【毕业学位论文】（Word原稿）鸡马立克氏病病毒细菌人工染色体的构建预防兽医学硕士论文

鸡马立克氏病病毒细菌人工染色体的构建 s 14 as an s 14 as an 摘 要 鸡马立克氏病（ s 危害养鸡业的主要传染病之一。该病以 T 淋巴细胞增生 性肿瘤 、高度接触性传染以及造成鸡的严重免疫抑制为特征，其病原为鸡马立克氏病病毒（ s 该病毒属疱疹病毒科 毒，基因组大约 180据抗原性不同，马立克氏病病毒（ 分为 3 种血清型，血清 1 型包括所有致瘤的马立克氏病病毒，含强毒及其致弱的变异毒株；而血清 2 型包括所有不致瘤的马立克氏病病毒；血清 3 型包括所有的火鸡疱疹病毒（ of 其变异毒株。 由于 严格的细胞结合病毒， 对 因组进行基因操作和研究十分困难，近几年细菌人工染色体技术的出现解决了这一难题，首先构建 菌人工染色体（ 然后利用分子克隆化病毒 粒转染哺乳动物细胞，启动病毒感染，产生纯系重组病毒。 子克隆化病毒服从大肠杆菌基因操作技术，在大肠杆菌中可以对其进行 方便的基因操作和研究。尤其是利用近几年来发展起来的现代 隆技术 T 技术，它可以在细菌中对病毒基因组实施快速有效的各种修饰（删除、插入和点突变），甚至对病毒基因组的必需基因进行有效的突变。 本研究的目的是构建鸡马立克氏病病毒 814株 全基因组感染性分子克隆化病毒 细菌人工染色体，建立鸡马立克氏病病毒的反向遗传操作技术平台。首先利用自主构建的表达 哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记（ 带有细菌人工染色体（ 本基因功能序列（ 功构建了鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体 用脂质体转染技术，将转移载体与马立克氏病病毒感染胞的总 转染鸡胚成纤维细胞， 启动病毒感染后， 在选择培养基的遗传选择加压条件下，经八轮筛选、富集并完全纯化了重组病毒；适时提取环化重组病毒感染 胞的总 转化大肠杆菌 取阳性克隆经酶切图谱、凝胶电泳和 定 子克隆化病毒，经鉴定获得了 38 个 子克隆化病毒，并且用编号为 克隆提取纯化的染次代 胞，再次启动了病毒感染，产生了 异性病毒蚀斑，拯救出了重组病毒；进一步研究表明重组病毒 生病毒 拯救的重组病毒种病毒在体外鸡胚成纤维细胞上的生物学特性相似；进一步的动物实验研究表明 14、 14、 菌 疫鸡部分能够抵抗 强毒的攻击 ，表明 苗具有作为预防 鸡马立克氏病新型疫苗进行开发的潜力。本研究为进一步研究鸡马立克氏病病毒的致瘤机制、潜伏机制和基因功能提供了很好遗传操作技术平台，同时也为以马立克氏病病毒毒细菌人工染色体为基础的新型基因工程疫苗的开发和应用提供了强大的技术平台。 关键词： 马立克氏病病毒；细菌人工染色体；分子克隆化病毒；感染性分子克隆 s is a of of is a in of D. It is DV is a a of is on of as a is as a be by . is T of of of of of to s (814 as an In AC a 000, in to It to of in an s s in -1 NA to D. in a of in be In it be to a s 目 录 第一章 绪论 . 1 究简述 . 1 . 1 分类 . 2 病原学特征 . 3 基因和蛋 白 . 5 增殖与感染 . 7 疫苗防控策略 . 8 菌人工染色体技术研究进展 . 9 体系统简述 . 9 子克隆化病毒 . 10 细菌人工染色体的修饰技术 . 11 研究的目的和意义 . 14 第二章 细菌人工染色体重组病毒转移载体的构建 . 15 料 . 15 质粒、菌种、病毒与试剂 . 15 主要仪器 . 15 法 . 16 细菌人工染色体重组病毒转移载体的设计及技术路线 . 16 体基本功能基因序列制备 . 18 表达 正选择标记基因的构建 . 20 转移载体 构建 . 20 果 . 21 体基本功能基因序列制备 . 21 表达 正选择标记基因的鉴定 . 24 组病毒转移载体 鉴定 . 25 论 . 26 制备 体基本功能基因序列 . 26 表达 正选择标记基因 . 27 细菌人工染色体重组病毒转移载体的核心序列 . 28 第三章 细菌人工染色体重组马立克氏病病毒的构建 . 30 料 . 30 菌种、细胞、病毒与试剂 . 30 主要仪器 . 30 法 . 31 电转化转移载体质粒 宿主菌 . 31 转移载体质粒的提取和纯化 . 32 转染用 染细胞总 制备 . 32 转移载体质粒与 共转染 . 32 重组病毒 初步筛选和富集 . 33 重组病毒 纯化 . 34 重组病毒 鉴定 . 34 果 . 35 转移载体质粒的电转化、保种、纯化及纯度测定 . 35 转移载体质粒与 共转染启动病毒感染 . 35 重组病毒 筛选和纯化 . 36 重组病毒 鉴定结果 . 37 论 . 38 第四章 感染性 子克隆化病毒的筛选 . 41 料 . 41 菌种、细胞、病毒与试剂 . 41 主要仪器 . 41 法 . 42 构建感染性 子克隆化病毒的技术路线 . 42 电转化分子克隆化病毒感受态细菌 制备 . 43 环化重组病毒细胞总 提取 . 43 电转化筛选 化子 . 43 化子的初步鉴定 . 44 子克隆化病毒克隆质粒的提取和纯化 . 44 限制性内切酶酶切图谱分析 . 44 子克隆化病毒的外源目的插入片段的 定 . 45 子克隆化病毒中病毒基因组的 定 . 45 染用 提取和纯化 . 47 体总 制备 . 48 染 . 48 重组病毒 . 48 救 重组病毒 鉴定 . 49 组病毒、野生病毒与拯救的重组病毒在体外生长特性的比较 . 49 果 . 49 电转化筛选 化子 . 49 限制性内切酶酶切图谱分析结果 . 50 子克隆化病毒的外源目的插入片段的 定结果 . 51 子克隆化病毒的病毒基因组的 定结果 . 51 浓度和纯度 . 52 拯救的重组病毒 . 53 重组病毒 生病毒 拯救的重组病毒 病毒蚀斑的形态比较 . 53 重组病毒 生病毒 拯救的重组病 毒 病毒生长曲线的比较 . 54 论 . 54 第五章 疫效力初步试验 . 58 料 . 58 病毒、菌种与试剂 . 58 主要仪器 . 58 法 . 58 动物实验设计 . 58 毒株的复壮 . 60 各种 疫制剂的制备 . 60 验结果 . 61 各实验组鸡只存活率及攻毒死亡变化 . 61 各实验组鸡 只 病情况 . 62 论 . 63 第六章 全文结论 . 65 参考文献 . 66 致 谢 . 错误 !未定义书签。 作者简历 . 错误 !未定义书签。 图表清单 图 1因组结构简图 . 1基因组线性物理图谱 . 1T 同源重组的应用 . 1感染性鸡马立克氏病病毒的细菌人工染色体的构建与修饰 . 2. 2 案 示意图 . 2 线 示意图 . 2. 2. 2质粒 凝胶电泳分析 . 2列的物理图谱 . 2质粒 物理图谱 . 2质粒 . 2粒 定图 . 2粒 . 2粒 . 2粒 定图 . 2 . 3通过转移载体将细菌人工染色体核心序列重组到 毒基因组示意图 . 3转移载体质粒与 . 3重组病毒 . 3重组病毒 . 4子克隆化 病毒 的构建 技术 路线 示意图 42 图 4通凝胶电泳分析 . 4部分限制性内切酶 酶切图谱分析 . 4. 4. 414, 14 和 14 体外病变蚀斑形态的比较 . 4野生病毒、重组病毒和拯救重组病毒省长曲线的比较 . 5动物实验方案以及动物实验的过程 5各实验组鸡只存活情况 . 61 图 5各实验组鸡只攻毒死亡变化曲线 5各实验组鸡只 病情况 5动物实验中 . 1真核基因组克隆载体及其特点