【毕业学位论文】（Word原稿）水稻T-DNA插入黄叶突变体基因克隆与功能分析-生物化学与分子生物学博士论文-

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 水稻 入黄叶突变体基因克隆与功能分析 I 摘 要 叶绿体的 正常发育需要控制叶片发育及编码叶绿体蛋白的核基因与编码自身蛋白的叶绿体基因之间的相互协调。 这些基因的突变将导致叶绿体发育的缺陷、 叶绿素合成减少，叶色变异等。作为一种易于观察的性状突变，叶色突变体 是研究 光合系统结构、功能及其调控机制的理想材料 。本研究以转绿型 水稻 入黄叶突变体 材料， 研究了 其 遗传规律、光合特性、 突变基因及其功能， 从植物生理和分子水平上初步阐明了 变体的突变机理， 为 变体 在水稻光合生理、功能基因组学研究和生产等方面的利用提供了理论依据。另外，本研究还对水稻 入黄叶 突变体 在不同光照条件下的光系统 确了光照强度对 其 光合特性的影响 ，为探讨 变体的突变机理 及其应用奠定了基础。 主要研究结果如下： 1. 变体鉴定与遗传分析表明， 变体为 单隐性核基因控制的 入突变体，且只有一个 入拷贝 。 其未展开叶呈乳黄色，叶片展开后叶色从叶尖向叶基部开始转绿，但完全转绿的叶片仍比野生型浅绿。 变体的这种表型在整个叶片生长发育期间保持稳定不变。 正常生长和结实，是国内外尚未报道的一种新型水稻叶色突变体。 2. ，其倒二叶叶绿素 a、叶绿素 b、 其叶绿素 a/ 随着叶片的发育， 其 叶绿体发育较野生型显著滞后。 2以心叶生长出的第一天为 0d)，有一个完整的内囊体膜体系，叶绿体结构完整，基粒片层丰富，而对应 片的叶绿体基粒垛叠减少，即使 12二叶叶绿体，基粒片层仍明显少于 2然 I（ 最大光化学效率与野生型之间无明显差异，但其 电子传递速率 (光化学猝灭系数 (非光化学猝灭系数 (野生型显著减少，表明其光合系统 供体侧和受体侧的光化学活性均受到了严重抑制； I（ 应中心蛋白 多的叶绿素参与其光系统 I（ 素蛋白复合体的形成。 3. 采用 法，从 变体植株中获得了 入位点的右翼序列，对右翼序列 进行 对及 入与表型的 共分离验证 ，获 得 变体候选基因 定 染色体， 在其第一个外显子起始密码子下游 64。根据 列设计特异引物进行 增，获得了 长 转基因功能互补验证，确定 变体目的基因。 一个新的叶色突变基因，具有一含有锌指结构的精氨酸甲基转移酶互作蛋白功能域 水稻中， 要存在于基因编码产物分别为锌指蛋白、逆转座子、反转录元件类似蛋白和一种假定蛋白 4 类基因中，具有翻译后修饰的功能，在调节核基因的表达和信号传导 中也具有重要作用； 因在根中表达较弱，在叶中表达较强，在茎中的表达中等；除了在 2d 未展开的倒二叶中表达稍弱外 (以心叶生长出的第一天为 0d)， 因在 d、 6d、 8d 和 12d 倒二叶中均较强表达，说明 因不存在时空表达特异性 。 采用 签技术和基因枪转化法将 因转入洋葱表皮细胞，将 因定位在细胞质中，这与 有翻译后修饰的功能一致。 4. 变体是一个叶绿素 b 减少型的突变体， 在整个生长发育期间始终表现为浅黄色的叶色表型，其 叶绿体类囊体膜和基粒片层较野生型显著减少。在微弱 的光照条件下 (50 其色素含量、 事实光化学效率 (光化学淬灭 (光下开放的反应中心捕获的激发能效率(显著低于野生型， 但其 a/b 比值远远高于野生型 。随着光照强度的增加， 其 总叶绿素含量、 加， a/b 比值、 单位色素的光吸收强度 下降， (Z+A)/(V+A+Z)比值伴随着非光化学淬灭 (显著增加而显著增加。 变体 较野生型发育迟缓与其光能利用率低有关，而与光照强度无关。 变体 主要 采用叶黄素循环淬灭多余的激发能而 免受光抑制的伤害。 关键词： 稻黄叶突变体，遗传规律，光合特性， 因，功能分析 he is in of is of of of to of so of In of so as to at of be in on In of so as to of on to in as 1. of of a by a a of to be of of of no 2. of a b of a, b, in of a b of of of of to a of by In or no 2of m) , at in to D2 I of In a of in 3. of YL on of on 4bp TG of YL a of RF ST YL by a a a in a in of In in in in a in he of of to , in d, 6d, 8d, 12d of YL In to in to FP FP by 000/ of in is in of 4. yl a b at in yl of in At 50 S2 of by S2 of hl a/b as of no in S2 m). of 100 00 a in of hl a/b v V of yl of of of yl 32nm 63nm of of yl of of of yl 00 it of Z+A)/(V+A+Z) in yl yl of No in in hl a/b yl of by a in of in yl as of 录 第一章 文献综述 . 1 稻叶色突变体的产生方法 . 1 理、化学诱变 . 1 入突变 . 2 座子 插入突变 . 2 稻叶色突变体的类型 . 3 稻叶色突变体的遗传规律 . 4 稻叶色突变基因的定位 . 4 稻叶色突变相关基因的克隆 . 9 色突变表型的光温调控 . 9 稻叶色突变的分子机制 . 10 绿素合成受阻 . 10 绿体分化与发育受阻 . 13 核信号传导途径受阻 . 13 绿体蛋白转运受阻 . 14 色突变体的应用前景 . 15 色突变体在光形态建成 中的应用 . 15 色突变体在植物激素生理中的应用 . 15 色突变体在植物病理 中的应用 . 16 色突变体在功能基因组学研究中的应用 . 16 为标记性状应用于水稻杂交育种 . 16 色突变体在 高光效育种中的应用 . 17 研究的目的和意义 . 17 第二章 变体的鉴定与遗传分析 . 18 料与方法 . 18 试材料及其种植 . 18 取 . 18 草剂 理 . 18 测 . 18 . 19 果与分析 . 19 变体的 表型 . 19 变体的 鉴定 . 19 变体的遗传分析 . 22 论 . 22 第三章 变体的光合特性研究 . 24 料与方法 . 24 试材料及其种植 . 24 片叶绿素和 . 24 射电子显微镜（ 析 . 24 光动力学参数测定 . 25 囊体膜色素蛋白复合体的分离与分析 . 25 果与分析 . 25 变体的叶绿素含量动态分析 . 25 变体叶绿体发育的电镜动态分析 . 25 变体 成熟 叶的荧光动力学分析 . 25 变体类囊体膜色素蛋白复合体 析 . 28 论 . 28 第四章 变体基因克隆与功能分析 . 30 料与方法 . 30 试材料 . 30 剂 . 30 取 . 32 入位点右翼序列的扩增 . 32 粒 小量提取 . 32 脂糖凝胶 收 . 32 . 32 入位点右翼序列 生物信息学分析相关 软件或工具 . 32 入与 变体表型共分离的 测 . 32 选基因 隆 . 32 基因植物表达载体的构建 . 33 选 基因 功能互补验证 . 33 的基因 织与阶段表达特异性的 析 . 33 的基因 亚细胞定位 . 33 果与分析 . 33 入位点右翼序列扩增及其 生物信息学分析 . 33 入与 变体表型共分离分析 . 35 选基因 隆与序列分析 .