【毕业学位论文】（Word原稿）重组E2蛋白在猪瘟的检测及免疫方面的应用研究预防兽医学硕士论文

I 密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 重组 白在猪瘟的检测 及免疫方面的应用研究 2 I 2 要 接种疫苗 并 检测 疫 抗 体水平是预防与控制猪瘟的重要技术手段 。 本研究通过原核表达系统高效表达了可溶性的 2 蛋白，用亲和层析方法纯化，获得 重组 白 抗原。进行了 猪瘟的检测及免疫 方面的应用研究：建立了一种检测 体的间接 法，研制了 相应的 诊断 试剂盒； 将 纯化的重组 白 制 作为亚单位分子疫苗 ，通过免疫本动物猪，研究了免疫效果。以上研究 为最终成功研制安全、高效 、可鉴别 的猪瘟亚单位疫苗 奠定了基础 。 2 蛋白。 应用 增了中国 化弱毒（ 因，构建了原核表达载体转入到宿主菌 ，在较低的温度（ 16）和硫代 度（ ）下对重组菌进行了诱导表达，高效表达了可溶性的重组 白。结果显示，白在大肠杆菌中得到了高效表达，可溶性蛋白的表达量占融合蛋白的 40%。 2 蛋白。 合蛋白与谷胱甘肽的结合是可逆的，用加入还原性谷胱甘肽的洗脱液可以高效地把结合态 合蛋白洗脱下来。本实验使用 附型树脂颗粒，通过亲和层析方法快速、简易、高效地从表达菌中分离纯化出重组 白 ， 亲和层析纯化后其纯度可达到约 85%，其浓度可达 5mg/为研究猪瘟诊断试剂盒和新型亚单位分子疫苗奠定了坚实 的物质基础。 体的间接 法，并研制出相应的 猪瘟 间接 剂盒。 用纯化的重组 白作为抗原包被酶标板，以辣根过氧化物酶 (记的兔抗猪 二抗，建立了检测猪瘟病毒抗体的间接 法，并确定了 佳工作条件：抗原包被浓度分别为 g/被条件为 37放置 1h 后，再 4过夜；猪瘟阳性血清 (180)在 37作用 45标二抗 (1 1000)在 37作用 45物溶液 37显色 15过敏感性实验、特异性试 验、重复性试验、对比实验和稳定性试验，表明：该方法的 敏感性为 与国外 司的同类试剂盒比较，两者的符合率为 92%。 用已建立的方法检测送检 血清样本 500 份， 阳性率为 2 蛋白进行本动物 免疫 实验。 利用大肠杆菌表达的可溶性重组 白作为抗原，用弗式佐剂乳化后经皮下途径接种 40日龄仔猪 （ 猪瘟病毒抗 原抗 体 皆为 阴性 ） 7 头。 每次免疫后 21 天后采血，利用夹心 正向间接血凝检测抗体的变化，第二次免疫后 21 天时进行攻毒保护试验。结果表明，第二次加强免疫后 抗体水平明显上升；攻毒后对照组 4 头猪中有三头在 3 8 天之间全部死亡，第四头猪在 14 天时处于频死状态，疫苗免疫猪全部存活，无猪瘟病毒感染后的临床症状； 无菌采免疫组猪的扁桃体和脾脏，利用 法扩增 因，结果为阴性，利用 司 本动物试验结果证明利用大肠杆菌表达的重组 且有确实的免疫效果。 关键词 ： 重组 白 ；猪瘟； 和层析； 蛋白纯化；间接 V in is , B, C ) 2 by It by It is 2 at 2 be by of 2 in 0%. a of of be in or of E2 in 5%, 5 mg/ an of 7 1h at a 1:80) RP 1: 1000) 7 5to a by of In 500 by it 7 21we 1of bs to It 2 2 英文缩略表 缩写 英文名称 中文名称 体 原 瘟 瘟 病毒 d 甲亚砜 联免疫吸附试验 g 谷胱甘肽转移酶 h 时 根过氧化物酶 免疫球蛋白 G 道尔顿 L 相阻断 酶联免疫吸附试验 m 克隆抗体 克隆抗体斑点酶联免疫吸附试验 密度值 酸盐缓冲液 0 磷酸盐吐温缓冲液 乙二醇 （氢离子当量浓度指数） 四甲基联苯胺 间接血凝试验 呼吸与繁殖障碍综合征病毒 分钟转速 分钟 二烷基硫酸钠 十二烷基硫酸钠 g 克 L 升 录 第一章 绪 言 瘟研究进展 . 1 述 . 1 瘟病原、临床症状与发病机理 . 1 瘟的分布与危害 . 2 瘟的流行动态 . 2 瘟的诊断 . 3 瘟的防制 . 5 瘟病毒研究进 展 . 7 瘟病毒粒子的结构 . 7 瘟病毒理化特性 . 8 瘟病毒的抗原性、毒力和分型 . 8 瘟病毒的分子生物学研究 . 9 第二章 猪瘟病毒 白在大肠埃希氏菌中的可溶性表达 . 12 料与方法 . 12 株 . 12 株和质粒 . 12 和试剂 . 12 器和设备 . 12 计合成引物 . 12 取病毒 克隆目的片段 . 13 建重组表达载体 . 14 导表达重组蛋白 . 14 定所表达的蛋白 . 15 果 . 15 的基因的克隆 . 15 组表达载体的鉴定 . 16 组蛋 白的表达 . 17 达产物的检测 . 17 论 . 18 达载体、宿主菌与外源基因 . 18 融合蛋白 可溶性表达条件 . 18 第三章 猪瘟病毒重组 白的纯化 19 材料与 方法 . 19 剂 . 19 料与方法 . 19 关溶液的配制 . 19 达重组 白工程菌的制备 . 20 和层析法纯化流程 . 20 缩 白浓度、纯度的测定 . 21 白活性测定 . 21 果 . 22 和层析法纯化流程结果 . 22 缩 白浓度、纯度的测定 . 22 2 蛋白活性测定 . 22 论 . 22 第四章 基于重组 白建立并优化检测 猪瘟病毒抗体的间接 . 25 料和方法 . 25 原 . 25 剂和耗材 . 25 需溶液的配制 . 25 接 法的建立 . 26 感性试验 . 27 异性试验 . 27 复性试验 . 27 比试验 . 27 间血清样品的检测 . 27 果 . 28 接 法最佳工作条件的确定 . 28 接 法阴阳性临界值的确定 . 29 感性试验 . 29 异性试验 . 30 复性试验 . 31 比试验 . 31 间血清样品的检测 . 32 存期试验 . 33 论 . 五章 重组 白亚单位 疫苗猪体免疫试验 . 34 料和方法 . 34 疫材料 . 34 要试剂 . 34 苗的制备及免疫剂量 . 34 验动物及分组免疫 . 34 体的监测 . 35 果 . 35 验猪体内 异性抗体的变化 . 35 毒试验 . 36 论 . 36 第六章 全文结论 . 38 参考文献 . 39 致 谢 . 44 者简历 45 图表清单 图 2增 因 12 图 2核表达载体 构建策略图 1 6 图 2切鉴定 1 6 图 2析 37 和不同 度诱导表达的 结 1 7 图 2 17 图 3和层析法纯化流程 白 12 图 32 蛋白 1 6 图 3白纯化系统示意图 16 图 4接 法 1 6 表 4阵滴定的 P/N 值结果 18 表 4佳包被条件结果 18 表 4佳 反应时间 结果 18 表 4感性试验结果 19 表 4断试验结果 19 表 4叉试验结果 19 表 4复试验结果 20 表 4比试验结果 20 表 4间血清样品检测结果 21 表 4存期试验结果 21 表 5验动物分组 21 图 5剂盒检测 异性抗体 28 表 5毒结果 28 中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪言 1 第一章 绪 言 瘟研究进展 述 猪瘟是猪的一种高度接触性传染病，以发热和出血为主要特征，死亡率非常高（蔡宝祥，1999）。该病早期被称为猪霍乱 (我国民间称之为烂肠瘟，欧洲为了与非洲猪瘟相区别，将其称为古典猪瘟（ 1957 年 据 道，猪瘟样疫病最早约 1810年出现于美国田纳西州，后来大约在 1833 年又在美国俄亥俄州暴发（ J, 1957）。但 1968 年据 道，该病于 1862 年首先出现于英格兰，然后传到欧洲大陆。我国关于 报道，最初是从东南大学农科系于 1925 年研究 疫血清的记载开始的，至于何时发现和证明猪瘟存在，没有明确的文字记载。 由于猪瘟具有高度接触传染性和巨大的经济破坏力，国际兽疫局 其列为 A 类传染病（ 1998）。 A 类传染病是指症状特别严重、传播迅速、无国界，能造成巨大的社会经济损失和严重公共卫生问题，对动物及其产品国际贸易有严重影响，按照 “国际动物卫生法（ ”必须向 报的传染病（ 由于不同毒株的毒力不同，猪感染该病后引起疾病的严重程度差异相当大。目前，猪瘟主要分布在亚洲、非洲、南美洲和欧洲的 40 多个国家和地区。 猪瘟的爆发严重影响猪及猪制品贸易 。 调查显示，现阶段 然是对全球养猪业 威胁最大的疾病（ et 在我国 ， 猪瘟的危害也十分严重，每年因猪瘟死亡的猪占饲养总数的 3%刘湘涛等， 1995）。但也有一些国家，包括澳大利亚、加拿大、新西兰、美国和一些欧盟成员国，在采取了严格的措施后，成功地消灭了猪瘟 (, et 瘟病原、临床症状与发病机理 猪瘟的病原是猪瘟病毒 ( 早在 1885 年和 1886 年 ， 提出：猪瘟是一种由霍乱沙门氏菌引起的细菌性疾病。1903 年 先证实：猪瘟的致病因子是滤过性的病毒。近几年来，通过对该病毒的蛋白结构、核酸序列以及基因重组和表达等方面的深入研究，证明了该病毒的基因结构、复制类型以及表达方式和黄病毒极为相似，应归属于黄病毒科 (史国瑞， 1993），因此猪瘟病毒便归为黄病毒科 (病毒属 (这个属的成员还有在抗原性和结构上与 切相关的牛病 毒性腹泻病毒 (绵羊边界病病毒 ( M,1977)。 自然条件下， 般通过口腔粘膜感染 且只 感染猪， 其 潜伏期为 7 10 天。感染猪发生结膜炎和白细胞减少等症状，最典型的症状是皮肤和粘膜的斑点性出血。患畜中枢神经系统紊乱、便秘及随后的腹泻也是特征性的表现。临床症状的严重性取决于动物的年龄和病毒的毒力。成年猪感染后常表现为温和或亚临床症状；仔猪受其影响更严重，感染后死亡率可达 90%。经胎盘感染后的影响主要取决于妊娠的时间，可能会导致流产、死胎、木乃伊胎、畸胎及产出体质差或持续性病毒血症的仔猪（王镇等， 2000；李成等， 1989）。持续性感染的仔猪出生时可能表现正常，但都最终死亡。 中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪言 2 毒动物体内的靶细胞是内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和一些表皮细胞。病理变化因临床症状的不同而不同（ W, et 在胚胎发育的早期阶段，病毒会影响器官的分化而导致畸形；出生后的感染主要引起血管内皮的损伤和出血体质的血栓。造成的病理损伤可能包括淋巴组织的实质变性 、血管内皮组织的细胞增生、非化脓性脑膜脑炎等。急性感染期间， 能引起机体的免疫抑制；急性感染末期，循环系统和淋巴组织中 B 淋巴细胞数量减少（ 2000） 。急性感染后 2 周即可检测出中和抗体，而对于慢性感染猪，感染后第一个月的月末几天才能检测到中和抗体，随后抗体消失（ 2000；, et 持续性病毒血症的感染猪 则 很少产生特异性抗体。康复猪可获得被动保护达几年甚至终生。母源抗体半衰期约为 14 天，被动免疫通常在第 5 周 对仔猪产生保护，但不能阻止病毒的复制和散播。 瘟的分布与危害 猪瘟是一种严重威胁养猪业并具有重要经济意义的病毒性疾病，被世界动物卫生组织 (入 16 种 A 类法定传染病（ 1998）。 1996 年，在意大利举行的国际猪兽医大会上肯定 养猪业的头号大敌（洪文学， 1997）。我国农业部于 1999 年 2月发布了第 96 号公告，也将猪瘟列为一类动物疫病。 自 猪瘟 发现以来，世界各国对该病 的防制作出了巨大的努力，而且在北美、澳洲和北欧的一些 地区还成功 消灭了猪瘟，但猪瘟 仍然在世界 许多地区广泛传播，并造成了巨大的经济损失。据粮农组织 世界卫生组织 (动物卫生年鉴 (1982)公布，全世界现有 44 个国家和地区存在猪瘟，主要分布在南美、欧洲和远东的一些国家和地区。联合国卫生组织 1998 年的资料指出，猪瘟在非洲的马达加斯加、美洲的古巴、海地、亚洲的大部分地区，欧洲的一些国家和地区仍在发生和流行（何北庆， 1999）。近期 世界各国仍不断 暴发猪瘟， 2002 年 1 月，德国莱茵 区和 卢森堡 区的野猪发生猪瘟； 2002 年 3 月，保加利亚持续发生猪瘟； 2002 年 4 月，韩国和罗马尼亚发生猪瘟，法国在野猪中发生猪瘟； 2002 年 5 月，斯洛文尼亚在野猪中检测出猪瘟病毒； 2002 年 6 月克罗地亚发生了猪瘟（高彦生等， 2002）。在中国的大陆和台湾地区也有猪瘟流行，其中大陆多以散发和慢性病例为主（ u, et 2001）。 急性 高烧和复合性出血 为主要临床 症状 ，但是近些年来该病常表现出慢性或非典型的流行特征：感染猪不表现出任何病症，但病毒 能通过接触或猪肉产品 的加工和 运 输 而迅速扩散，引起猪瘟暴发，造成巨大的经济损失。例如，美国在 1962 年实施联邦政府猪瘟根除计划