【毕业学位论文】（Word原稿）小麦抗白粉病近等基因系cDNA文库构建及抗病相关基因的全长cDNA克隆生物化学与分子生物学论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小麦抗白粉病近等基因系 库构建 及抗病相关基因的全长 隆 of of I 摘要 白粉病（ 是影响我国小麦生产的主要病害之一。实践证明，培育抗病品种是控制小麦白粉病的经济有效途径。本实验室培育的小麦抗白粉病近等基因系（ *北京 837 因，该基因对我国目前白粉病主要流行小种表现高抗至免疫。对 因及其抗白粉病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明抗病机制，而且对小麦抗白粉病研究具有重要价值。本研究以 库为基础，以测序为主线，结合生物信息学方法和术对获得的目标序列进行结构和表达分析，以期获得抗病相关基因 。 以小麦抗白粉病近等基因系（ *北京 837材料， 在接种后 1 小时、 3 小时、 6小时、 9 小时、 12 小时、 16 小时、 20 小时、 24 小时剪取叶片，构建了不同时间点混合的 白粉病菌诱导早期的小麦叶片 库 。 文库初始滴度为 06组率 96%，用包装后的原始文库直接转化寄主菌 化效率为 90%以上，插入片段主要分布在 均大小为 900右。 通过随机测序，获得了 216 条质量好的 列。利用 序将获得的 216条 列与 据库进行同源 分析 ，并将两种比较结果进行汇总， 获得的结果如下： 102 条序列与 13 类功能已知基因同源性很高； 42 条序列与功能未知基因同源性很高；其余 72 条序列中 58 条可找到同源的 列， 14 条序列在 未检索到任何同源序列。在配准已知基因的 102 条 列中， 33 条序列与 30 种假定的抗病相关基因同源性很高。这些假定的抗病相关基因包含于抗病反应的全过程，包括起识别病原菌作用的 R 基因、 小G 蛋白类基因、离子通道成分、 参与信号传导的激酶、调节 基因表达的转录因子、过敏反应诱导产生的蛋白、参与防卫反应的蛋白、参与细 胞壁代谢的蛋白、与基础防御和非寄主抗性有关的蛋白、在抗病过程中与细胞自我保卫相关的蛋白以及与病原菌互作的寄主因子。 选择 9 条假定的抗病相关基因，利用生物信息学软件对其进行了序列特征分析，根据它们的序列设计引物，采用 术，研究了它们在不同器官以及接种白粉 病菌后的表达情况。小麦钙依赖性蛋白激酶类基因 长 1172有一个 876完整 码291 个氨基酸，具有 构域和 4 个手性区。它比所有配准的 少 13 个氨基酸残基。小麦 因 长 1120有一个 378 码 125 个氨基酸，与水稻蛋白激酶 前体同源性很高。这两个基因 对病原菌诱导有应答作用，可能参与了抗病反应过程，它们的表达模式和表达量在抗感材料间存在显著差异。在 24 小时诱导时间内，其它7个基因转录本的积累没有明显的变化。 器官表达分析表明：钙依赖性蛋白激酶类基因 因、 基因以及 基因 在不同器官间转录本积累水平不同。 根据获得的假定的 富含甘氨酸蛋白基因序列设计引物，在 5 个不同的小麦基因组 进 行扩增，在 白粉 病近等基因系中得到 一条约 5不同于其它 4 个材料的扩增带。 通过 电子拼接和 术，获得一个小麦中尚未报道的小 G 蛋白基因 全长列。 因拟编码的蛋白具有结合 4 个保守结构域以及 族成员所特有的结构域。结构域分析表明： 个结构域在小麦材料间非常保守，而 构域的 A 氨基酸残基及其邻近的 C 端 6 个氨基酸残基在材料间存在着很大差异。基因表达表明： 因的表达不受白粉病菌诱导。 关键词： 小麦，白粉病， 库，抗病相关基因，基因表达 is of to is is of In to of , 3, 6, 9, 12, 16, 20 4 A of 066%. 0%. of .4 kb .0 of .9 216 on as 102 3 of 42 to 58 14 no 02 33 0 to in of in by in to in 3 to 9 on to in to 172 bp an 76 bp 91 by 3 120 bp an 78 bp 25 of by in in of no at on of in a of to NA A 00bp of a ab A of of by to 录 第一章 绪论 1 1 1 长 隆策略 1 物功能基因组学研究 6 物抗病性研究进展 10 麦抗白粉病相关基因研究进展 21 究内容和方法 23 第二章 白粉病菌诱导早期小麦叶片 库构建及序列分析 25 25 料与处理 25 法 25 32 度与质量检测结果 32 扩增 库的滴度与重组率 32 化效率 32 列的产生 33 分析结果 33 分析结果 33 35 35 库的载体选择 35 于基因功能的划分 35 病信号传导途径 36 库测序获取目标序列的可行性 37 第三章 小麦抗病相关基因全长 列鉴定及表达分析 39 39 料 39 法 39 42 小麦钙依赖性蛋白激酶类基因 序列鉴定及表达特性分析 42 麦受体类蛋白激酶基因 序列鉴定及表达特性分析 47 麦 因的序列鉴定及表达特性分析 50 麦 基因（ 序列鉴定及表达特性分析 52 麦富含甘氨酸蛋白 （ 因 序列鉴定及表达特性分析 54 麦 族 转录因子（ 的序列鉴定及表达特性分析 57 麦 可溶性 序列鉴定及表达特性分析 59 V 麦类质子泵基因（ 的序列鉴定及表达特性分析 61 麦 丝氨酸 因 (序列鉴定及表达特性分析 64 论 66 抗白粉病有关的小麦类 因 66 粉病菌诱导增强的小麦类钙依赖性蛋白激酶基因 67 麦 录因子基因（ 68 氨酸 /苏氨酸蛋白激酶基因分析 68 麦富含甘氨酸蛋白 （ 因（ 69 麦 因（ 69 麦 质子泵基因（ 69 麦 可溶性 69 第四章 基于电子延伸技术的小麦小 70 料与方法 70 料与处理 70 取 70 子延伸的基本过程 70 源性比较 71 白的多序列比较 71 增 71 增片段克隆及测序 71 因的 定量检测 72 73 列拼接结果 73 麦 因 长的分离 73 导的小麦 白质的结构域分析及同源性比较 74 麦 白结构域的保守性分析 75 因的表达分析 75 76 于电子拼接 76 于 76 参考文献 79 致谢 93 附录 94 作者简历 114 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 究目的和意义 白粉病是影响我国小麦生产的主要病害之一，随着施肥、灌溉条件的改善和半矮杆品种的推广应用，其危害有扩大和逐年加重的趋势，抗病育种形式非常严峻。中国农业科学院作物科学所农 业部作物种质资源与生物技术重点实验室以北京 837 作轮回亲本，经过多年回交和自交成功地获得了含 因的抗白粉病近等基因系。 因 对我国目前白粉病主要流行小种表现高抗至免疫。 对 因及相关防卫基因的克隆研究不仅有利于阐明其抗病机制，而且对实施农作物基因工程高效育种具有重大意义。 库是真核生物 群的 贝集合，是发现新基因和研究基因结构及功能的基础工具，该技术已成为当今研究真核分子生物学的基本手段。以往人们构建的小麦白粉病菌诱导的 库，取样时间点都比较偏后，这样很难 捕捉到抗病反应途径中的早期反应基因或节点基因。大多数植物抗病基因为组成型表达（ et 1997），但也有诱导表达的，如 et 1996)。即使是组成型表达，在病菌的诱导下，表达量可能会有低水平的增强。 因是否为诱导表达目前还不清楚。本研究的主要目的是通过构建白粉病菌诱导早期 小麦叶片 库 ， 采用随机测序策略 ， 并结合生物信息学方法和 以期获得 与 白粉病抗 性有关 基因。 内外研 究现状 长 隆策略 在人类基因组计划的带动下，拟南芥 (et 1999, et 1999)、水稻 (et 2002, et 2002)等植物基因组的序列草图相继完成，给人类提出了新的挑战：如何鉴定这些序列的功能及解析生命现象的本质，这是一个更加庞大而复杂的课题，正促使一门新的学科即功能基因组学的产生与发展。功能基因组学研究的内容非常广泛，但是认识基因功能的基本前提是获取可能有相关功能的基因全长编码序列。其中全长 列的获得是正确地注释基因组序列、阐明基因功能和产物的必要条件 (et 2003)。 目前获得全长 隆的分子生物学技术有三种，即 库筛选法、以 基础的 端快速扩增法（ of 及基于生物信息学的硅片克隆技术（ in 现就上述三种方法分述如下 ： 库筛选法（ 或大量测序技术） 该技术的核心是构建高质量的 库。 库是真核生物 群的 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 贝集合，它只代表一定时期正在表达的 15%左右的基因 ,因此 隆的复杂程度比直接从基因组克隆要小得多，而且由于每个 隆只代表一种 列 ,因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低。 库具有多方面的用途。首先，可以从 库中获得全长基因。在已知基因的蛋白质产物或部分氨基酸序列后，可以根据氨基酸序列设计一段简并寡核苷酸作探针，从相应 库中筛选到该基因的全长 可以用已获得的该基因的部分核苷酸序列作探针，从相应 库中筛选到该基因的全长 次 库来源于基因表达产物，基因在染色体上大多数为单、低拷贝，位置数目有限，因此是很好的 次，从 库中获得的基因序列已不含有内含子和边侧调控序列，与其对应的基因组序列相比较，可以弄清基因的结构。另外，通过对 库的大量测序可以发现新基因和了解生物体内基因含量及某基因的表达丰度。 于克隆和大量扩增，不象基因组内含子难于表达，从 库筛选到所需目的基因后，可直接用于该目的基因的表达和转基因研究，在基因工程研究中，真核细胞的 库往往比基 因组文库更为有用。因此， 库的构建成为当前真核生物分子生物学研究和基因工程操作的基础。 经典的 库建立方法是用 逆转录引物，也有用随机引物的，然后给合成的 上适当的连接结构，连接到适当的载体中而构成。这种建库方法实用、高效、简单方便。但最大的缺点是文库中克隆片段的长度一般较小，一般需若干个克隆才能覆盖一个完整的 ao et 1996； Yu et 1997)，用经典的 成方法得到的产量通常不高，造成这种低效率的主要原因是目前构建 库的标准方案里，从 板出发到最后合成双链 段，需经过多步的体外酶学反应，由于无法做到在每步酶学反应结束后纯化出反应产物以进行下一步酶学反应，所以只能采取折中方法，将所有的酶学反应都放在一个经优化的基础缓冲条件下进行，这种优化的反应条件不是各种酶催化活性发挥所需的最佳条件，因此反应效率自然不会高。 为了更加有效地克隆新的基因 ,如何克服仅由 )尾合成 术路线的局限性 ,以及由逆转录酶作用特点导致的局限性 ,建立富含全长 文库就显得非常有意义。为了避免 为 一链合成的引物造成的 截现象，人们对第一链引物末端的两个碱基作了改进（ 中 V 可以是 A、 C 或 G， N 则为 A、 T、 C、 G 中的任意一种碱基，这就避免了由于 部存在寡聚（ T）而造成的 应于 3端出现的短截现象。传统的逆转录酶 都不能逆转录出很长的 推出 ,使逆转录出更长的 为可能。 (et 2000)研究表明一些糖类如海藻糖能有效提高反转录酶和 其它一些酶类的活性，并能提高酶的最适反应温度，从而为打破 二级结构，提高反转录的效率提供了可能。 真核生物的 原核生物不同，其 5端有一个特殊的甲基化帽子结构， 5端帽子结构就成为人们构建全长 库，寻找突破口的主要目标。全长 库的构建方法都是基于 5端帽子结构的特殊性研究出来的。其中代表性的方法有： et 1997；et 1994)、 (et 1995)、 (Y.Y et 2001)、 et 1996)、 et 1999）。 此方法又叫做寡聚核糖核酸单链连接法（ 1994 年， 人首先取得了突破。他们利用 5帽子的结构中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 特点 ,用细菌碱性磷酸酶 (除无 5端保护的、部分降解的、不完整 端的游离磷酸基团 ，再用烟草酸性磷酸酶 (除 5的 构仅保留一个 5P，合成一段寡核糖核酸，用 接酶连接到经过处理的 的 5后利用修饰的 逆转录 ,并进行 应 ,称为 方法的优点在于为反转录第一链 到全长设定了标准，从而有利于全长 富集。理论上由于利用了 术会导致基因的拷贝数得到极大的扩增，从而利用极少量的起 始材料就可以建库。该方法存在的不足有以下四点： 应的效率比理论上的大大降低，所以需要的起 始材料非常大。 及 应在模板的量和长度上的选择性，所以会导致在文库中某种类型的克隆的富集，因此，不能真实地反映组织中各种基因的存在情况，同时会在以后的测序反应中产生冗余性。 板长时间的暴露在酶反应中会使降解的风险性加大，不利于得到高质量的库。 接酶，一般来讲 接酶没有 接酶的效率高，所以连接效率的高低也会直接影响到文库的质量。 （ 1995）报 道了一种称为 方法 ,据称能够非常有效地建立全长的 库。他们利用 帽结合蛋白 专门结合 帽结构 ,含有完整帽子结构的富集 , 逆转录后用 用于 合子 ， 未被帽结合蛋白结合的 部分降解 的不完整 有一些虽结合了 帽结合蛋白 但 不完整的 被降解 , 仅完整 有全长 一链结合保护的那些 保护 ， 进一步纯化富集后建库 ,获得的克隆全长比例很高 ,但每次需极其大量的 00 另外 ， 被帽结合蛋白结合的 端约 10 50丢失。所以严格来讲所谓的全长 库并不是全长的。此技术的优点是 ：特异地对 5帽子进行筛选，目的性更强；整个过程对 酶促反应较少，降低了 利于得到全长的 隆，从而使文库中全长的比例很高；不进行 因的冗余性大大降低。此技术的缺点是效率和产量很低，需要的起始材料的量非常大 ,不利于有限材料的建库；模板 端的二级结构对帽结合蛋白的有效性有着非常大的影响，从而会导致某一种类型 的 富集，使文库的克隆产生偏向性；被帽结合蛋白结合的末端约 10碱基被丢失，不利于分析。 （ 司推出的试剂盒 又命名为 是利用帽子结构特征 ,充分利用了反转录酶 T 末端转移酶活性和限制性内切酶 特性。 T 是转录酶经过点 突变而得来的，它丧失了 性，但仍然保留着野生