【毕业学位论文】（Word原稿）玉米抗大斑病种质的抗性基因分析作物种质资源硕士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 玉米抗大斑病种质的抗性基因分析 I 摘 要 大斑突脐孢菌（ 起的玉米大斑病 是世界性流行病害，目前该菌已成为影响我国玉米生产的主要病原菌之一。利用抗病品种是防治大斑病最为经济、有效的措施。玉米与玉米大斑病菌间的互作符合 “基因对基因”假说，因此可以利用基因推导方法对玉米资源进行抗大 斑病基因鉴定。随着分子标记技术的发展和应用，包括玉米大斑病抗性基因在内的许多植物抗病基因被分子定位和作图。利用与抗病基因紧密连锁的分子标记对抗病资源进行检测是鉴定抗病基因快速而有效的方法。本研究对 100 份抗大斑病玉米资源进行了抗性基因推导，分析了部分已发表的抗大斑病基因连锁标记的实用性，利用 析技术构建了抗大斑病基因的新的连锁标记，并利用有效的标记检测了抗性种质中可能携带的抗性基因。主要研究结果如下： 1. 用喷雾接种法鉴定了 100 份抗大斑病玉米资源，通过分析寄主与病菌小种的互作模式，确认 49 份玉米资源携带 因，占供试资源的 49； 24 份携带 因，占供试资源的 24； 29 份携带 因，占供试资源的 29； 13 份携带 因，占供试资源的 13。 2. 利用含不同抗大斑病基因背景的黄早四近等基因系对已报道的与抗性基因 锁的引物 抗性基因 锁的引物 果发现这 5 对引物在近等基因系内均有有效扩增，且片段大小基本一致，并未产生多态性扩增或与相关抗性基因 背景一致的 特异性的 扩增。 3. 利用 4 个成对近等基因系对 29 对 物分别进行检测，发现只有位于染色体 黄早四 黄早四这对近等基因系内的扩增具有多态性，初步推测 锁。 4. 利用 30 条 物对黄早四近等基因系进行了扩增，发现引物 1012、 扩增产生特异性条带。对这些特异条带进行回收、测序、引物设计、扩增检测，获得与 性基因连锁的 物对 与 性基因连锁的 物对 用这两对引物对 100 份抗性资源进行鉴定，检测出 20份材料中携带 因， 10 份材料中携带 因，结果与基因推导方法一致。 关键词： 玉米，大斑病，抗性，基因 is of in is of is to E. is a of so in be on to in a of to in as of 986 004. 1. 100 t1 9 9%; 4 4%; 9 9%; 3 3%. 2. of t2 tN in no or in of 3. 29 of on It be t3 4. 30 to of to be to be t3 to be to 00 t3 0 tN 0 略 语 表 缩略词 英文全称 中文全称 GA NA , N, N, N苄青霉素 碱基对 乙二胺四乙酸二钠盐 表达序列标签 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 数量性状位点 随机扩增多态性 制性酶切片段长度多态性 抗病基因同源序列 每秒转速 特征序列扩增区 单核苷酸多态性 简单重复序列 序列标签位点 N, N, N, N三（羟甲基）氨基甲烷 513 吲哚 近等基因系 录 第一章 引 言 . 1 1. 玉米大斑病概况 . 1 米大斑病的病原 . 1 米大斑病的症状 . 1 害发生和环境条件 . 2 理小种分化 . 2 国玉米大斑病的流行与变化 . 2 病机制 . 3 米抗大斑病资源筛选 . 3 米大斑病的防治方法 . 4 2. 玉米大斑病抗性基因及抗性遗传 . 4 米大斑病抗性基因的来源 . 4 米大斑病抗性基因的遗传特征 . 5 3. 子标记的研究进展 . 6 记 . 6 记 . 7 记 . 7 4. 玉米抗大斑病基因的分子标记 . 7 找目标基因分子标记的方法 . 7 玉米大斑病基因的分子标记 . 8 5. 分子标记辅助选择育种 . 10 6. 研究目的和意义 . 11 第二章 玉米抗大斑病种质的抗性基因推导 . 12 1. 材料与方法 . 12 验材料 . 12 验方法 . 12 2. 结果与分析 . 13 米资源对大斑病 4 个生理小种抗性鉴定结果 . 13 米大斑病发病的影响因素 . 16 3. 讨论 . 16 第三章 已报道与 性基因连锁分子标记的应用检测 . 17 1. 材料与方法 . 17 验 材料 . 17 验试剂及仪器 . 17 验方法 . 18 2. 结果与分析 . 23 米基因组 提取与检测 . 23 因连锁标记的检测 . 24 因连锁标记的检测 . 25 V 物 增片段回收、克隆及序列分析 . 25 3. 讨论 . 28 第四章 因连锁 记的筛选 . 29 1. 材料与方法 . 29 验材料 . 29 验方法 . 29 2. 结果与分析 . 31 米基因组 提取与检测 . 31 物的扩增与检测 . 31 3. 讨论 . 33 第五章 玉米大斑病抗性基因的 析 . 34 1. 材料与方法 . 34 验材料 . 34 验方法 . 34 2. 结果与分析 . 35 米基因组 提取与检测 . 35 物的扩增与检测 . 36 异性 段的克隆 . 37 3. 讨论 . 41 结论 . 42 参考文献 . 43 致谢 . 48 作者简历 . 49 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 1876 年首次在意大利发现的玉米大斑病，目前已经成为世界性流行病害，主要发生在气候冷凉湿润地区。中国在 1899 年首次记载了大斑病的发生，目前病害已遍及全国，以东北、华北北部、西北和南方山区的冷凉玉米产区发病较重（ 董金皋， 2001） 。 大斑病的流行常对玉米生产造成严重的损失， 一般年份减产 20左右，严重流行年份减产可达 50以上（ 孙淑琴等， 123）。由于目前育种中使用的大斑病抗源贫乏、抗病品种的单一布局及大斑病病菌小种的变异， 20 世纪 80 年代 末期在生产上推广的骨干自交系 8112 和 5003 等高度感染，带有 因的 也出现萎蔫斑 （ 董金皋， 2001） ；以后的十年间， 辽宁等北方省区出现了玉米大斑病菌 2 号小种，且逐步变为优势种群，使带 因的丹玉 13 号等品种抗病性逐步丧失，大斑病的发生逐年加重，玉米大面积减产（ 陈刚等， 1993）。 根据田间调查、生产信息收集和对国家玉米区域试验 200 余个试点多年结果数据的分析，玉米大斑病近年来又呈现明显加重趋势，特别是在东北春玉米区和西南春玉米区的局部地区已经成灾（ 王晓鸣等， 2006；王玉萍等， 2006） 。 1. 玉米大斑病概况 米大斑病的病原 玉米大斑病（ 由大斑刚毛球腔菌 性态为大斑突脐孢 所引起的以叶部产生大型病斑症状为主的玉米病害 ， 又称条斑病、煤纹病、枯叶病、叶斑病等 。 大斑病菌主要以菌丝体或分生孢子在发病的组织（病残体）中越冬，因此遗落在 田间的病叶和秸秆是重要的初侵染源；种子上和堆肥中尚未腐烂的病菌也能越冬，成为来年的初侵染来源 （ 董金皋， 2001） 。 米大斑病的症状 玉米在整个生育期均可感染大斑病。在自然条件下由于存在阶段抗病性，苗期很少发病，到玉米生长后期，尤其是在抽雄后发病逐渐加重。 病菌主要危害叶片，严重时也可危害叶鞘、苞叶和籽粒。叶片发病后，发病部位先出现水渍状（室内）或灰绿色（田间）小斑点，随后沿叶脉方向迅速扩大，形成黄褐色或灰褐色梭形大斑，病斑中间颜色较浅，边缘较深 （ 董金皋， 2001） 。 病害主要发生在玉米抽雄以后，下部叶片首先发病并迅速向上部叶片扩展，在叶片上产生大量病斑，影响植株光合作用，造成籽粒灌浆不足，导致产量降低。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 害发生和环境条件 玉米大斑病分生孢子形成的温度 15 33，最适温度 23 25；分生孢子萌发的温度5 42，较适宜的温度 26 32。不同小种菌丝生长、孢子形成和萌发的温度不同。分生孢子形成和萌发都需要较高的温度，但孢子形成后抗干燥能力很强，在玉米种子上可存活 1年以上。 该病的发病适温为 20 25，超过 28则对病害有抑制作用；适宜发病的相对湿度在90以上，这对孢子的形成、萌发和 侵入都有利。因此， 7 8 月份，如果温度偏低，多雨高湿，日照不足，均有利于大斑病的发生和流行。中国北方各玉米产区， 6 8 月气温大多适于发病，这样降雨就成为大斑病发病轻重的决定因素 （ 董金皋， 2001） 。 理小种分化 玉米大斑病菌的寄主范围很广，它能侵染玉米、高粱、苏丹草、约翰逊草、狗牙草和稗等多种禾本科植物。大斑病菌有明显的生理分化现象， 1974 年将大斑病菌划分为两个专化型，即高粱专化型和玉米专化型。前者可以侵染玉米、高粱、苏丹草和约翰逊草，而后者只侵染玉米。在玉米专化型中，根据 对玉米中含有的显性单基因 毒性差异分为不同的生理小种。 1989 年， 建议修正大斑病菌生理小种命名法 (表 1)，以有效抗性基因 /无效寄主基因表示，并以无效寄主基因的序号作为该小种的名称，与该小种的致病性相关，这样可以将新发现的生理小种和新鉴定的抗性基因明确表示出来。 表 1 玉米大斑病菌的生理分化 he 种名称 新命名法 * 小种名称 病斑反应型 毒力公式 （有效抗性基因 /无效寄主基因） 0 R R R R 0 2 1 S R R R 23 R S S R 23N R S S S 2N R S R S 国玉米大斑病的流行与变化 玉米病害的发生发展 , 按照生物进化的规律而演变 , 玉米品种的更换 , 与玉米病害种类的更迭及某些病害的病原菌生理小种的演替是相辅相成的。 在自然生态系统中，寄主植物与有害生物（ 病原菌和害虫）大多是遗传上具有多样性的异质群体。双方通过相互适应和选择而协同进化（ 小种组成比例常随寄主的品种类型和自然、栽培条件的变化而消长。当某一地区大面积推广某个品种时，能寄生与该品种上的小种，便逐渐繁殖、积累而成为优势小种；而原来的优势小种，由于失去了最优中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 的寄主条件便降为次要小种。 现代农业造成的品种单一化和遗传单一化加速了对病原菌定向选择和优势生理小种形成，由于大斑病生理小种的变异，致使原来抗大斑病的玉米品种抗性不断 “丧失 ”，对玉米生产造成严重危害。根据病菌与寄主的互作， 在理论上，玉米大斑病病菌可以存在 16 个小种。60 年代以来，国内外对于玉米大斑病菌生理小种的变化已有很多报导。 潘顺法 等 （ 1982） 对 1977 1979 年采自全国 21 个玉米产区的 171 个玉米大斑病标样进行测定， 发现 当时我国玉米产区大斑 病 菌完全是 0 号生理小种，没有 1 号小种或其他小种 。吴纪昌等于 1983 年在辽宁丹东发现了 1 号小种，然而由于生产上大面积推广含 因的玉米品种，使得 1 号小种迅速发生流行。 吴安国等 （ 1986， 1989） 首次在云南报道了侵染 菌株 ， 即 23 号 生理小种；而 0 号小种仍为当时 的 优 势小种 。李晓等 1999 年报道，在我国四川、贵州等地已经发现有 1、 23、 23N 号生理小种，以及一些未定型的生理小种。 桂秀梅 等（ 2003） 对 1999 年采集来自河北，辽宁，黑龙江等省的 40 份玉米大斑病菌进行鉴定， 共 鉴定出 0 号 、 1 号 、 12 号 、 13 号 、 3 号 、 1N 号 、 3N 号 、 N 号 、 23N 号 、 12N 号 、123N 号 等 16 个生理小种。 今后随着玉米新杂交种的更新换代，特别是 抗性基因在玉米杂交种中的普遍利用，势必加大对病菌群体的选择压力，造成病菌群体内的变异，使之很快产生更多的新的致病类型 ，从而对我国的玉米种植和生产产生严 重影响。 病机制 （ 1957）报道，孢子萌发和侵入的最高峰出现在接种后 12 18 小时，约有90%是直接侵入的，多数侵入点为表皮细胞壁的结合处； 10%左右经气孔侵入。白金铠（ 1985）和刘纪麟（ 1991）研究报道，从孢子萌发、侵入寄主组织到发病出现病斑，不同基因型的玉米品系之间无明显的差异。 在多基因抗性玉米上，菌丝侵入叶片组织内木质部后，在木质部的管胞和导管里纵向和横向生长受到阻碍，延缓病斑扩大，其病斑区扩大是由坏死的叶肉组织里菌丝生长造成的。在 因控制的褪绿斑里，菌丝在木质部 导管和管胞中生长受抑制，在被菌丝侵害区的叶肉细胞里产生特殊的颗粒状物质，叶肉细胞解体，叶绿体结构变成无定形状态，病斑区外观表现为褪绿斑；由 制的无病斑抗性，菌丝不能进入木质部导管和管胞里，在叶肉细胞里细胞物质消失，或叶绿体结构被破坏，细胞内沉积许多小球状物质，它比具有 因的寄主产生的颗粒状物质大，但数量少，且局限于几个细胞中（ ， 1965；刘曙东等，1986）。 米抗大斑病资源筛选 对于大范围发生并通过气流传播的真菌病害，主要的控制措施是采用抗病品种，而培育抗病品种的前提是筛选 抗病资源。 “七五”、“八五”期间 ， 中国农科院品资所组织全国有关 科研单位 ， 采取统一供种、设立抗感对照品种、对中抗以上材料重复鉴定的评价方法 ，系统地同步异地开展了玉米资源对大斑病抗性鉴定 ， 完成了 6085 份的抗性鉴定工作 ,发现抗大斑病的种质（中抗水平以上） 654 份，只占 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 1997晓鸣等采用人工接种方法对 64份自交系和 28份育成材料进行了鉴定，中抗 大斑病以上材料为 24份，其中高抗的只有 5份。赵宝荣 2000年对 496份玉米自交系进行大斑病抗性鉴定，抗病材料占 其中高抗的只占 1 。佟圣辉等于 2005年对我国玉米育种和生产上应用的五大杂优群自交系对主要病害的抗性进行了鉴定和分析，认为 其组配杂交种在 米大斑病的防治方法 大斑病的防治，应采取以推广和利用抗病品种为主，加强栽培管理，及时辅以必要的药剂防治（ 董金皋， 2001；刘纪麟， 1991； 白金铠， 1997；王晓鸣， 2002） 。 植抗病品种，进行合理布局 种植抗病品种是控制大斑病发生和流行的根本途径，是最经济有效的措施。大斑病菌生理分化现象明显，在选用抗病 品种时应注意小种类群与玉米品系之间的关系，根据病菌生理小种类群的变异消长和稳定程度，慎重选用带 因的玉米品系。 在大的区域里合理布局品种，在一定区域范围里种植一套抗病基因品种，在另一地区里种植另一套抗病基因品种，起到隔离作用，限制住毒力小种的定向选择，防止优势小种的形成和扩散。在小的区域里，搭配种植不同抗性的品种，使品种群体的抗病性在遗传上是异质的、多样的。 进栽培技术，及时清除菌源 玉米大斑病菌属于弱寄生菌，当植株从营养生长过渡到生殖生长时易受到病菌的侵染，因此增施粪肥可提高寄主的抗病能 力。另外，适期早播可以缩短后期处于高温多雨和低湿阶段的生育日数，对夏玉米避病和增产有较明显的作用。 大斑病菌能在病株残体上，以分生孢子和菌丝体安全越冬，成为第二年玉米发病的初侵染来源。因此玉米收获以后，搞好田间卫生，彻底清除田内外病残组织，消灭初侵染来源，是一项行之有效的措施。 剂防治 由于玉米植株高大，田间作业比较艰苦，因此使用化学药剂防治玉米大斑病在生产上较难推广，但在极端情况下（抗病品种大面积丧失抗性）以及在发病初期仍不失为一种补救措施。常用药剂有 75百菌清可湿性粉剂 300 500 倍液 、 50多菌灵可湿性粉剂 500 倍液、80代森锰锌可湿性粉剂 500 倍液。 2. 玉米大斑病抗性基因及抗性遗传 米大斑病抗性基因的来源 因是 1959 年从来源于秘鲁的爆裂玉米 妇人指上发现的，受显性单基因控制（ 1961），对大斑病菌生理小种 0、 23、 23N、 2N 号小种均表现为褪绿斑抗性，而对 1 号生理小种则表现为萎蔫斑。该基因可以通过回交方法转育到任何自交系里，已被广中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 泛应用于国内外的玉米杂交种组配选育中。为表明 因的来源，凡用 育的加一个 A 字，如 妇人指转育的加一个 B 字，如 因是 来自澳大利亚自交系 获得的。它与 因座不同，用 交后可将两个显性基因分离开，一个是 因座上有一个 个是 因座上有一个 因。 大斑病菌 0 号和 1 号生理小种均表现为褪绿斑抗性，而对 23、 23975）。 因是 佛罗里达州的摩擦禾（ 分离到的一个独立于 因的新的显性单基因，它对 0、 1 和 2N 号生理小种均表现褪绿斑抗性，而对 23 和 23N 号生理小种则表现为萎蔫斑（ 1977）。 因属于无病斑抗性， 1975 年 罗得西亚的墨西哥玉米品种 衍生出一个显性单基因抗病类型（ 1975）。这种抗性阻止病菌进入木质部导管，延长了病害的潜育期，推迟病斑出现和开始产孢的时间。这个基因对 0、 1 和 23 号生理小种均表现抗性，对 23N 号小种则表现感病。 1995 年 道发现 357 系对大斑病 0、 1、 23 和 23N 号生理小种表现出褪绿斑抗性，该表现型由一个隐性基因控制，定名为 1995）。 因是 来自 选育出来的自交系 发现的。经与 6 个自交系杂交和多基因抗病亲本回交，结果表明 大斑病的抗性是由单基因控制的，其主效基因不同于 因，认为是位于另一基因座上的 因（ ， 1993）。 玉米对大斑病菌的抗性有数量抗病性和质量抗病 性两种类型。 数量抗病性是受多基因控制的水平抗病性，对所有大斑病菌的生理小种均有效，而且几乎所有的玉米种质（杂交种、自交系、农家种等）都具有这种抗性。杂交子代对大斑病的抗性呈部分显性，多介于两个亲本之间，且多倾向于抗病强的亲本。这种由多基因联合作用控制的抗病性，不易受到新的生理小种克服而丧失抗病性，这种抗病基因通过育种程序可以累加，采取轮回选种方法是一种集中抗病基因的有效方法 （ ， 1994） 。据 定，杂交种里抗性表现为累加性和上位性，所有杂交组合都是以累加性基因作用为最 重要的，非累加基因效应一般较小 （ ， 1971） 。 质量抗病性是受显性单基因控制的垂直抗性，但也有少数自交系表现的抗性不是由显性单基因控制，其中 抗性可能是隐性遗传的 （ ， 1981） 。目前已经发现了由 制的褪绿斑抗性，其中 因是弱基因，其纯合时比杂合时抗病性更强（ 刘纪麟， 1991）。褪绿斑抗性的作用是限制病斑的扩展，抑制产孢，大大减少初始菌量，从而抑制病害的流行。此外，还有由显性单基因 制的无病斑抗性，其作用主要是延长病害潜育期，推迟病斑出 现和开始产孢的时间。 因与 因是独立遗传的，并对它们具有显性上位作用，当它与 因存在于同一个体中时，由于其抗病作用发生于病斑的早期，因而抑制了褪绿斑表型的表达，仍然表现为无病斑（徐中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 尚忠， 1987）。在组配杂交种的亲本中有一个亲本具有单基因抗性时，其杂交后代多表现为褪绿斑呈显性遗传，大部分表现为超亲抗性 （李莫然 ， 1990） 。 在不同的自然环境条件下，各种抗性基因均能表现出不同程度的抗病作用。 因的抗性受环境条件的影响较小， 因受环境条件影响较大。 因抗性受环境影响最明显，在春季表现为理想的无病斑抗性，而在秋季其病斑反应型与感病基因的反应型很难区别，抗病作用显著下降（ 朱友林， 1995）。 显性单基因相互独立遗传，但这些抗性基因具有累加效应