中药血清药理学在神经药理学研究中的应用与规范化

!综述中药血清药理学在神经药理学研究中的应用与规范化孙蓉!,刘国卿!(!中国药科大学药理教研室,南京!#$;山东省中医药研究院,济南%#!&摘要中药血清药理学是近年来才兴起的一门中药药理体外实验方法学,它排除了传统中药体外验中中药粗制剂本身的理化性质对实验的干扰,又能反映药物在体内的生物转化过程及其作用结果,在中药药理的实验方法上具有创新性。中枢神经系统疾病是严重威胁人类健康的疾病之一,本文探讨了中药血清药理学在中枢神经系统药物研究中的应用与技术规范化。关键词血清药理学;神经药理;亨廷顿病;帕金森病;阿尔茨海默病神经系统疾病是包括以神经元变性为主要病理改变的一大类疾病,临床上常见的有亨廷顿病(*+,-*./+01201,3、帕金森病(4256+0.0/+01201,43、老年痴呆等。亨廷顿病是以新纹状体损害为主的锥体外系病,其病理变化包括尾壳核神经细胞的变性,细胞数量可降至原来的!#7,并伴侧脑室的扩大;随着病情发展,进一步累及皮层神经元,脑重量的减轻可达8#7。帕金森病是原发于黑质纹状体通路的锥体外系变性病。病理特征表现为多巴胺能神经元的损伤,尤其是黑质致密带的多巴胺能神经元的退化。阿尔茨海默病(9:;?扫描可见侧脑室明显扩大及脑沟增大。93患者脑内各区域神经元丢失的程度并不一致,其中胆碱能神经元的标记物胆碱乙酰转移酶活性显著降低,这与基底前脑胆碱能神经元的丢失有关。93患者特征性的病理改变为老年斑的形成以及神经原纤维缠结(1(5.-A +B 5+:25C *2-,:1,?D 。中药血清药理学方法的优势和特色!,中药药理学方法是在以前体外实验的基础上加以改进形成的,即以含药血清代替中药粗提物进行体外实验,它不仅具有体外实验的优点:如条件可控性强,可在细胞、亚细胞水平进行超微、生化、受体、基因等方面的研究;揭示药物作用机理较为深入,重复性好,使用材料少等。而且有其更适合中药及其复方制剂研究的独特之处。因为中药尤其是复方制剂的化学成分极其复杂,经过体外的煎煮或其他制备过程,再经口服以后在体内发生一系列变化,有的是药物本身物质发挥作用,有的是经过肝脏代谢的产物发挥作用,有的是肠道细菌代谢产物发挥作用。因此,以中药的粗提物的体外实验结果来评价药物的体内效应是不客观的也是不确切的。以含药血清代替中药粗提物进行实验更接近药物在体内环境中产生药效的真实过程。可见中药血清药理学方法有如下优点:采用含药血清培养细胞可以直接观察中药的药物学效应,便于从微观阐明药物作用机理;利于用现代生命科学阐明中药复方配伍实质,便于观察和追踪药物的吸收和代谢过程,排除体外干扰因素影响,较清楚地认识药物活性成分和活性部位,为药物进一步开发提供依据。因而特别适用于中药及复方药理作用和化学成分的研究。中药血清药理学方法研究几个关键问题现状8动物选择一般多选用大鼠、家兔、豚鼠等动物来制备含药血清,但不同种属动物的血清成分不同,因此在选择动物时应尽量选用与人类生物学活性近似的物种。刘成海等&提出在体外培养实验中宜采用同一种单一血清,既为细胞提供营养,又为药物提供载体,还避免了由血清引起的多种干扰作用,一般应首选家兔和大鼠。灌胃次数与时间有E !#/法(!次/,连用E !#/、8次给药法(连续给药8次,第!、次间隔#,第、8次间隔&、次给药法(第!次给药后,再以相同剂量重复!次等。各种给药方式都是为了达到稳态血药浓度,从而便于药物作用机理的研究。严格地说,应该根据药物半衰期给药,连续%!E 个半衰期达到稳态血药浓度,但由于中药及其复方成分复杂,半衰期很难测定,所以E !#/给药为权宜之计。如果对药物血清时效关系进行研究,应另当别论。给药剂量在实验中,由于含药血清加入体外反应系统后,浓度将被稀释,因而达不到在体内条件下的药物浓度,反应系统可能出现假阴性反应。针对此种情况,李仪奎等%提出按新药药理研究的技术要求设计剂量给药,将含药血清制成冷冻干燥粉(冻干粉,以冻干粉形式加入反应系统,使之达到所需要的浓度。&F 中药药理与临床#%;!(刘平!认为给药剂量应以整体模型动物的有效剂量(即为临床成人剂量的!#倍量为宜。含药血清的采集大鼠一般给药#!$%后血药浓度达到峰值,此时的血清为最佳含药血清。超过#天后,大部分药物成分已经被代谢和排泄,药物的直接作用消失,此时的血清为机体功能状态血清。当然还要考虑例外,因此最好能通过预实验来确定最佳采血时间。含药血清的灭活含药血清是否需要灭活,许多学者观点不一。有的将含药血清经&!,(*+,灭活,也有的不经灭活,直接进行体外实验。刘成海等-发现正常大鼠血清无论灭活与否均可维持大鼠肝贮脂细胞的贴壁生长,两组大鼠血清对肝贮脂细胞内(./ 012掺入的影响无明显差异,所以刘氏主张血清经&!,(*+,灭活,可排除非药理性干扰。但徐海波等认为含药血清不宜灭活,因为血清经灭活以后,其中含有的机体在药物作用下产生的内源性有效成分将减少或丧失,生物活性降低,会影响药理实验结果,而且与体内实验和临床用药情况也不相符。对于血清非药理性干扰,可采取空白对照来衡定和排除,而细胞培养中的微生物感染,也可用微孔滤膜除菌法来防止。至于哪种方法更为合理,还有赖于今后血清药理实验结果来证实。神经药理学研究中血清药理学方法的应用神经系统疾病的药物研究涉及到许多的体外模型,运用这些模型可以快速、有效地筛选出治疗疾病的药物,主要包括缺血缺氧以及一些特异的损伤模型。合理使用中药血清药理学,结合疾病的体外模型,可以帮助我们对中药复方进行分析,从而得到有效的治疗中枢神经系统疾病的药物。整体动物实验研究药物更接近动物的实际情况,但容易受到某些因素如脑温、血压、药物本身的副作用及血脑屏障通透性等因素的影响。而使用体外培养神经细胞的方法可得到相对均一的细胞群体,排除上述因素的影响,研究神经细胞对缺血缺氧性刺激的直接反应更加可靠。赵玲等3发现聪圣胶囊具有保护神经细胞缺糖/缺氧性损伤的作用,不同剂量的聪圣胶囊药物血清可明显抑制缺糖/缺氧诱导的神经细胞内乳酸脱氢酶释放,提示聪圣胶囊对缺糖/缺氧诱导的原代培养大鼠新生鼠脑皮质神经细胞损伤有明显的保护作用,降低神经细胞凋亡率,具有抗凋亡作用。血管性痴呆是指各种脑血管疾病引起的获得性智能损害综合症。研究表明认知功能障碍主要是由于海马环路损害而致。脑缺血再灌注过程中,脑部缺氧缺糖可诱导神经元去极化、兴奋性氨基酸的过量释放、钙超载等一系列下游事件,最终导致神经细胞损伤和死亡。因此45$6$78诱导9:#$细胞缺氧缺糖损伤以及谷氨酸钠诱导9:#$细胞兴奋性氨基酸损伤,均可模拟神经细胞缺血再灌注损伤。王鹏等#研究发现当归芍药散精简方(;=全方的正丁醇部位和水部位成分复杂,若直接用于体外细胞实验,易于出现假阴性和假阳性结果,;=多糖和挥发油部位因为具有抗肿瘤活性,对9:#$细胞的直接杀伤会掩盖它对9:#$细胞损伤模型的影响,所以不论是单部位还是多部位组合都不适于直接用于体外细胞实验。而采用血清药理学方法,发现含药血清对9:#$细胞缺氧缺糖损伤和兴奋性氨基酸损伤均有较明显的改善作用,其中多糖加挥发油部位效果最好,且其作用相当甚至优于;909(#/甲基/8/苯基/#,$,(,!/四氢吡啶是一种能在多种动物诱发类似帕金森氏症候群的神经毒素,广泛用于帕金森病动物模型的建立,909本身对多巴胺神经元并无毒性,在单胺氧化酶/99?,后者能选择性的抑制线粒体复合物的活性,从而产生细胞毒性作用。田季雨等#采用血清药理学的方法,观察培补肝肾复方含药血清对99?损伤多巴胺能神经元细胞存活时间、存活率的影响及细胞形态学的变化。发现等效剂量培补肝肾中药复方含药血清(灌胃剂量为(/A可延长99?损伤多巴胺神经细胞的存活时间,提高细胞的存活率。证明了培补肝肾复方中药血清对体外培养99?损伤的多巴胺能神经细胞具有保护作用。结语运用血清药理学方法可以方便快捷地进行中药复方的研究,为开展中药治疗中枢神经系统疾病的研究提供了便利。中枢神经系统疾患是严重威胁人类健康的疾病之一,血清药理学作为一种新的实验技术,除可广泛应用于肿瘤、心血管、神经、免疫、消化等中药药理学研究领域外,在神经药理方面的应用方兴未艾,随着对方法学本身的深入研究与规范要求,不但可以进一步推广其应用,还可提高神经药理中药复方的药理研究水平。但尚有许多方法学问题亟待解决。参考文献#薛洁,谢梅林B中药血清药理学的方法学研究近况B中草药,$(;(8 (!C附3!#(下转!(页中药药理与临床$&;$#($!讨论已有报告用地塞米松#$/%$可以造成大鼠胰岛素抵抗模型,但小鼠模型未见报道,因此,我们设计了四个剂量组,即#$/%$连续注射&天、#$/%$隔日注射、#$/%$连续注射&天,摸索并复制了地塞米松致小鼠胰岛素抵抗模型的剂量。从结果可以看出,地塞米松#$/%$连续肌肉注射可以成功造成小鼠葡萄糖耐量下降模型。已有人用高脂肪(脂肪提供热量占(*,碳水化合物热量仅+*或高果糖(&+*左右的热量饲料诱导胰岛素抵抗大鼠动物模型,结果表明,无论是高脂肪或高果糖饲料喂养的大鼠,其肌肉和脂肪组织的胰岛素结合、葡萄糖转运胰岛素介导的葡萄糖代谢均有不同程度的下降,目前大多数学者认为这种模型可靠稳定,价格比遗传型动物模型低廉,。但造模时间需长达周,胰岛素水平才有所升高,-周达较高水平,时间较长。我们在此基础上,给小鼠注射小剂量的四氧嘧啶(+#$/%$,于实验第天和第,天注射,然后再给予高浓度的葡萄糖(!+$/%$灌胃,这样在胰岛有部分损坏的基础上,加上连续高浓度葡萄糖的刺激,加速了胰岛素抵抗的形成,从而减少了造模时间,也克服了单纯四氧嘧啶造模死亡率高的缺点。从实验结果可以看出,与空白组比,单纯灌糖水组血糖水平和胰岛!细胞功能在整个实验中与空白组无显著性差异,胰岛素分泌、胰岛素抵抗指数显著升高,胰岛素敏感指数显著降低,说明糖水组存在胰岛素的大量分泌和对胰岛素的敏感性下降。单纯四氧嘧啶组!细胞功能明显下降,胰岛素分泌稍降低,而胰岛素抵抗指数、胰岛素敏感指数与空白组无显著性差异。四氧嘧啶加葡萄糖组在实验第周血糖水平开始升高,在第!周后显著高于空白组,胰岛素抵抗指数显著升高,而胰岛素的敏感指数显著下降,同时胰岛!细胞的功能也明显下降。从胰岛病理改变上看,单纯灌糖对胰岛细胞损害不大,单纯间断两次给四氧嘧啶可以造成胰岛细胞损伤,在此基础上再灌服高浓度的葡萄糖,可以加重对胰岛细胞的损伤。因此,./01糖水组既存在胰岛素抵抗,又存在胰岛功能的损伤,是较为理想的型糖尿病胰岛素抵抗模型。内经奇病论曰:“此肥美之所发也,此人必属食甘美而多肥也,肥者令人内热,甘者令人满,故其气上溢,转为消渴”,因为饮食习惯不同,平时多脂肪性的食物与甜食,含脂肪的食物产生热量,食甜食物者会引起腹部胀满,使其向上溢,这是消渴病的原因之一。我们结合杨万松等用高果糖饲料诱导大鼠胰岛素抵抗模型的方法,又加注了小剂量的四氧嘧啶,成功的复制了型糖尿病胰岛素抵抗模型,为病因性糖尿病的复制及胰岛素增敏剂的研究打下了基础。同时也揭示了,尽管糖是人体必需的供能物质,但并不意味着摄入越多越好,对于正常人,长期过大量的摄入糖会导致大量脂肪的堆积,胰岛素的敏感性下降;对于胰腺受过损伤的人,更不能无节制的食糖,会加重对胰腺的损伤,增加糖尿病的危机或加重糖尿病症状。参考文献孙秀菊,李开明,崔培红,等2口服矾盐对地塞米松诱导的胰岛素抵抗的预防2中华内分泌代谢杂志,&;!(3:3潘竟锵,韩超,刘惠纯,等2茵陈蒿汤对正常和多种糖尿病模型动物血糖的影响2中药材,+;,(:3!+!杨万松,黄体钢,樊振旺,等2高蔗糖诱发大鼠胰岛素抵抗和高血压机制实验研究2天津医药,3;,(,:!,李晨钟,张素华,舒昌达2胰岛素抵抗动物模型2国外医学内分泌学分册,3;(:!(李秀钧,钱荣立2胰岛素抵抗及临床意义2中国糖尿病杂志,;& (!:!-!(上接封三孙艳红,方晓艳,刘红雨2中药血清药理学方法研究概况2时珍国医国药,+;!(4,(!王淑杰,张秀英,卢立波2中药血清药理学的研究方法及其应用2中国兽药杂志,+,;!3(!4!(!&,刘成海2抗肝纤维化有效中药复方血清药理学方法探讨2中实验方剂学杂志,3;,(4-(李仪奎2中药血清药理学实验方法的若干问题2中药新药与临床药理,;+(4(3-刘平,王宁生,雷燕2关于血清药理学的若干思考2中国中西医结合杂志,;+(4-!-&刘成海,刘平,刘成,等2扶正化瘀方对二甲基亚硝胺大鼠纤维肝原代贮