【毕业学位论文】（Word原稿）利用SSR标记分析寄主植物对B型烟粉虱种群遗传变异的影响农业昆虫与害虫防治硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 利用 型烟粉虱种群遗传变异的影响 I 摘 要 烟粉虱是一种由多种生物型组成的世界性的重要农业害虫。除了直接危害寄主植物外，还能传播多种植物的病毒病，给农业生产造成巨大损失。在烟粉虱 多种 生物型 中， B 生物型是一种入侵性较强的致害类型，该生物型自 90 年代中后期入侵我国以来，在广大地方爆发成灾，已成为我国蔬菜、花卉和棉花等经济作物上的主要害虫。种群遗传变异引起的“遗传后适应”可以导致外来物种对新入侵环境的快速适应并扩展暴发，种群遗传变异因子研究对于阐明外来入侵生物入侵与种群扩张暴发机制，预防与控制外来生物入侵具有重要理论与实践意义。 本论文采用 记分析了寄主植物对 B 型烟粉虱遗传分化的影响。分别于 2005 年和 2006年对来自于同一母体种群并在 5种寄主植物上隔离饲养的烟粉虱样本进行种群间与 种群内的遗传变异分析，结果表明寄主植物是影响烟粉虱种群遗传结构的一个重要因素， 5 个寄主上的烟粉虱种群都表现出不同程度的遗传分化。具体实验结果如下： （ 1）筛选出多态性较好的 6 对引物，每对引物检测出的等位基因数为 2 9 条，其中 条； 测到的等位基因最少为 2 条。共检测到 28 条等位基因变异，平均每个位点 。 （ 2） 2005 年，利用 4 对 物对 5 个寄主种群共 162 个烟粉虱样本进行遗传变异分析，结果发现所有位点上均有遗传分化的发生 （ ,0, 其中番茄种群内部的遗传分化 （ 程度最高，大于番茄种群与其它四个寄主种群间的遗传分化程度。甘蓝种群内部的遗传分化也相当显著 （ 黄瓜种群的内部变异程度最低（ 关键词 ： B 型 烟粉虱，寄 主植物，转换寄主，遗传 变异 ， in it an in of is as a a of is a of by by of of of of my is on of in In to or 005 006, to st at of at as as (1)A 8 of ( (2) st in 马铃薯 茄子 棉花 萝卜，白菜上面的烟粉虱的遗传多样性 较其它寄主种群的高，但是未对烟粉虱种群的寄主专化机制进行探讨； 张丽萍 (2004)采用 析了山西省晋南地区的 13 个寄主植物上的 B 型烟粉虱种群，聚类结果表明，不同寄主上的烟粉虱可分成两个类群，玉米上的烟粉虱种群为一群，其余为一群，两个类群间平均遗传距离为 明了玉米上的烟粉虱种群有趋于专化的可能性。 目前对 B 型烟粉虱的入侵机制、遗传分化等的研究还没有明确的结果。遗传差异决定入侵成功与否及入侵效应 ,是遗传特性与入侵生物学特征相互作用的结果。有关这方面的研究充满前景，但目前的研究并不令人满意。在定 殖与建立种群的过程中，遗传过程与生态过程哪一个更具相对的重要性，或者是两者间的相互作用？成功入侵如果受遗传变异的影响，遗传差异在多大程度上决定其入侵效应？地理区域、寄主植物、种群特性哪一个因素对遗传分化的影响更大？目前这些问题还不能得到确切的回答。对于遗传分化的研究是研究烟粉虱成功定殖、建立种群的关键问题，这方面有待深入研究。 究内容与方法 烟粉虱生物型的鉴定 温室人工饲养 B 型烟粉虱种群，原始寄主为甘蓝 (京丰一号 )，转换寄主分别为一品红(番茄 (中农 12 号 )、棉花 (保铃棉 黄瓜 (中杂 9 号 )，每个寄主种群用防虫网隔离饲养； 利用 记分析五个寄主植物上的种群的遗传多样性，确定不同寄主种群间和寄主种群内的遗传分化，初步揭示 B 型烟粉虱种群与不同寄主间的关系，为烟粉虱对不同寄主的适应性进化提供理论基础。 研究拟解决的问题 影响烟粉虱种群遗传结构的因素较多，如化学农药、寄主植物、栖息环境等，本文 拟 从寄主植物的角度来分析五种寄主对 B 型烟粉虱的遗传结构的影响，以揭示寄主植物在烟粉虱遗传进化中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 15 中的作用。 研究的创 新之处 首次采用微卫星标记分析温室内寄主植物对烟粉虱种群遗传结构的影响， 以期为入侵成灾机理的研究提供有利的帮助。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 16 术路线 （第一寄主） 向比较 纵向比较 (同一年份 ) (不同年份 ) 子鉴定 温室人工种群饲养 按不同年份取样 采用 提取单头烟粉虱的 外分光光度检测 质量和浓度 用具有多态性的 物进行分析 收集数据（记录多态性等位基因变异位点），计算种间和种内的遗传距离 不同寄主种群间的遗传分析 同种寄主种群间的遗传比较 甘蓝 寄主转换 一品红 黄 瓜 棉 花 番 茄 寄主种群内部的遗传分析 寄主种群内部的遗传分析 采集样本 形态学鉴定 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 利用 析寄主植物对 B 型烟粉虱种群遗传分化的影响 17 第二章 采用 记分析寄主 植物对 B 型烟粉虱 种群 遗传分化 的影响 烟粉虱 产于热带和亚热带地区，现已广泛分布于世界许多国家和地区。烟粉虱属多食性害虫，寄主范围很广。据 995)报道，其寄主植物达 74 科 500 余种。 (1985)研究发现 ， B 型烟粉虱在生菜、黄瓜、茄子、南瓜、花椰菜、胡萝卜、瓜尔豆和苜蓿等寄主植物上的体形、发育历期、存活率和生殖率等均存在明显差异；其它有关学者通过对不同寄主植物上 烟粉虱种群的生物学差异研究，也都得出了类似结果。这些研究结果表明 ， B 型烟粉虱存在着寄主种群间的遗传分化。 （ 1992）采用聚丙烯酰胺凝胶电泳比较了四种酶的图谱，结果表明只有 谱可区分与寄主相关的烟粉虱种群，认为 谱的差异反应了寄主范围的局限性 ； （ 1993）使用等电荷聚焦法分析了异构酶在构成 14 种酶的 18 个位点中的变异性，并报道 有 6 个位点是多态的； （ 1989）则报道 ， 位基因表现出的明显的异质性与寄主植物和地理分布均无关系，而与来自杀虫剂及喷药处理的种 群有关。在分子水平上，目前国内外对于不同地区、不同寄主上的烟粉虱种群的遗传分化及生物型，已有许多研究报道。张丽萍等（ 2005）应用 子标记方法对采自山西省同一地区的不同寄主上的 B 型烟粉虱种群进行遗传分化的研究，将不同寄主上的烟粉虱分为两个类群，玉米上的烟粉虱聚为一类，其余为一类，这就初步表明了 B 型烟粉虱有存在寄主专化的可能性。 本文应用微卫星标记 子标记方法，首次对温室内人工饲养的烟粉虱种 群间和种群内的遗传变异进行了研究，旨在深入探讨 地理区域、寄主植物和种群特性三因素中哪一个因素对烟粉虱种群遗 传分化起决定性作用， 为其爆发成灾、入侵机理研究提供理论依据。 材料和方法 试验材料 来源：供试虫源采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所南口温室大棚的甘蓝上，采集时间为2004 年 11 月份，取部分供试种群的烟粉虱个体进行 定，均为 B 型烟粉虱。 试验中所用的寄主品种：甘蓝（京丰一号）；黄瓜（中农 12 号）；番茄（中杂 9 号）；棉花（保铃棉 一品红。 寄主转换：供试虫源在甘蓝上饲养一定阶段以后，从甘蓝叶片上采虫分别接种于其它四个寄主，黄瓜，番茄，棉花和一品红。 温室环境条件 保持恒定 （ L： D 12： 12； 25左右），采样时间分别是 2005 年和 2006年的 10 月 12 月间，采集的 B 型烟粉虱成虫经目视镜检测后选取雌性个体，每个寄主种群取样数为 30 48 头， 70%酒精保存，置于 箱中。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 利用 析寄主植物对 B 型烟粉虱种群遗传分化的影响 18 取 分子标记实验中所用的模板均为单头烟粉虱 提取方法参考 卢圣栋（ 2002） 和 安瑞生等（ 2002） 的实验步骤并作进一步的改进，提取流程如下： （ 1） 心管加入单头烟粉虱和 20解液（ 1%10255白酶 K【 ，用封口枪头捣碎，再加入 80解液冲洗枪头； （ 2） 65热浴 30 45 分钟； （ 3）待冷却后每管加入 1 酶溶液 (置于 37水浴下半小时左右； （ 4）将离心管取出，待冷却至室温后加入等体积的乙酸钠（ 然后冰浴至少半小时以上； （ 5）取出后，在常温下 12000心 10 分钟； （ 6）吸取上清夜并转移至新的 心管，每管加入等体积的异丙醇，然后置于 小时以上； （ 7）取出后室温 下 13000心 10 分钟； （ 8）到掉上清夜，加入 70%的乙醇，然后 12000心 3 分钟，重复两次，再用无水乙醇洗涤，将 淀置于通风厨自然中干燥，加入 15解； （ 9） 55温浴 10 分钟以上，以促进 溶解，取出后 存备用。 烟粉虱生物型的鉴定 利用 记对供试虫源进行生物型的鉴定，以确定为 B 型烟粉虱种群， 子标记体系中的引物为 晨， 2002），由上海生工合成，以 B 型烟粉虱 模板的 增产物大小为 620右。 5： 5反应扩增程序 （ et 1994） 为： 94预变性 5后进行 35 个如下循环： 94变性 150退后 172延伸 1环结束后 72延伸 5应产物 物于 1%琼脂糖凝胶电泳分离， 色后在紫外透视仪上观察并记录结果。反应体系为： 10 .5 25 2.5 ul .5 2.5 150ng/1.0 2819 (50ng/1.0 5U/ 0.2 1 ul 0 国农业科学院硕士学位论文 第二章 利用 析寄主植物对 B 型烟粉虱种群遗传分化的影响 19 微卫星引物的筛选 微卫星引物的筛选：从目前已知的 25 对引物中（ et 2003； 003 ）筛选出 6 对， 物由上海生工合成。 表 2筛选出的 6 对烟粉虱微卫星引物 6 of 物编号 序号位点引物 (5-3: 增 在 进行 增，扩增体系如表 2 表 2应体系 CR SR 应组分 反应体积 0 10 2(25 2U/ 2 2ul 变性聚丙稀凝胶电泳 (（ 1）电泳程序 以 断为分子量标准，在 丙烯酰胺凝胶 (电泳检测扩增产物，中国农业科学院硕士学位论文 第二章 利用 析寄主植物对 B 型烟粉虱种群遗传分化的影响 20 银染后观察结果。电泳过程参考 1998)进行，根据试验条件做出一定的改动。 仪器： T 电泳系统 （ 胶型： 38304胶： 丙烯酰胺变性凝胶 具体过程如下： 用洗涤灵和自来水将玻璃板冲洗干净，再分别用蒸馏水和 95%酒精各擦洗两遍，自然干燥。然后在玻璃板上均匀 涂抹 5%乙醇， 5ul 5 在主板上涂抹一层 2 干，操作过程中防止两块玻璃板相互污染。 待玻璃板干燥后组装电泳槽，水平仪检测。 胶的配制 称取尿素加少量 力加热（ 0， 棉花（ 一品红（ 黄瓜（ 0，这也在一定程度上反应了不同寄主种群内部的遗传分化的趋势。通过比较表 2 8a 和表 2 12 的不同种群间 （表 2 13）表明， 2006 年各个种群间的遗传分化程度除了棉花种群与甘蓝种群、一品红种群、番茄种群之间有所降低外，其它种群间的遗传分化程度显著地高于 2005 年；其中黄瓜种群与第一寄主（甘蓝）种群间的遗传分化程度大于其它选择寄主与甘蓝种群间的遗传分化。表 2 14 说明寄主种群内部也存在明显的遗传分化（ F0， 棉花种群（ 一品红（ 黄瓜（ 而且番茄种群内部的 大于番茄种群与其它四个种群的 ，但是种群内部的分化整体上远远低于种间的遗传分化。 表 2 13 不同亚种群间遗传距离和遗传相似度的比较 种群 遗传 遗传 无偏估计 距离 相似度 1-1 1 -1 2 -1 2 -1 3 -1 3 -1 4 -1 4 -1 5 -1 5 -2 2 -2 2 -2 3 -2 3 -2 4 -2 4 -2 5 -2 5 -1 2 -1 3 -1 3 -1 4 国农业科学院硕士学位论文 第二章 利用 析寄主植物对 B 型烟粉虱种群遗传分化的影响 32 2-1 4 -1 5 -1 5 -2 3 -2 3 -2 4 -2 4 -2 5 -2 5 -1 3 -1 4 -1 4 -1 5 -1 5 -2 4 -2 4 -2 5 -2 5 -1 4 -1 5 -1 5 -2 5 -2 5 -1 5 ： 1 1别为甘蓝种群的两个亚种群； 2 2别为一品红种群的两个亚种群； 3 3别为番茄种群的两个亚种群； 4 4别为黄瓜种群的两个亚种群； 5 5别为棉花种群的两个亚种群。 表 2 14 不同时间的寄主种群的 比较 st in 主 _寄主 2005） 2006） 甘蓝 _一品红 蓝 _番茄 蓝 _黄瓜 蓝 _棉花 一品红 _番茄 品红 _黄瓜 品红 _棉花 番茄 _黄瓜 茄 _棉花 黄瓜 _棉花 代表种群间的遗传分化度有所降低 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 利用 析寄主植物对 B 型烟粉虱种群遗传分化的影响 33 表 2 15 寄主间和寄主内所有样本的 st 1 2 2 3 3 4 4 5 5 S 注： *代表同种寄主种群内部的 ， P代表种群间关系不显著。 注：该表的数值是以两年共用的四对引物 （ 得出的。 （ 2） 位点间的连锁分析 采用软件 不同时间的烟粉虱种群进行基因型连锁不平衡检测，在 5 个种群中，六个位点之间互相组合， 2005年饲养的寄主种群在 点之间存在连锁不平衡，而在其它位点间存在连锁平衡（表 2 16a 和表 2 16b）。 005 (s 10 10 10 10 10 10 006 (s 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 国农业科学院硕士学位论文 第二章 利用 析寄主植物对 B 型烟粉虱种群遗传分化的影响 34 （ 3） 不同年份的杂合度和多态信息含量的比较 通过比较不同时间寄主种群的杂合度和多态信息含量等发现，寄主种群内部的遗传分化较大，从表 2 17 可以看出，饲养两年以后的 5 个烟粉虱种群的杂合度 （ 和多态信息含量 （ 著 高于第一年的 5 个寄主种群，相应的近交系数 （ 随时间的增加而下降 ，表明寄主种群内部个体间的近交繁殖程度有所下降。，另外从表 2 15 中的 也可以看出这种趋势。 表 2 17 不同年份的遗传参数比较 of in 2005/2006) 005/2006) 005/2006) 甘蓝 品红 茄 瓜 花 ：数据取自表 2表 2有表中的标准差略去。 主种群内的遗传相似性检测 根据烟粉虱个体间等位基因型的差异，采用 件和 不同年份 的寄主种群内的遗传相似性进行分析， 2005 年各个寄主种群内部的遗传相似系数分别为 蓝），品红）， 茄）， 花）， 瓜）（附表 1附表 5，其中不包括无扩增条带的个体以及基因型相同的个体，它们之间的遗传相似度为 0 和 1），表明 同一寄主烟粉虱种群内部的遗传相似性较低，存在显著的遗传分化； 2006 年各个寄主种群内部的遗传相似系数分别为 0.99（甘蓝）， 品红 ）， 茄），花）， 瓜）（附表 5附表 10），表明同一寄主内部的遗传相似性仍然较低，遗传变异较为明显。从不同年份对同一寄主种群内部的遗传相似性进行比较， 2006 年的各个寄主种群内部的遗传相似度总体上略高于相对应的 2005 年的数值，如 2006 年甘蓝种群内部的遗传相似系数较 2005 年有一定的增长，表明了种群内部的变异度有略微降低，但是这一点并不影响种群内部遗传变异的积累。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结论和讨论 35 第三章 结论和 讨论 要 结论 本实验成功地利用了微 卫星标记对温室内饲养种群的遗传分化进行了初步研究。结果表明了寄主植物是影响烟粉虱种群遗传结构的一个重要因素，温室内的 5 个寄主上的烟粉虱种群都表现出不同程度的遗传分化。 传位点的变异性 每对引物检测出的等位基因数为 2，平均每个位点 ，其中 测到的最多为9 条， 测到的等位基因最少为 2 条。 从位点上的基因型组合来看， 增得到的基因型组合最多，遗传多样度和多态信息含量都高于其它位点，但是该位点的遗传变异度较低 （ 。对不同时间点的遗 传多样性参数的分析表明， 2006 年五种寄主种群的杂合度（ 、多态信息含量 （ 和遗传多样度均大于 2005 年的数值，表明饲养两年以后的寄主种群的遗传变异高于第一年饲养的种群。位点连锁分析表明，除了 2005 年的寄主种群在 点间存在连锁不平衡外，其余位点间均存在连锁平衡。 个寄主种群间的遗传变异程度 2005 年，利用 4 对 物对 5 个寄主种群共 162 个烟粉虱样本进行遗传变异分析，结果发现所有位点上均有遗传分化的发生 （ ,甘蓝种群（ 棉花（ 一品红（ 黄瓜（ 0，呈现出与种群内部 一致的趋势。但是，种群内部的遗传分化仍然不及种群间的分化程度。再通过分析 2005 年和 2006 年的不同寄主种群内的遗传相似系数表明，各个寄主种群内部的遗传相似系数较低， 2006 年的寄主种群内部的遗传相似系数略高于 2005 年的数值，表明了 2006 年种群内部的遗传 变异度有略微降低。 类分析比较 从不同年份及总的聚类结果来看，甘蓝种群和番茄种群始终聚在一起，表明这两个种群之间的遗传相似度较高，而其它三个寄主种群的聚类关系不是很明确，在第一年时黄瓜种群种棉花种群聚为一群，而到第二年，黄瓜种群却与一品红种群聚为一群，这表明了各个种群间的遗传变异不仅与寄主相关，时间的累积也有一定的影响。此外，考虑到第一年只用了四对引物进行聚类分析，对第二年的寄主植物也用共有的四对引物进行分析，得出的聚类结果与采用六对引物分析时得出的相一致。 论 响寄主 遗传分化的可能性因子分析 本研究采用对寄主种群的遗传结构分析表明，种间和种内分化都比较明显，前者的分化程度整体上高于后者。但是，种间分化在各个寄主间表现得不一致，有的分化得较快，如一品红种群、黄瓜种群与甘蓝种群间的遗传分化随时间的推移而增大，而棉花种群与甘蓝种群间的遗传分化却表现为降低的趋势。五个寄主种群内部的遗传分化也有差异，其中番茄种群内部的遗传分化大于番茄种群与其它四个寄主种群间的遗传分化。造成这些现象的可能是：（ 1）在基因漂流基本没有的情况下受选择压力的影响，包括同型交配和歧化选择等，如交配前后的生 殖隔离；（ 2）受寄主的影响，其中一部分可以归纳为歧化选择的作用，如寄主植物的形态、营养以及交配场所的提供等。此外，还需要从生态、生物学等方面进一步说明 B 型烟粉虱种群内部分化的多样性。 异性位点对寄主种群遗传分化的影响 本研究选用的 6 对微卫星引物的多态性较好，尤其是 是在第二年才筛选出 对引物对 5 个寄主种群进行扩增，扩增的结果显示出这两个位点上存在着显著的遗传分化，但是 较小，表明在该位点上的遗传分化程度较 低。 间的连锁不平衡现象出现在饲养初期，而其它位点间均为连锁平衡，中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结论和讨论 37 可能原因是饲养初期种群个体间的近亲交配所导致的连锁不平衡，而且在小规模种群中更容易出现连锁不平衡现象（ 999）。 986)和 1998） 认为仅有少数几个位点在短时间内参与了物种的同域种化，而不像地理隔离种群的遗传分化需要一个很长的过程，而且包含了许多位点的变异。在以往对昆虫寄主专化型研究的实例中，研究人员较多采用同工酶电泳分析寄主 种群的遗传分化，但是发生变异的位点数很少，如 et (2003)采用六对同工酶引物对欧洲玉米螟（ 主专化研究时发现，寄主种群的遗传分化只体现在其中的四个位点上； et (2002) 使用 10 对同工酶引物对象甲 (进行