【毕业学位论文】（Word原稿）J亚群禽白血病病毒分离株变异分析及重组抗原ELISA检测方法的建立预防兽医学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 J 亚群禽白血病病毒分离株变异分析及重组抗原 测方法的建立 of ( of D. of ( of 录 中文摘要 英文摘要 引言 1 文献综述 3 1 禽白血病病毒研究进展 3 白血病病毒及其亚型分类 3 毒基因与囊膜基因受体 3 毒的致肿瘤能力 4 源性白血病病毒 5 2 J 亚群禽白血病研究进展 6 亚群禽白血病（ 历史回顾 6 7 7 7 毒蛋白及其抗原性 9 10 10 11 11 12 行病学研究 12 实与潜在危害 14 14 理学和血清学诊断技术 14 子诊断技术 15 15 3 本课题研究的目的和意义 17 研究报告 18 实验一 分离鉴定 18 1 材料与方法 18 2 结果 22 3 讨论 24 实验二 离株 膜基因的克隆及遗传变异分析 26 1 材料与方法 26 2 结果 29 3 讨论 33 实验三 离株 因的克隆和表达 43 1 材料与方法 43 2 结果 53 3 讨论 59 实验四 体间接 测方法的建立 63 1 材料与方法 63 2 结果 66 3 讨论 72 结论 76 参考文献 77 致谢 88 作者简介 89 中国农业科学院博士论文 摘 要 I J 亚群禽白血病病毒 分离 株 变异分析及重组 抗原 测方法的建立 摘 要 是由反转录病毒科 , 起的一种传染性致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病。 该病自20 世纪 80 年代末发现以来，以垂直和水平传播两种形式在世界各国肉 种鸡及商品肉用型鸡中广泛流行，引起肉 种鸡 死亡和 消瘦， 严重 生长发育不良， 发生机体免疫抑制，给世界各国养鸡业带来了极大的危害。近年来，世界各国均采取措施，通过 淘汰患病鸡 群，减少垂直传播从而达到 净化 种群的目的 ，而我国这方面的工作相对滞后。因此，在国内进行该病的流行病学研究、分离鉴定病毒株并进行其分子生物学特性研究、建立国内适用的血清学诊断方法对国内防制该病流行、开展种群净化具有重大意义。 本研究首先采用 因序列测定、细胞培养物 接种动物等方法从黑龙江省哈尔滨市以及吉林省某种鸡场送检的患病鸡体内，分离鉴定了两株 毒，分别命名为 。采用依据参照毒株 别构建了重组质粒 序列测定的基础上，对 果表明 推导的 基酸序列的同源率为 遗传变异分析结果表明 本研究根据原核表达载体 酶切图谱，设计了另一对特异性引物，克隆了 建了原核表达载体 转化大肠杆菌 获得高效表达。薄层扫描分析结果表明，表达产物占菌体总蛋白的 表达产物具有生物学反应活性，分子量约为 57后，本研究以纯化后的蛋白作为抗原建立了 过对 感性及对工作条件的优化试验，确定了反应的最佳程序。统计学分析 51 份阴性血清的检测结果，得出判定标准。相关试验结果表明，该诊断方法与鸡传染性法氏囊病等十余种禽类病毒性传染病的阳性血清无交叉反应，特异性好。 0 天即可监测到 有较好的敏感性。与国外试剂盒对比试验结果表明，两者具有较高的符合率。此外， 同一批次抗原的批内与批间重复性试验及不同批次抗原的重复性试验结果表明，该方法具有良好的重复性。现地应用试验结果表明，某现地养鸡场 3个鸡群 78只、 306只和 92只受检鸡的检测阳性率分别为 、 与国外9% 、 中国农业科学院博士论文 摘 要 之，本研究首次自东北地区分离鉴定了两株 过遗传变异分析，获取了国内东北地区 功地表达了 以其为抗原，建立了J 亚群禽白血病抗体 测方法，为国内各养鸡场有效开展 J 亚群禽白血病血清学调查、种群净化提供了有效的技术手段，同时为开展国际间 关键词： 传变异分析， 中国农业科学院博士论文 of ( of is a of in by a ( in 980s a by is to in in in to by by of of In of in EF CR EF by a of to of by of of on of D3 57of of by a on to , of on no 0 国农业科学院博士论文 V be 0 5 80 a , 9%、 In by as We in in . 国农业科学院博士论文 引 言 1 第一部分 绪论 引 言 亚群禽白血病病毒 (起的一类禽类传染性肿瘤疾病，病原属于反转录病毒，由 个基因编码， 病毒的 因与其它亚群病毒不同，而与一种内源性病毒同源性极高 (， 1995)。其 天然靶细胞是骨髓细胞，主要引起肉鸡全身性骨髓细胞瘤或髓性白血病，表现为肝脾肿大，呈现弥漫性细小肿瘤结节，此外在胸骨和肋骨上也可出现肿瘤结节。 鸡群中存在有免疫耐受的现象而且 有经种蛋垂直 传播、水平传播两种传播形式，病毒感染可引起肉种鸡消瘦、鸡冠苍白、严重生长发育不良、发生机体免疫抑制，患病种鸡群在开产到产蛋高峰期前后的最高死亡率可达 23%以上，产蛋率明显低于标准水平；经垂直传播先天感染的子代鸡饲料报酬降低、死淘率明显升高。另外， J 亚群禽白血病除造成以上直接危害外，其引起的免疫抑制，还可严重影响禽流感等禽类烈性传染病的免疫预防效果，降低禽只对各种病原体的抵抗力，导致药物的过量使用，药物残留水平升高，影响禽肉产品品质，从而引发更为严重的危害。 由于对禽白血病 (除 计划的实施，截止 20 世纪 90年代以前，禽白血病病毒 (导的疾病已经降到最低点，并且 、 B、C、 而正当清除计划出现曙光的时候， 1988年 英国发现了 ，1991； ， 1997） 。自此， 为养禽业的一个世界性的问题。该病在美国和英国等地区肉用种鸡群中的发生率很高，鸡群感染率接近 50%（ ， 1992） ，而我国多年来不断从欧美等国家引进种鸡，一 度缺乏对 不可避免地在全国范围内出现了该病的流行。自九十年代末，崔治中等从江苏、山东、河南和宁夏等省市的爱维因、 岩等， 1999； 2000）。近期， 造成严重的经济损失。在本研究过程中，自东北地区吉林省某患病父母代种鸡场以及哈尔滨市临床发病鸡送检样品中分离到了两株 流行病学调查表明， 起了该场一个父母代鸡群的发病，不仅种鸡发病，出现极度消瘦，疫苗反 应低下，引发肿瘤并死亡，而且在其商品代鸡群中也引起了广泛的生长抑制和免疫抑制、饲料报酬降低、死淘率明显升高，在确诊为 场对被感染的父母代鸡群进行了清淘，但因为水平传播的存在，此次疫情对其他鸡群的生产性能也造成了潜在的影响。另外，因为被感染鸡群为该父母代种鸡场的中间代次生产鸡群，该批种鸡的淘汰，影响了该种鸡场的生产周期，造成了商品代雏鸡的停产，对该场及其辐射的商品代养殖场造成了极大的经济损失；在哈尔滨市临床发病鸡中分离到 实验结果表明在黑龙江省境内也存在着 付朝阳等， 2004；宋素泉等， 2003），该病的存在直接影响了东北地区感染场鸡群健康状态，同时也给东北地区养禽业带来了巨大的威胁。 目前世界各国均缺乏针对于 J 亚群禽白血病感染的理想治疗方法和疫苗，最佳的办法是早期查知患病种鸡并严加淘汰，通过不断的净化达到纯洁种群的目的，鉴于我国 引 言 2 流行情况，在肉种鸡群中开展 就需要相关的流行病学、分子流行病学资料以及适用于大型鸡群的常规血清学诊断方法。 首先在流行病学和分子流行病学方面， 有反转录病毒共同的显著特 点，即遗传不稳定性和多变性，这一特点表现在 因的变异，世界各国的流行病学研究结果表明，近年来分离到的 因始终处于不断变异中，导致了 近十年期间由传染性很强的慢性致瘤性病毒演变为传染性很强的急性致瘤性病毒，其中对英国 1994 年至1995 年期间 离株的研究表明，用于检测最初 株病毒的 法检测不出一些后续分离株，核酸序列分析结果表明，这些后续分离毒株的 因发生了变化 , 变化的区域主要集中在 段上（ ， 2000） ,我国已经开展的部分 国内流行株囊膜蛋白 表现出了丰富的抗原性变化（秦爱建等， 2002），因此在我国肉用型鸡群中进行 定国内 其是 因特点、研究不同致病性病毒的分子变异已成为我国学者开展 其在目前我国肉用鸡饲养业中品种繁多、从国外引进祖代鸡的渠道不同、缺少相应的检疫手段、对鸡群中 状不清、无 显得尤为重要。我国 基因组是否存在特征性的变化、流行株是否起源于其他国家、是否由其他国家毒株衍化或重组而来、与其他国家流行株的分子进化关系及同源性如何、是否存在着特征性的 异特点等都是我们研究重点。 另外，在抗体诊断技术方面，国外用于检测 膜蛋白 血清学诊断试剂盒已经商品化（ ），并且在国外肉种鸡 为我国早期查知病毒、有效开展 是因为 年来分离到的 因始终处于不断变异中，世界各地区 离株 分子变异规律与国内 株不尽相同，而国内毒株间的变异虽然存在，但已有的研究结果表明，国内毒株基本处于一个变异幅度之内，因此来自国外的血清学诊断试剂盒在毒株与之相比变异较大的国内使用时的效果还有待于进一步证实，加之其价格较为昂贵，因而导致现地鸡场开展 化的成 本升高，较难承受，很难大范围推广使用。因此，建立国内自主研制的抗体诊断方法，提高其在国内应用的适用性、降低现地开展 显得非常的紧迫和必要。本研究中克隆表达 内病毒株 因片段，对其开展高效表达研究，并以高效表达的重组 抗原，建立用于检测抗体的血清学 之还将进行商品化诊断试剂盒组装方面的相关研究，最终形成的相关成果必将凭借其良好的使用效果和合理的价格优势服务于现地。为国内早期查知患病鸡群、有力避免 高肉鸡生产企业的经济效益提供 完善的技术体系和技术支持。 中国农业科学院博士论文 文献综述 3 文 献 综 述 1 禽白血病病毒研究进展 白血病病毒及其亚群分类 J 亚群 反转录病毒科、致瘤病毒亚科、禽白血病肉瘤病毒群。根据病毒囊膜糖蛋白的抗原差异 、 病毒干扰实验 、 宿主范围和基因组的分子生物学特性，可将 J 10个亚群( ,1997； ,1997)（见表 1）。根据国际病毒命名委员会 （ 2001年公布的病毒分类与命名结果，目 前所有登陆的 。不同亚群 宿主类型不同，其中 A、 B、 C、 D、 六个亚群 亚群 亚群 中外源性 群包括 A、 B、 C、 ，而内源性 亚群以及其他各亚群， A、 B、 C、 等外源性 巴细胞性白血病和骨髓细胞性白血病），其基因组并非永久地整合在 宿主细胞的染色体上。而内源性 泛存在于宿主细胞中并永久地整合在宿主细胞的染色体上，通过宿主细胞分裂而复制，内源性病毒基因性传播机制，并不产生感染性病毒粒子。 在商品鸡群中 A 亚群病毒最为常见 ， B 亚群病毒次之 ， C 和 D 亚群病毒较为罕见，而 J 亚群病毒自发现以来则主要存在于世界众多国家的肉种鸡和商品肉用型鸡群中（ ， 1998； 1995； ， 1995）。 表 1 群的原型株、宿主及病毒类型 of 群 原型株 宿主 病毒类型 of 鸡 外源性 B 鸡 外源性 C 鸡 外源性 D 鸡 外源性 E 鸡 内源性 F 雉 内源性 G 雉 内源性 H 鹧鸪 内源性 I s 鹌鹑 内源性 J 鸡 外源性 毒基因与囊膜基因受体 禽白血病病毒具有典型反转录病毒科， C 型反转录病毒的共同特征 , 病毒粒子直径 80 100 由外部的囊膜和内部电子致密的核心构成 , 核心直径 45 病毒囊膜上有放射状突起 , 直径约为 8其基因组全长约 直接作为 至 3端顺序为 别编码病毒 结构蛋白、 反转录酶 )和囊膜中国农业科学院博士论文 文献综述 4 糖蛋白。结构基因的两侧具有长末端序列 (。急性转化型 该病毒含有 5种结构蛋白，分别为病毒群特异性抗原衣壳蛋白 病毒基膜蛋白 参与 工与包装的核衣壳蛋白 参与蛋白前体剪切的天冬氨酸酶 功能不详的 A E 各亚群病毒囊膜基因序列的差异主要在 外膜蛋白 ( 区域的 3个可变 区 (即 2000； 1986； 1998),其中 前对 化关系及其生物学意义并不是完全清楚。通过交叉中和试验发现 ， A 亚群各病毒密切相关 ,较为保守 ； 囊膜基因产 物对所诱导的疾病类型并无影响（ 1997） 。 尽管病毒可以非特异吸附到细胞表面 ， 但病毒最终能否进入细胞则是由靶细胞膜上是否有病毒特异性受体决定的（ 1998） 。通过不同遗传背景细胞对不同亚群病毒的易感性分析 , 推测在鸡的基因组中有 个常染色体基因座 ， 它们分别独立控制着 与 亚群病毒的易感性。在每种 存在着易感和抵抗等位基因 ,而易感基因属显性基因。因此 ， 只有当细胞处于抵抗基因纯合状态时才能完全抵抗某亚群病毒的感 染。目前尚不清楚鸡对 研究结果表明， 似乎所有品系鸡对 毒都易感。 最近已先后分离到 A、 亚群病毒受体基因。从鸡和鹌鹑的细胞中克隆出的 家族中的一个成员 ， 目前通过点突变法已确定了受体蛋白中功能较为重要的几个氨基酸残基 ， 受体基因在 从鸡细胞中克隆出的 家族中的一员 ， 在该受体蛋白的胞浆尾中有一个与 I 型 亡域” ， 可以诱导细胞凋亡 ， 这与 B、 引起细胞死亡的现象相吻合 ； 从火鸡细胞中克隆出的 亚群病毒受体基因序列十分相似 ， 可使细胞对 但对 1995）。 毒的致肿瘤能力 据其转化细胞的快慢 ， 可将 类 ， 即急性转化型 慢性转化型 二者转化细胞的机制不同。急性转化型 均能在几天之内转化细胞。急性转化型 禽成红细胞性白血病病毒和成髓细胞性白血病病毒 )转化细胞的分子基 础是其基因组中携带 1个或 2个位置不定的病毒性肿瘤基因 ,它们可能是在长期的进化过程中通过遗传重组从正常细胞获得 ,不受正常调控过程控制。其异常表达产物使细胞生长和分化发生变化而产生肿瘤 ， 主要分为 4类，即生长因子、生长因子受体、核因子和细胞转导因子（ 1995）。 肿瘤基因 ， 编码转录因子 ， 诱导骨髓单核细胞肿瘤 ； A 病毒带有 国农业科学院博士论文 文献综述 5 肿瘤基因， 编码转录调控子 ， 诱导成髓细胞和前髓细胞肿瘤 ； 禽成红细胞性白血病病毒 ( 因产物为表皮生长因子受体 ， 诱导成红细胞性白血病 ； 诱导骨髓单核干细胞肿瘤 ； 26株带有 前已鉴定的禽类病毒性肿瘤基因共有 15种 。 慢性转化型 在感染后所诱导的肿瘤形成较晚 ， 这些病毒基因整合在宿主细胞基因组中原癌基因的上游或下游或中间 ， 引起插入突变来诱导淋巴细胞性白血病。多能干细胞的原癌基因被 导致细胞肿瘤基因的异常表达而形成肿瘤 , 列差异和特异性的 性转化型 淋巴细胞瘤 ， 其中 产生大量的 62000导致 淋巴细胞瘤 ， 同时伴有其它细胞性肿瘤基因的激活导致肿瘤进行性生长与转移。增 生性 生阶段 ， 染后数周法氏囊有 1个或多个转化的淋巴滤泡再迁移到其它器官导致鸡只死亡。在野外和实验条件下都发现马立克氏病病毒 (清 苗株可增加淋巴性白血病的发生率 ,其原因是 其诱导产生骨髓细胞性白血病 ，发病机理同样也是 插入突变，从而引起肿瘤发生。 源性白血病病毒 外源性和内源性 要分类依据是病毒的自然传播方式 ,外源性 既能经蛋垂直传播也能水平传播 , 如 A、 B、 C 、 亚群病毒。内源性 指正常鸡基因组中与外源性 一般不以病毒粒子的形式进行传播 ， 只作为鸡基因组的一部分按孟德尔遗传规律进行代次间传递。目前已知有几个内源性病毒家族 ， 包含各类 度重复元件 这些元件的起源、进化关系和生物学意义尚不明了。从进化论角度分析 ， 件 (为古老 ， 物中广泛存在与其基因迁移有关的各种反元件 ( 反座子和反转座子 ， 它们是反转录病毒的进化前体 ,已经获得了作为传染性实体存在于细胞外的能力。有人认为内源性病毒可能是在长期进化中整合进生殖细胞系的外源性病毒。大多数内源性病毒都是遗传缺陷性的 ， 不具备产生传染性病毒粒子所必需的反转录病毒基因 ,但是有些元件可产生 子 , 在所有内源性病毒元件中研究较多的是 常采 用限制性内切酶酶切片段长度多态性 (析来鉴定 ， 至今已鉴定的鸡 9个 ， 估计共有 50 100个 每只鸡平均携带 5个。由于病毒 各基因座的表型有很大差异 ， 如 自发或经化学诱导剂诱导在细胞中产生 E 亚群白血病病毒粒子 ； 缺陷性 但不产生具有传染性的病毒粒子 ,如 其寄主细胞含有 亚群病毒的囊膜糖蛋白 ,但 可通过 接补体结合试验 (鸡辅助因子 (中国农业科学院博士论文 文献综述 6 验来测定。 使细胞对 E 亚群病毒的感染具有抵抗力。 完全表达的具传染性的病毒粒子也可进行垂直传播和水平传播。 表株 致肿瘤能力很弱或根本无致瘤能力。关于 因座对鸡只的危害目前还没有统一的结论 ,可以肯定的是 , 2 J 亚群禽白血病研究进展 J 亚群禽白血病（ 历史回顾 鸡的经典白血病主要由外源性的 亚群引起，少数由 亚群引起，利用剔除 过多年的努力，到 80 年代中期在世界各发达国家的商品鸡群中基本消灭了这种经典的外源性 身性骨髓细胞瘤或髓性白血病 (L)病例在英国的商品代肉鸡中仅存在散在发生（ ， 1991）。 然而 1988 年 在研究肉用种鸡鸡群的 染状况时分离到几株 104）， 根据宿主范围、病毒干扰模式及用病毒血清中和试验 鉴定的病毒囊膜抗原等，确定该病毒是一类不同于已知的 A E 亚群的禽白血病病毒， 对其研究的结果表明，他们属于一个新的亚群 （ ， 1991） ，而 与以前分离的亚群不相关， 遂 将其确定为 因其中 株表现稳定，被定为新亚群的原型毒株，为深入开展 ， 1998）。此后 又作了一系列实验，对将此病毒定为新的亚群提供了充分的证据。 但是，由于 加上鉴别亚群的技术难度较大，因而在以 前很长一个时期内一直未引起人们的注意。 事实上，早在七、八十年代 例就在养殖业发达国家的肉鸡群中散发存在，由于最初疏于控制，该病随着国际肉鸡业的发展和产品交易在世界范围内迅速传播，至 1998年世界许多地区都有大量 例报道，给肉鸡业的发展带来巨大压力 ( ,1999)。 随着 近年来发现 J 亚群禽白血病的流行范围越来越大 ,并引起了严重的损失。其中 荷兰对1991年分离的 果当时的 亚群 （ , 2002） 。至今， 美洲（ ,1998）、 （ 欧洲 （ ， 1998； ， 2000； 2001） 、 非洲（ ， 2000） 、中美洲（ , 2000） 、南美洲（ , 2000） 、中东（ , 2000） 、澳大利亚 （ , 2000） 和亚洲的大部分地区 ( ,2002； ,2002； ,2002)。不仅流行地区广，而且在部分国家和地区，感染率非常高，例如 在美国 和英国及世界一些地区的肉用鸡群中感染率接近 50%( ,1998； 1997；1999)，以至于 1997 年和 1998年被称为 J 亚群禽白血病的灾难年 ，除了澳大利亚和新西兰外，世界各国肉种鸡和肉仔鸡均遭受不同程度的侵袭，曾经一度造成了巨大经济损失。 目前国内