【毕业学位论文】（Word原稿）矮败中国春小麦花药基因数字化表达谱研究-小麦功能基因组学硕士论文

i 摘 要 太谷核不育小麦，世界上第一个由 显性 ，单 基因 制的雄性不育小麦， 败育 不受 任何外界 环境因素影响，在小麦杂交育种中 有很重要的利用 价值。为了研究 该基因 下游基因的表达和调控 情况 ， 我们利用 实验室改进的 术，构建了矮败中国春 小麦花药 的 库，拟在全基因组范围上检测 败育 花药转录本的变化情况 。 矮败中国春小麦花药 文库经过 34,256 序列。 拼接之后得到 14,831 条中 列为公共数据库中没有的序列， 列为未知蛋白和 假定蛋白。将 子功能，细胞组分等三个方面进行 类。 与 据库做注释得到 12 个 白， 17 个 因， 338 个蛋白激酶， 338 个转录因子， 4 个转录调节因子， 还包括许多与花器官发育相关的基因， 控制开花时间相关的基因，花器官形成相关的基因，花药和花粉 特异基因 。 为了研究小麦败育花药 基因 的变化情况， 我们 从网上 下载了 中国春小麦 可育花药的 中国春可育花药库共包括 34,615 条序列，拼接后得到 11,912 条的 列。 结果 在败育过程 中 发现 有 758 个呈显著下调表达的基因， 62 个基因呈现显著性上调表达。 为了研究可能的代谢途径或信号传导途径的变化情况，我们 将可育花药的文库与败育花药的文库做 选取其中表达丰度 比值 大于 2 的基因研究， 这样的基因 共有 214 个。综合这部分数据分析，我们发现在败育花药的发育过程中，表达基因的种类减少，同时基因的表达量也相应降低。 作为一种数字化的手段， 达丰度聚类分析在研究基因表达模式上是一种有效地手段。通过对文库之间表达模式的相关 性分析，利用 K 聚类等将文库中未知功能的基因与注释已知功能的基 因通过表达模式的相似性联系起来进一步大致推测其可能功能。通过对 聚类 结果的分析， 可以看出矮败花药的转录本的表达模式确实与正常发育的花药不同。 关键词 达丰度，败育花药，表达谱 中国农业科学院 硕 士学位论文 I is in a is by in In to we on of on of 34,256 in a 4,831 of no to in to A of nr in In to of we a 34,615 in 1,912 in 58 2 up In to or in of we to O in 14 we in as a to on of of ST we to in in us a to a of as as by us on it is 国农业科学院 硕 士学位论文 目录 录 第一章 引言 . 1 献综述 . 1 物花器官及花药的发育 . 1 物雄性不育现象及相关育性基因的研究 . 2 规模测序数据与基因转录本的研究 . 4 麦 据研究意义 . 5 麦太谷核不育基因 相关研究 . 6 究的目的和意义及技术路线 . 7 究的目的和 意义 . 7 术路线 . 8 第二章 矮败中国春小麦 库测序数据分析 . 9 料与方法 . 9 验材料 . 9 序数据处理流程 . 9 果分析与讨论 . 9 败中国春小麦花药文库测序数据的初步分析 . 9 败中国春小麦 列基因功能预测及 类 . 10 败中国春小麦 库中与花发育相关的基因分析 . 11 第三章 矮败中国春小麦花药 列数字化表达谱分析 . 15 料与方法 . 15 国春小麦花药 库 . 15 麦花药文库数据处理流程 . 15 果与分析 . 16 于表达序列条数差异的矮败中国春小麦花药与可育中国春小麦花药简单表达谱构建. 16 于 类的表达序列条数差异表达谱构建及相关代 谢途径分析 . 18 于统计学的矮败中国春小麦花药与中国春小麦花药显著性差异表达基因及相应表达谱 . 19 论 . 19 第四章 矮败中国春花药转录本与可育中国春小麦花药 不同发育时期的基因表达模式相关分析 . 21 料与方法 . 21 中国农业科学院 硕 士学位论文 目录 不同发育时期中国春小麦花药 库 . 21 个文库数据预处理 . 22 因和文库之间的聚类分析 . 22 果与分析 . 22 麦花药数字化表达谱分析的 据基础 . 22 麦花药相关表达模式分析 . 22 于不同文库的聚类分析 . 23 论 . 25 字化表达谱分析的优势 . 25 字化表达谱分析的局限性 . 25 第五 章 全文结论 . 27 参考文献 . 28 致 谢 . 37 附 录 . 39 作者简历 . 61 中国农业科学院 硕 士学位论文 英文缩略表 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 本局域联配搜寻工具 段 重叠克隆群 欧洲生物信息学研究所 达序列标签 美国）国家生物技术信息中心 冗余数据库 段 拼接软件 编码区域 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 献综述 物 花 器官 及花药的 发育 花发育是植物发育过程中较为关键的一环。植物的生命周期由孢子体时代和配子体时代交替组成，而高等植物的配子体体积较小，都浓缩于花中；同时花的发育还是植物茎发育的一个重要转变，标志着植物由营养生长过程开始转向生殖生长 过程，对于一年生的植物而言，花的发育不仅意味着生殖的开始，同时也意味着衰老的开始，那么，在有限的周期中，植物是如何调节计算生命的每一步，在最合适的时候开花，结果，繁种呢 ？ 这些引起了人们对植物开花机制的探索。 植物受到开花 信号 的诱导，茎端分生组织就开始产生花芽，花原基在茎端分生组织之上形成，而器官原基则在花原基之上形成。在花转变的过程中存在着几条相互作用的途径：光周期途径和春化促进途径介导来自环境的信号，自动途径监控内源 发育的状态的变化，而赤霉素合成和赤霉素信号转导形成一条独特的促进途径（ et 1998; et 1999）。这些途径可能通过抑制一种花阻抑蛋白的活性来激活花形态建成基因或是直接与花形态建成基因结合的方式来调节花的转变，在这些途径的作用之下，被子植物完成了从茎到花的转变。在形成花的过程中有许多基因参与 。 以模式植物拟南芥为例，有 et 1991) ， et 1992) ， et 1995) ， et 1989) ， et 1995) ， Gu et 1998) 等 基因 被克隆 ， 以促使茎的分生组织细胞转变为花， et 1999）。在拟南芥的突变体中还克隆得到了许多与开花时间相关的基因，这些基因也是依靠与 作用而发挥其功能的 。 关 于 控 制 开 花 时 间 的 基 因 的 更 新 信 息 可 以 查询（ ） 。 拟南芥含有四轮花器官，由外向内分别是萼片，花瓣，雄蕊，心皮组成。在花器官形成的过程中， 定 决定 形成 (et 2000)。类基因共同决定花瓣的形成， B、 类基因共同决定雄蕊的形成， 类 基因决定心皮的形成（ 2001）。在这些基因中，除了 et 1997）， 物，酵母，真菌 中 均 受 到 因 的 调 节 （ et 1998 ）， 详 细 的 信 息 可 以 进 入。在花器官形成中，除了以上提到的几种类型的花器官决定基因外还有许多其他的基因，它们或是促进，或是抑制以上基因的表达和功能，应该说没有这些基因的联合作用，花器官是不可能正常的表达的。在拟南芥花发育的早期有 12个比较明显的中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 发育阶段，在第五个阶段（ et 1990）时，雄蕊原基形成，然后进一步发育成花丝和花药。药室中的花粉母细胞经过减数分裂形成小孢子的四分体结构，四分体是由一层厚厚的绒毡层包裹的，然后小孢子在绒毡层分泌的胼胝质酶 的作用下释放出来，经过不对称的有丝分裂后产生一个小的生殖细胞和一个大的营养细胞，而生殖细胞再经过一次对称的有丝分裂产生两个精细胞。当精细胞释放到胚囊后，与其中的卵细胞核中央细胞进行双受精作用，至此花粉的发育就全部结束了。分子遗传学和细胞生物学实验结果表明，在几乎所有的被子植物中，花药和花粉的发育过程非常保守，尽管有一些细节上的差别，但这就意味着我们在研究一种模式植物的发育中所采用的方法同样也可以普遍应用于其它植物（ et 2004）。 花粉的发育由两个时期构成（ et 1990; et 1993) 。 在前一个时期，花粉中出现具有不同功能类型的特化细胞，具有生殖功能的细胞参与孢子的发生和花粉的形成，而非生殖功能的细胞则形成表皮，内皮，绒毡层，环形细胞团， 裂口和维管束细胞等 （ et 1989） ；在后一个时期里花粉粒分化，花丝变长，使得花药向上举，然后花药开裂将其中的花粉粒释放出来。整个花药的发育是位于不同组织和细胞的许多基因共同调节作用的结果（ et 1990; et 1993），近几年， 很多 花粉特异性基因 被克隆 （ et 1990; et 1990; et 1990; et 1993; et 1994; et 1996; et 1999; et 2003; 吴孝槐 ， 2003; et 2004; et 2005; et 2005） 。人们将雄性不育的机制应用于 作物的杂交育种当中， 以免除人工去雄的麻烦， 节省 了 大量的人 力和财力。 物雄性不育现象 及相关育性基因 的研究 雄性不育现象在自然界中是一种非常普遍的现象，一般雄性不育主要包括环境和遗传因素两个方面。早期人们主要关注环境因素引起的雄性不育，即形态不育和生理不育等；近几年，人们把研究的方向投向对于遗传因素引起的雄性不育。遗传因素的雄性不育现象按照作用机制的不同可分为细胞核雄性不育（ 细胞质的雄性不育（ 其中细胞质的雄性不育研究主要集中 在线粒体，叶绿体基因组的研究上。对于细胞核雄性不育而言，由于克隆得到的核雄性不育基因较少，研究仍不够深入，目前克隆得到的仅有的细胞核雄性不育基因主要来自于拟南芥和玉米。 拟南芥中 et 1993)基因是第一个 用 转座子标签法克隆得到的雄性不育基因，该基因在小孢子四分体释放时表达，与小麦中的 脂酰还原酶基因有很高的相似性，可能参与花粉中孢粉素形成过程中脂肪酰到脂肪醇的还原过程。 拟南芥的 et 2001）基因是用图位克隆法得到 的，与 表达方式非常相似，只是在小孢子释放时期的绒毡层组织表达，而且表达量非常低，结构上与 白有同源性，故在功能上应该有相似之处，推测 白可能是通过改变染色质的结构来转录调节花粉壁的发育和成熟晚期花药中其他基因的活性。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 拟南芥的 et 1998）基因是用 签法克隆得到的，编码一个 435 个氨基酸的多肽， C 端富含酸性氨基酸，可能与 接或间接的结合有关，同时与小鼠的联会复合体蛋白具有一定的相似性，但是这些相似性都是有限的，蛋白质的具体功能仍在进一步的 研究当中。 玉米中唯一克隆得到的核不育基因是利用 座子标签法得到的， et 2001）。该基因仅在玉米花药的绒毡层表达，而且表达量从四分体时期开始到液泡化小孢子的中期为最高；同源序列分析表明，与 成酶有相似性，故 因可能参与吲哚型生物碱的合成。 除了以上几种核不育基因之外，还有许多克隆得到的基因与花药的育性相关，如 因（ et 2004），可以导致编码 关蛋白的 解，而这些 白 编码的转录因子参与赤霉素促进 因的表达的过程； 过降低 因在转录水平上的表达来阻碍短日照植物的开花和影响花药的发育。 因（ et 1999）不能够产生功能小孢子，编码的蛋白质具有核定位信号和蛋白质之间互作的结构模块，与拟南芥的 因很相似，其 在于花药室的减数分裂细胞内，而且只在减数分裂的晚期表达。 拟南芥的 因（ Xu et 1995）编码一个富含丙氨酸的开放阅读框，与其他蛋白在结构上相似性较低。原 位杂交显示， 因在绒毡层细胞，发育的小孢子以及花粉粒中均有表达，当它在绒毡层的表达被阻断后，花粉的发育受阻在单粒花粉粒时期；当该基因在花粉中的表达受阻，花粉败育发生在二细胞花粉粒时期，所以它代表了一类双 /单倍体时期控制花粉育性的基因。 在植物生长发育中，茉莉酸代谢途径既在防御系统中表达，而且在花药和花粉的发育当中也非常关键，在花药伸长和花粉的开裂中起到信号传导的作用（ et 1994; 1996）。近几年人们从茉莉酸代谢途径中克隆得到了一系列的 基因， 码 67括 16个富含亮氨酸的重复序列和一个 盒的模块结构（ et 1998）。 一种泛素介导蛋白质的降解作用的受体因子。 3的泛素复合体简称为 et 1996）。 et 2002）。这两个基因可以与 et 1999)，还可以调节在花的发育当中起重要作用的 最近从真核生物的 et 2005）， 而使 花粉粒育性的功能受到影响，发 生变异的小孢子不能够从四分体结构中解离出去，花粉粒在形态上很脆弱，同时细胞壁结构也发生改变。破坏 泌功能，细胞壁蛋白功中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 能 和膜转运蛋白功能相关的一系列基因的正常表达。分析推测 现在发现的与花药育性相关的基因不断增多，但是这些基因与整个转录本中的花药特异表达的基因相比，也只是很少的一部份；如果能一次同时研究多个或大量基因的表达来推测花粉发育过程 中的整体情况就能更清楚研究花药发育的分子机制，也就可以更加深入 了解高等植物雄性 生殖过程。近年来，出现了许多研究大规模 转录谱的方法， of 都是基于高通量的研究工具，都可以用于分析细胞在某一时期的表达谱。高通量表达谱应用于动物和人的例子比较多而且也很广泛，植物中主要在拟南芥 和 水稻中有应用 (et 2003; et 2004; et 2005)。 规模测序数据与基因转录本的研究 作为基因组计划一部分的表达序列 标签（ 定一经提出，引起了不同研究者 的广泛争议 （ et 1991） 。许多基因组学家认为随着人类基因组计划的实施，物理图谱和序列图谱将会不断完善。在所有的组织细胞类型， 不同发育阶段发现每一种表达的 且许多很有价值的 信息（ 来源于内含子和基因间的区 ， 包括调控序列 的信息 ） 都会在 有很多研究者错误的 认为，基因的编码序列，即 全基因组中获得，因此大规模测序 划的支持者们 则 认为 ，基因的编码序列代表了基 因组中信息量的绝大部分， 其 %，而基因组是庞大的，应该把精力放在直接可以翻译成蛋白质产物的 样可以避免在所谓的垃圾 赵志辉， 2003） 。随着 基因组计划的顺利进行，尤其是 色体上定位的数量以及在物理图谱构建过程中作为标记的数量的不断 增 加， 除了可以作为一种发现新基因的有效手段， 据还可以用来研究基因表达 (et 1999)。 这种基于 析的 原理 在于如果一个基 因可以高丰度 表达（指的是在 平上），那么与 对应的 表达水平也应该是以相同的程度在相同的 库中富集表达（ et 2000）。 库的大量的随机测序，通过统计每个基因 所包含的 应的目可以提供一种测定 最初 群体中该基因的表达量 的方法 。 这种电子或者数字化的有优点也有局限性，相对于传统的 微阵列 分析而言 ， 传统的 且实验也只限于研究相同的基因在不同 处理条件和不同组织中的表达量不同的比较。 事实上， 得到相当数量 表达水平可以和标准 参照物的表达含量去比较，从原理上来说 微阵列 分析可以同时探测数以千万的基因在一个时间内的表达水平的变化。 然而， 这种类似于 析的方法仍然是关于定量测定方面的。在几乎所有的微阵列技术中， 由于 技术条件的限制，杂交点上荧光信号的强度可能不能够如实反映真实的 表达水平。 因此微阵列技术在比较 同一个 因在不同处理条件的表达量比率上提供了可靠的数据 ，但是如何比较 不同基因的相对表达量还是一个问题。 与微阵列分析相似，大量的 据可以允许同时研究很多基因的表达， 可以同时比较不同基因的 定量表达。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 5 随着计算生物学和大规模测序计划的开展，研究者不仅仅追求 可以研究的转录本的规模，而且更倾向于采用更方便快捷，更为廉价的手段，利用批量的 (et 1993)来研究基因在某一生长发育时期或者某一种处理条件下的转录本的表达水平已经被验证是一种行之有效的手段，其中这种方法在水稻 (et 1999)，燕麦（ et 2002)，马铃薯（ et 2003），大麦 (et 2004)， 番茄 (et 2004)，小麦 (et 2003; et 2006)等 物种都有研究 。 通过对不存在偏见的 et 1992）。 为了更为真实 地 反 映 度可以作为不同基因表达的验证方法， 1997） 发 展了一种基于相同 和不同 样本数的统计学方法 ，这种测试可以作为一种 有效的 工具去挖掘与代谢途径相关的基因 （ 000） ，例如松树中的细胞壁合成相关基因（ ., et 2001) ； 马铃薯中块茎的发育（ ., et 2003）。 为了检测整体基因的表达情况 ， 1999）运用统计学方法 基于 将 有相同功能的基因 聚类。 这种方法可以被广泛的应用与来自于差异较大的不同的文库的大规模 据 报道， 利用 0个不同小麦组织的文库 因表达倾向于特定的组织，由很多基因在各个组织中都表达 （ et 2003）。 分析中发现，超过 116,000 含相近数量的 们或来自于 5末端，或来 自 于 3末端 麦 据研究 意义 拟南芥，水稻 这两 种模式作物分别代表了 双子叶和单子叶的 开花植物 （ et 2000） ，小麦 基因组 与水稻和拟南芥的 基因组 具有一定程度的共线性 ，而 且 这两者的全基因组序列都已测序，那么我们为什么还需要研究 小麦的 的 列呢 ？ 对本研究而言有 以下两点主要 原因： 小麦作为仅次于水稻的世界第二大粮食作物， 但是在 基因组学方面的研究仍然滞后 ，原因之一就是小麦基因组的复杂性和多倍体特性。从基因组的容量来说，小麦为异源六倍体作物，容量为 16,000每个基因组大概有 5,000容量（ 1991）； 是水稻（ .）基因组的近 40 倍，是拟南芥 （ .） 基