第五章 沉淀法

第五章沉淀法 precipitation 生化分离过程的一般流程 概述 定义 目的 分类 特点 蛋白质的溶解特性蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质沉淀方法 5 1概论 定义 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程 沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数 控制溶液的各种成分的溶解度 从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法 但目前仍广泛应用在工业上和实验室中 目的 采用沉淀的手段 主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的 或者通过沉淀 固液分相后 除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分 其次 沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态 加以保存或进一步处理 沉淀方法用于分离纯化是有选择性的 即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分 操作方式可分连续法或间歇法两种 规模较小时 常采用间歇法 不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行 沉淀法操步骤 首先加入沉淀剂 沉淀剂的陈化 当沉淀完全析出后 让初生的沉淀与母液一起放置一段时间的过程称为陈化 促进粒子生长 为离心或过滤 收集沉淀物 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度 收率和沉淀物的形状都有很大影响 沉淀法分离蛋白质的特点 在生产的前期就可便原料液体积很快地减小10 50倍 从而简化生产工艺 降低生产费用 使中间产物保持在一个中性温和的环境 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中分离出来 避免蛋白质的降解 提高产物稳定性 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术 可使色谱分离使用的限制因素降低到最少 5 2蛋白质的溶解特性 蛋白质的溶解行为是一个独特的性质 由其组成 构象以及分子周围的环境所决定 蛋白质在自然环境中通常是可溶的 所以其大部分是亲水的 但其内部大部分是疏水的 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域 温度pH介电常数离子强度 蛋白质也可用改变其结构的办法来使其不可溶 改变的方法是使埋藏在分子内部的疏水基团暴露出来 但这种分子结构的改变是不可逆转的 会引起蛋白质的变性 当溶液中蛋白质超过了溶解度时 液相中的蛋白质分子处于过饱和状态 在这种环境下 蛋白质分子不再全部溶剂化 在其相互作用下沉淀逐渐增多并凝聚在一起以保持一个稳定的构型 这是一个排斥溶剂分子的过程 可以恢复到原来的溶剂化形式 5 3蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质可以看作是一个表面分布有正 负电荷的球体 这种正 负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的 换句话说 该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒 因此 蛋白质的沉淀 实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似 静电斥力 吸引力 蛋白质粒子在水溶液中是带电的 带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离 因溶液是电中性的 水中应有等当量的反离子存在 蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层 处在溶液中的带电固体表面 主要由于静电吸引力的存在 必然要吸引等电量的异电离子 或反离子 环绕在固体周围 这样便在固液两相之间形成双电层 静电斥力 电位认为它是控制胶粒间电排斥作用的电位 它取决于Nernst电位和反离子的浓度及电荷大小 即随着溶液中离子浓度和价数的升高 电位下降 从而使颗粒间斥力强度减小 溶液趋于不稳定 蛋白质也就会沉淀下来 电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来 电势的大小反映了胶粒带电的程度 其值越高表明胶粒带电越多 扩散层越厚 吸引力 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度 VanderWaals范德华力Keeson引力 偶极力 Debye引力 诱导力 London引力 色散力 是最重要的一种引力 因为所有分子都是可以被极化的 所以它是普遍存在的 DLVO理论 Derjagin Landau Verwey Overbeek 目前对胶体稳定性解释得比较完善的理论 该理论以溶胶粒子间的相互吸引力和相互排斥力为基础 认为当粒子相互接近时 这两种相反的作用力决定了溶胶的稳定性 溶胶粒子间的相互吸引力是范德华力 主要为色散力 胶粒中含有大量分子 所以胶粒间的引力是各分子所贡献的总和 这种引力与距离的三次方成反比 是一种远程作用力 溶胶粒子间的排斥是由于带电胶粒所具有的相同电荷之间的斥力 其大小取决于粒子电荷数目和相互距离 溶胶的稳定性取决于胶粒间吸引能和排斥能的总效应 当粒子相互靠近时 如果粒子间的引力大于粒子间的排斥力 则溶胶发生聚沉 是不稳定的 反之 溶胶是稳定的 当粒子相互聚集在一起时 必须克服一定的活化能势垒 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 蛋白质周围的水化层 hydrationshell 可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液 蛋白质分子间静电排斥作用 存在双电层 因此 可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度 电位 降低蛋白质溶液的稳定性 实现蛋白质的沉淀 5 4蛋白质沉淀方法 根据所加入的沉淀剂的不同 沉淀法可以分为 中性盐盐析法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 高价金属离子沉淀法上述各种方法中 除第 3 种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外 其他各种方法只适用蛋白质等大分子 故以下的讨论均限于蛋白质 中性盐盐析法 是最古老的分离和纯化目的物的方法 但目前仍广泛应用在工业上和实验室中 由于其浓缩作用常大于纯化作用 因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法 用于从去除了菌体和细胞碎片的发酵液中沉淀出目的物 然后再利用色谱分离等方法进一步提高其纯度 蛋白质和酶均易溶于水 因为该分子的 COOH NH2和 OH都是亲水基团 这些基团与极性水分子相互作用形成水化层 包围于蛋白质分子周围形成1nm 100nm颗粒的亲水胶体 水化层越厚 蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大 因而溶解度也越大 亲水胶体在水中的稳定因素有两个 即电荷和水膜 在蛋白质溶液中加入中性盐后会降低压缩双电层 降低 电位 即中性盐夺走了水分子 破坏了水膜 暴露出疏水区域 同时又中和了电荷 破坏了亲水胶体 蛋白质分子即形成沉淀 中性盐沉淀蛋白质的基本原理 蛋白质盐析 蛋白质盐析行为 Cohnx经验公式 S 蛋白质的溶解度 g L 一离子强度等于I 1 2 miZi2 mi 离子i的摩尔浓度 Zi 所带电荷 常数 与盐的种类无关 但与温度 pH和蛋白质种类有关 Ks 盐析常数 与温度和pH无关 但与蛋白质和盐的种类有关 盐析法分为两类 Ks分级盐析法 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感 易产生共沉淀现象 在一定pH和温度下通过改变离子强度实现 用于早期的粗提液 分级盐析法 由于溶质溶解度变化缓慢 且变化幅度小 因此分辨率更高 在一定离子强度下通过改变pH和温度来实现 用于后期进一步分离纯化和结晶 盐析操作 加盐方式 采用硫酸铵进行盐析时可按二种方式加入 直接加入固体 NH4 2SO4粉末 工业上常采用这种方法 加入速度不能太快 应分批加入 并充分搅拌 使其完全溶解和防止局部浓度过高 X S1及S2 初始和最终溶液的饱和度 X 1L溶液所需加入得固体硫酸铵的克数 G 为饱和溶液中的盐含量 0 时为515 20 为513 A常数 0 时为0 27 20 为0 29 G S2 S1 1 AS2 直接加入固体 NH4 2SO4粉末 实验室 将其研成细粉 在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入 接近计划饱和度时 加盐的速度更要慢一些 尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀 盐析后要在冰浴中放置一段时间 待沉淀完全后再离心与过滤 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离 高浓度硫酸铵常用过滤方法 是加入硫酸铵饱和溶液 在实验室和小规模生产中 或 NH4 2SO4浓度不需太高时 可采用这种方式 它可防止溶液局部过浓 但加量较多时 料液会被稀释 若使用饱和溶液 则加入的体积用下式计算 Y 式中Y为1L溶液中 使盐浓度从S1变为S2时所需加入的饱和溶液体积 1000 S2 S1 1 S2 蛋白质量 mg 或酶活力102030405060708090100硫铵饱和度 盐析曲线的制作如果要分离一种新的蛋白质和酶 没有文献数据可以借鉴 则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度 具体操作方法如下 脱盐 最常用的脱盐方法是透析法 把蛋白质溶液装入透析袋中 袋的二端用线扎紧 然后用蒸馏水或缓冲液进行透析 这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中 蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内 通过不断更换蒸馏水或缓冲液 直至袋内盐分透析完毕 透析需要较长时间 常在低温下进行 并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染 盐析的影响因素 蛋白质的浓度 高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀 若蛋白质浓度过高 易产生各种蛋白质的共沉淀作用 低浓度的蛋白质 共沉淀作用小 但回收率降低 较适中的蛋白质浓度是25 30mg mL 温度的影响 在高离子强度溶液中 温度升高 它们的溶解度反而减小 在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的 一般情况下 可在室温下进行 但对于某些对温度敏感的酶 要求在0 4 下操作 以避免活力丧失 pH值对盐析的影响 在等电点处溶解度小 pH值常选在该蛋白质的等电点附近 典型的硫酸铵盐析过程最适饱和度是30 55 上清液浓度 阴阳离子盐析效果 阴离子盐析效果 柠檬酸 PO43 SO42 CH3COO Cl NO3 SCN 阳离子盐析效果 NH4 K Na 高价阳离子硫酸铵 1 价廉 2 溶解度大 稳定蛋白质 3 残留产品有影响 盐析注意事项 1 稳定pH用磷酸缓冲液 2 硫酸铵加入后体积变大 3 选择饱和度 4 分步盐析 5 初始蛋白浓度 利用蛋白质在pH等于等电点的溶液中溶解度下降的原理 进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀 本法适用于疏水性较强的蛋白质 例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物 但对一些亲水性强的蛋白质 如明胶 则在低离子强度的溶液中 调pH在等电点并不产生沉淀 等电点沉淀法 等电点沉淀法 原理 当电解质浓度增大时 介质中反离子的浓度加大而更多地进入滑动面内 使扩散层变薄 电势在数值上变小 当电解质的浓度足够大时 可使 电势为零 此时的状态称为等电点 处于等电点的粒子是不带电的 电泳 电渗的速度也必然为零 溶胶非常易于聚沉 蛋白质是两性电解质 当溶液pH值处于等电点时 分子表面净电荷为0 双电层和水化膜结构被破坏 由于分子间引力 形成蛋白质聚集体 进而产生沉淀 在调节等电点时 如果采用盐酸 氢氧化钠等强酸强碱 要注意防止酶的失活或蛋白变性 为了使pH缓慢变动 也可用乙酸 碳酸和碳酸钠 有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀法 酶 蛋白质 核酸 多糖类生化物质的水溶液中加入乙醇 丙酮 甲醇和乙腈等水溶性的有机溶剂 它们的溶解度会显著降低 从溶液中沉淀出来 优点 溶剂容易蒸发除去 不会残留在成品中 因此适用于制备食品级以上的蛋白质 而且有机溶剂密度低 与沉淀物密度差大 便于离心分离 缺点是容易使蛋白质变性失活 且有机溶剂易燃 易爆 安全要求较高 原理 加入有机溶剂使溶液的介电常数减小 增加了酶 蛋白质 核酸等带电粒子之间的作用力 因相互吸引而聚合沉淀 有机溶剂会降低蛋白质分子的溶剂化能力 破坏蛋白质的水化层 使蛋白质沉淀 有机溶剂的加入也使水的极性减小 使两性电解质在溶液中的溶解度降低 常用的有机溶剂沉淀剂 乙醇 沉析作用强 挥发性适中 无毒常用于蛋白质 核酸 多糖等生物大分子的沉析 丙酮 沉析作用更强 用量省 但毒性大 应用范围不广 使用有机溶剂沉淀时 操作必须在低温下进行 以减少蛋白质的变性 所用的有机溶剂须预先冷却到 10 20 有机溶剂要缓缓加入 防止溶液局部升温 中性盐会增加蛋白质在有机溶液中的溶解度 溶液中的中性盐浓度越高 沉淀蛋白质所需要的有机溶剂浓度也越大 有机溶剂沉淀法 影响有机溶剂沉淀的主要因素 温度 低温有利于防止溶质变性 有利于提高收率 溶解度下降 搅拌速度 散热溶液pH值 原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷 防止共沉现象 pI 离子强度 离子强度低有利于沉析 0 01 0 05mol L样品浓度 0 5mg ml 2mg ml稀 溶剂用量大 回收率低 但共沉淀作用小浓 节省溶剂用量 共沉作用强 分辨率低金属离子的助沉析作用 Zn2 Ca2 当用丙酮作为沉淀剂时有下列关系式 所需加入的丙酮量 v v 1 8 0 12ln 蛋白质的分子量 将C1 v v 的溶液 加入溶剂 使其达到C2 所需加入溶剂的ml数可按下式计算 体积 ml 1000 C2 C1 100 C2 非离子型聚合物 最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒 近年来广泛用于核酸和酶的纯化 其中应用最多的是聚乙二醇 PolyethyleneGlycol简写为PEG 它的亲水性强 溶干水和许多有机溶剂 对热稳定 有广泛围的分子量 在生物大分子制备中 用的较多的是分子量为6000 20000的PEG PEG沉淀作用的机理 是基于体积不相容性 即PEG分子从溶剂中空间排斥蛋白质 这种相互作用是FEG的空间排斥作用 使蛋白质浓度增加而产生的 优先水合作用的程度取决于所用PEG的分子大小和浓度 排斥体积与PEG分子大小的平方根有关 这些因素与被分离的蛋白质无关 但在蛋白质溶解度上的差别取决于蛋白质分子的相对大小和蛋白质一蛋白质分子间的相互作用 优点 操作条件温和 不易引起生物大分子变性 产物收集比较容易 沉淀效能高 使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子 缺点 沉淀后有机聚合物很难去除 需要超滤和萃取来处理 PEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关 PEG的分子量需大于4000 最常用的是6000和20000 所用的PEG浓度通常为20 浓度再高 会使粘度增大 造成沉淀的回收比较困难 PEG对后继分离步骤 影响较少因此可以不必除去 同时还受离子强度 溶液pH和温度等因素的影响 在一定的pH值下 盐浓度越高 所需PEG时浓度越低 溶液的pH越接近目的物的等电点 沉淀所需PEG的浓度越低 在一定范围内 高分子量和浓度高的PEG沉淀的效率高 聚电解质沉淀 聚电解质沉淀 聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物 可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸 聚乙烯亚胺 羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等 有一些离子型多糖化合物应用于沉淀食品蛋白质 用得较多的是酸性多糖 如羧甲基纤维素 海藻酸盐 果胶酸盐和卡拉胶等 机理 电荷中和作用和聚合物架桥机理 聚丙烯酸 pH2 8 90 蛋白沉淀 聚苯乙烯季胺盐 pH10 4 95 蛋白沉淀 金属离子沉淀 金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年 当时已观察到了金属离子对蛋白质溶解度的影响 但是 真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的 机理 金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的 例如锌易与组氨酸残基中咪唑基结合 使蛋白质的等电点转移 从而降低蛋白质的溶解度 近年来对于金属离子沉淀蛋白质的概念有所扩大 这是因为有些蛋白质不能为游离的金