是机体抵御外界微生物侵入，各种理化因素的伤害，及防止水分丢失的第一道屏障。 大面积深度烧伤等各种原因所致的皮肤损伤均需要足够的皮肤进行修复。对表皮干细胞的研究已有二十多年，且取得了很大的进展，但仍有许多问题有待更进一步的研究。本文将对其作一简要的阐述。 表皮干细胞的定位和在体分布模式 皮干细胞的定位 皮肤由表皮和真皮构成，哺乳类的表皮组织 ，包括毛囊间表皮组织及其附属结构如汗毛、皮脂腺所形成皮肤的外覆层 (F,1991)。表皮的主要细胞类型是表皮角蛋白形成细胞，角蛋白形成细胞由内向外依次为基底细胞、棘细胞、颗粒细胞、透明细胞和角质细胞。其中，基底细胞位于表皮最内的基底膜上，早在 20世纪 70年代初期， 1970)就认为皮肤的增殖最可能发生于基底层。基底层是位于基底膜上的单细胞层，表皮和真皮借基底膜以表皮突和真皮乳头等结构形成起伏交错的界面，传统观点认为基底层的细胞具有自我更新能力，能不断补充表皮细胞脱落的需要，因此 基底层又称为生发层。基底层内有三种细胞，即表皮干细胞、短暂扩充细胞和终末分化细胞。在生理状态下，表皮干细胞通过不对称分裂产生一个干细胞和一个短暂扩充细胞( 经过几次到几十次不等的分裂，进一步定向分化为有丝分裂后细胞 (终末分化细胞 (研究表明，人和鼠皮肤中约 10%的基底层细胞为慢周期细胞，这些细胞在体外培养条件下仅有约 40%可形成克隆，就 是说基底层细胞中只有 4%为表皮干细胞 (M et 000; et 999)。 细胞动力学研究表明，基底层内的干细胞的分布并不是随意的，在人的身体不同部位分布是不均一的。 研究发现在手掌的表皮内，干细胞分布于深的表皮突的顶部。 995)等人认为在人的包皮、乳房、腹部、头皮等部位的干细胞则是位于真皮乳头的尖端。而990)等发现毛囊的干细胞位于外毛根鞘的膨大部，还有学者 (,1975)认为在毛囊基部 也存在干细胞。 皮干细胞分布模式 关于干细胞在表皮中的分布，不同研究者根据各自的研究结果，提出不同学说。主要有三种： 第一种，表皮增殖单位（ 说 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 974)等提出了表皮增殖单位学说，该学说认为动物和人体的某些皮区存在垂直表皮柱，尤其特别规律和明显的发生在很溥的表皮处，如人的阴囊，小鼠的耳部。这些细胞柱的结构非常稳定，正常情况下在一个表皮细胞柱里的细胞数目几乎是恒定的。每个细胞柱的底部位于基板上，其顶部到达表皮。构 成细胞柱的基底层有 8有分裂能力的细胞，其中央有一个原始干细胞 (由这个干细胞增殖分化形成该细胞柱的全部细胞。动力学研究和细胞形态学资料为 说提供了证据。 (1986)将荧光染料注入表皮细胞，结果观察到与 为支持表皮干细胞在体内以 式增殖分化提供了更为有力的证据，他们将携带 以将 在体外将携带 苷酶基因的复制缺陷的反转录病毒转染表皮角质形成细胞 ,然后将阳性细胞注入鼠皮下 ,12 周后取表皮样对 性细胞在体内分化形成 构。每个 由一个干细胞分化形成，干细胞位于 中央，他们的研究结果提示表皮干细胞形成 表皮干细胞的内在特征，而不受所属结缔组织的影响。杨学义 (2004)将从关中奶山羊耳皮肤分离纯化的表皮干细胞接种成纤维细胞胶原