酵母单杂交 实验方法

酵母单杂分析酵母单杂分析 酵母单杂交技术是体外分析 DNA 与细胞内蛋白质相互作用的一种方法 通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别 DNA 结合位点并发现潜在 的结合蛋白基因 或对结合位点进行分析 运用此技术能筛选到与 DNA 结合 的蛋白质 并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂 的蛋白质分离纯化操作 故在蛋白质研究中具有一定的优势 而且酵母属真核 细胞 通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞 内基因表达调控的情况 实验目的实验目的 了解酵母单杂交的基本原理和应用 掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事 项 学会酵母感受态的制作与转化 基因文库的构建及筛选 实验原理 酵母单杂交方法是根据 DNA 结合蛋白 即转录因子 与 DNA 顺式作用元 件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因 cDNA 该 方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法 如图所示 将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子 minimal promoter Pmin 上 游 Pmin 启动子下游连接报告基因 进行 cDNA 融合表达文库时 编码目的转 录因子的 cDNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后 其编码产物 转录因子 与顺式作用元件结合 就可以激活 Pmin 启动子 并促使报告基因表达 根据 报告基因的表达 筛选出与已知顺式元件结合的转录因子 cDNA 文库筛选 cDNA 融合表达载体 转录因子 顺式元件顺式元件Pmin报告基因 基因编码产物 酵母细胞 表达 Matchmaker Gold Yeast One Hybrid Library Screening System 提供了一个简 单高效的构建 cDNA 文库并进行酵母单杂交筛选的方法 它使用 aureobasidin A 抗性基因作为报告基因 筛选效率高 背景低 单杂交筛选是从酵母双杂交 筛选发展而来 利用单杂交筛选可以对 cDNA 文库进行筛选直接获得与目的顺 式作用元件相结合的蛋白质 图 2 用 Matchmaker Gold One Hybrid System 筛选 protein DNA 相互作用的原理 The Matchmaker Gold One Hybrid Library Screening process 主要包括以下步骤 1 将已知序列 bait 克隆到 pAbAi 载体 2 pBait AbAi 质粒转化 Y1HGold 酵母菌株 使其与酵母基因组发生重组 生成 bait reporter 酵母菌株 3 检测 Y1HGold bait 菌株 AbAir基因的本底表达水平 4 合成 cDNA 并通过 cDNA 和 pGADT7 Rec 载体共转化酵母进行细胞内同源重 组筛选 cDNA 文库 5 筛选结果的验证和分析 实验准备 1 仪器设备 微量取液器 2 5 L 20 L 50 L 100 L 200 L 1000 L PCR 仪 低温离心机 台式离心机 CHROMA SPINTM TE 400 纯化柱 琼脂糖凝胶电 泳系统 凝胶成像系统 恒温摇床 恒温孵箱 通风橱 制冰机 振荡器 恒 温金属浴 酒精浴 无菌接种环 10 cm 培养皿 15 cm 培养皿等 2 实验材料 Y1HGold 酵母株 TOP10 大肠杆菌菌株 各种方法提取的 RNA pGADT7 Rec 质粒和 pBait AbAi 质粒等 3 主要试剂 1 Advantage 2 PCR 试剂盒 Easy Yeast Plasmid Isolation 试剂盒 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 2 各种基础培养基和营养缺陷培养基 minimal SD base minimal SD agar base YPD medium YPD agar medium Leu DO supplement Ura DO supplement 腺苷酸 adenine PEG8000 carring DNA aureobasidin A LB 培养基 氨苄西林 3 NaCl 溶液 0 9 sodium acetate 3 mol L 50 PEG 10 LiAc 1 mol L 10 TE buffer DTT 100 mmol L RNaseH 限制性内切酶 实验方法 1 pBait AbAi 载体的构建 酵母报道子的构建 注 酵母报道子 pBait AbAi 包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝 且插入到 pAbAi 载体 AbAir报告基因的上游 大量研究表明最有效的构建应包 含目的 DNA 三个以上的首尾连接的拷贝 首尾连接的拷贝产生方式很多 但 对于长度小于 20 bp 的调控元件 人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径 1 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列 且两端加上 与 pAbAi 载体酶切产物一致的粘性末端 建议合成一个目的序列的突变 序列作为对照 以排除可能的假阳性 2 用 TE buffer 溶解寡核苷酸至终浓度 100 mol L 3 将正向链和反向链按照 1 1 的比例混合 退火后的双链寡核苷酸最大浓 度为 50 mol L 4 95 C 保温 30 s 去除二级结构 5 72 C 保温 2 min 37 C 保温 2 min 25 C 保温 2min 注 缓慢退火 有助于双链寡核苷酸的形成 6 冰上放置 退火后的产物可贮存在 20 C 冰箱备用 7 酶切 1 L pAbAi 载体 用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物 注 回收前 可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全 8 将退火后的寡核苷酸稀释 100 倍至终浓度为 0 5 mol L 9 在连接反应管中加入如下成分 pAbAi 载体 50 ng L 1 0 L annealed oligonucleotide 0 5 mol L 1 0 L 10 T4 DNA ligase buffer 1 5 L BSA 10 mg mL 0 5 L Nuclease free H2O 10 5 L T4 DNA ligase 400 U L 0 5 L 总体积 15 L 注 如果有必要 可用 1 L nuclease free H2O 代替寡核苷酸作为阴性对 照 10 将反应体系室温放置连接 3 h 转化 E coli 采用常规方法检测阳性克 隆 注 可用酶切或测序进行检测 2 质粒转化酵母细胞 生成 Bait Reporter 酵母菌株 图 图 3 Bait Reporter 酵母菌株生成原理示意图 1 用 BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 L pBait AbAi pMutant AbAi p53 AbAi 质 粒 使其在 URA3 基因处断开 纯化酶切产物 2 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2 的步骤用 1 l 酶切后的质粒 转化 Y1HGold 酵母 3 稀释每个转化体系至 1 10 1 100 1 1000 分别取每个稀释物均匀涂于 SD Ura 琼脂平板上 3 d 后挑取 5 个单克隆 用 Matchmaker Insert Check PCR Mix1 进行 PCR 检测阳性克隆 用 Y1HGold 的单克隆做阴性 对照 4 在 PCR 管中加 25 l PCR grade H2O 5 用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆 以获得非常少量的酵母细胞 将枪 头伸进 PCR grade H2O 中搅拌 使酵母细胞散开 注 切忌挑取整个酵母单克隆 因为细胞过多会阻止 PCR 反应的进行 如果加入细胞后水变浑浊 证明加入了过多的酵母细胞 6 向每个管中加入 25 l Matchmaker Insert Check PCR Mix 混匀 离心 每个 PCR 管中现已含有如下反应物 Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 l H2O yeast 25 l 总体积 50 l 7 按下述程序进行 PCR 反应 95 C 1 min 98 C 10 s 55 C 30 s 30 cycles 68 C 2 min 8 取 5 l PCR 产物 用 1 的琼脂糖凝胶电泳分析 注 引物与 AbA 基因以及 URA3 下游的 Y1HGold 基因组结合 扩增片段长 约 1 4 kb 图 4 PCR 检测 pBait AbAi 的插入情况 正确的 PCR 检测结果应是 阳性对照 1 4 kb 阴性对照 无条带 诱饵菌株 1 35 kb insert size 9 分别挑取 PCR 检测呈阳性的诱饵克隆和 p53 AbAi 对照克隆 在 SD Ura 平板上划线培养 30 C 孵育 3 d 后 将平板置于 4 C 保存 即为新构 建的 Y1HGold Bait AbAi 菌株和 p53 AbAi 对照菌株 10 经过长期放置后 挑取单克隆在 YPDA 液体培养基中过夜培养 离心 收集菌体 用 1 mL 预冷培养基 100 ml 灭菌的 YPDA 与 50 ml 灭菌的 75 甘油混合 重悬菌体 速冻后与 70 C 保存 3 检测诱饵菌株 AbAr基因的表达 在不存在捕获物的情况下 由于克隆到 pAbAi 载体中的诱饵序列不同 诱 饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同 例如 p53 AbAi 对照的最低 aureobasidin A 抑制浓度为 100 ng ml 注 酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合 或者结合能力非常弱 因此在进行文库筛选之前 检测所构建的诱饵菌株 AbAr 基因的表达情况十分重要 所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵 菌株报告基因本底表达所需的 AbA 浓度 1 分别挑取诱饵克隆和对照克隆 用 0 9 NaCl 重悬细胞 调节 A600 到 0 002 大约 2000 个细胞 100 l 2 在下述培养基上分别涂布 100 l 重悬后的菌液 30 C 培养 2 3 d SD Ura SD Ura with AbA 100 ng mL SD Ura with AbA 150 ng mL SD Ura with AbA 200 ng mL 预期结果如下所示 表 1 AbAr基因预期本底表达结果 AbA ng mL Y1HGold p53 AbAi 克隆数Y1HGold pBait AbAi 克隆数 0约 2000约 2000 1000Bait dependent 1500Bait dependent 2000Bait dependent 3 在进行文库筛选时 使用 AbA 的浓度应为最低抑制浓度 或使用比最低 抑制浓度稍高的 AbA 浓度 高约 50 100 ng mL 以彻底抑制诱饵菌株 的生长 注 如果 200 ng mL AbA 不能抑制本底表达 可以尝试提高 AbA 浓度至 500 1000 ng mL 然而 在不存在捕获物的情况下 如果 1000 ng mL 的 AbA 浓度仍无法抑制 AbAr基因的表达 那么很可能存在能够识别并与目的序列结合 的内源调控因子 因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选 4 文库 cDNA 的合成 提取试材总 RNA 进行反转录合成 cDNA 合成的 cDNA 末端具有与 pGADT7 Rec 相同的酶切位点 1 cDNA 第一链的合成 准备高质量的 poly A 和 或总 RNA 用 human placenta poly A RNA 作为阳性 对照 注 RNA 的质量决定文库的质量 RNA 应为所要研究的特定时期和特定 组织的 RNA 在微量离心管中加入如下反应物 RNA 模板 0 025 1 0 g poly A 和 或 0 10 2 0 g 总 RNA 1 2 l CDS III oligo dT or CDS III 6 random 引物 1 0 l Deionized H2O 使总体积达到 4 0 l 1 2 l 总体积 4 0 l 在另外一支管中加入对照 cDNA 反应物 即 RNA 使用 1 l 1 g control poly A RNA 72 C 孵育 2 min 冰上放置 2 min 轻轻混匀 立即加入步骤 中的试剂 每一个反应加入如下试剂 轻轻混匀离心 5 first strand buffer 2 0 l DTT 100 mmol L 1 0 l dNTP mixture 10 mmol L 1 0 l SMART M MLV RT 1 0 l 总体积 5 0 l 注 步骤 中的试剂可在步骤 之前加好置于冰上 此步是 cDNA 合成的 起始关键步骤 变性后的 RNA 引物 mix 冰上放置的时间不应超过 2 min 如果用的是 CDS III 6 随机引物 25 30 C 保温 10 min 如果用的是 CDS III 引物 省略此步 进行步骤 42 C 保温 10 min 加入 1 l SMART III oligo 充分混合 42 C 保温 1 h 75 C 保温 10 min 终止第一链的合成 降至室温 加入 1 l RNase H 2 U 11 37 C 保温 20 min 12 cDNA 第一链合成产物应于 20 C 保存 可用 3 个月 2 long distance PCR LD PCR 合成 cDNA 第二链 根据合成 cDNA 第一链时使用的 RNA 量 下表给出了进行 LD PCR 时最 佳的热循环数 使用的热循环数越少 非特异性 PCR 产物越少 表 2 RNA 量与最佳热循环数 总 RNA gPoly A RNA g循环数 1 0 2 00 5 1 015 20 0 5 1 00 25 0 520 22 0 25 0 50 125 0 2522 24 0 05 0 250 025 0 12524 26 LD PCR 反应混合物中加入如下物质 每个样品做 2 个 100 l 体系 对照做 1 个 100 l 体系 First strand cDNA from protocol A 2 l Deionized H2O 70 l 10 advantage 2 PCR buffer 10 l 50 dNTP mix 2 l 5 RACE 引物 2 l 3 RACE 引物 2 l Melting solution 10 l 50 advantage 2 polymerase mix 2 l 总体积 100 l 按照以下程序进行 PCR 反应 1 个循环 95 C 30 s X 个循环 95 C 10 s 68 C 6 min 1 个循环 68 C 5 min 取 7 l PCR 产物用 1 2 的琼脂糖凝胶检测 检测时使用 1 kb DNA ladder 2 使用 CHROMA SPIN TE 400 柱纯化 ds cDNA 为每一个要纯化的 cDNA 样品准备一个 CHROMA SPIN TE 400 柱 将纯化柱翻转几次 充分悬浮 gel matrix 移去柱的顶盖和底盖 将柱放入 2 ml 收集管中 将柱放入离心机 700 g 离心 5 min 以消除平衡缓冲液 弃掉收集管中的液体 将柱放入新的收集管中 把 cDNA 加到 gel matrix 的中央 切勿使样品沿柱 的内壁流下 注 加到边上易使样品沿柱内壁流下 易混有小片段 cDNA 700 g 离心 5 min 纯化的 cDNA 收集到管中 将两个纯化的 cDNA 样品合并到一管 测量体积 加入 1 10 体积 3 mol L 醋酸钠 pH5 3 混匀 加入 2 5 倍体积无水乙醇 20 C 冰冻 1 h 室温 14000 r min 离心 20 min 小心弃去上清液 切勿碰到沉淀 14000 r min 瞬时离心 去除残留上清液 沉淀于空气中干燥 10 min 注 一般干燥至无乙醇味 不可过度干燥 否则很难溶解 用 20 l 灭菌去离子水溶解沉淀 此 cDNA 可用来进行同源重组构建文库 纯化后的 cDNA 用 1 的琼脂糖电泳检测 5 构建并筛选酵母单杂交文库 cDNA 融合表达文库的构建及筛选 1 构建并在 SD Leu AbA 培养基上检测 Y1HGold Bait AbAi 菌株 注 AbA 的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定 2 按 SMART technology 步骤合成 ds cDNA 其浓度为 2 5 g 20 L 3 用 Yeast Transformation System 2 的方法转化酵母 在转化体系中加入如 下物质 cDNA 文库转化 Y1HGold Bait AbAi 菌株 20 l SMART amplified ds cDNA 2 5 g 6 l pGADT7 Rec Sma I linearized 3 g Y1HGold 53 AbAi 的转化 5 l p53 fragment 125 g 2 l pGADT7 Rec SmaI linearized 1 g 将转化体系分别稀释至 1 10 1 100 1 1000 1 10000 后 各取 100 l 涂 100 mm 平板 文库转化涂 SD Leu 和 SD Leu AbA 平板 对照 p53 转化涂 SD Leu 和 SD Leu AbA200平板 4 将剩余的所有文库转化混合物 约 15 ml 涂在 150 mm SD Leu AbA 平 板上 每板涂 150 l 5 倒置培养 3 5 d 6 3 5 d 后 通过统计 SD Leu 100 mm 平板上的克隆数目来计算筛选的克 隆数 注 所筛选的克隆数至少应该达到 1 百万 否则会降低筛选到目的产物的 可能性 筛选的克隆数 cfu ml on SD Leu dilution factor resuspension volume 15ml 例如 resuspension volume 15 ml Plating volume 100 l 250 colonies grew on the 1 100 dilution on SD Leu plates The number of clones screened 250 cfu 0 1 ml 100 15 ml 3 75 million 7 预期结果 阳性对照试验 SD Leu 和 SD Leu AbA200培养基上的克隆数相近 文库筛选试验 根据 SD Leu 平板上的克隆数计算所筛选的克隆数 其结 果应大于 1 百万且 SD Leu AbA 平板上的克隆数远远少于 1 百万 阳性克隆数 目取决于诱饵序列 6 阳性克隆的鉴定及 cDNA 质粒的分离 1 阳性克隆重新划线培养 进行表型确认 将阳性克隆在 SD Leu AbA 培养基上重新划线 产生新的单克隆 2 4 d 后 选择能够正常生长的克隆进行后续分析 2 酵母克隆 PCR 消除重复克隆 用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 Cat No 630497 进行 PCR 对插入 到 pGADT7 载体中的 cDNA 片段进行扩增 PCR 管中加入以下反应物 Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 l H2O Yeast 25 l 总体积 50 l 按下述程序进行 PCR 反应 94 C 1 min 98 C 10 s 68 C 3 min PCR 产物在 1 的琼脂糖凝胶上进行电泳分析 产物不是单一的条带很正常 这表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体 注 为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段 用 Alu I 或 Hae III 或者其它常用的限制性内切酶消化 PCR 产物 产物用 2 的琼脂糖凝胶进行电 泳分析 如果大量的克隆含有同一插入片段 则另取 50 个克隆进行 PCR 分析 为了快速验证克隆 PCR 产物可经过纯化后用 T7 引物测序 3 阳性 cDNA 质粒的分离获取 酵母中文库质粒的分开 与转化的大肠杆菌不同 转化的酵母细胞可以含多种相关质粒 这就意味 着阳性克隆里不只含有能激活 AbAr报告基因的质粒 还可能含有一种或多种不 表达相互作用蛋白的 cDNA 质粒 如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通 过转化大肠杆菌获取质粒 那么很有可能获取到非相互作用的质粒 为了增加 获取阳性克隆捕获质粒的几率 可以将阳性克隆在 SD Leu AbA 培养基上重复 涂布 2 3 次 每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布 从酵母中获取阳性 cDNA 质粒 为了鉴定阳性互作相关的基因 用 Easy Yeast Plasmid Isolation Kit Cat No 630467 从酵母中获取阳性质粒 转化 E coli 并分离阳性 cDNA 质粒 用常用的克隆菌株对阳性 cDNA 质粒进行克隆 用 LB 加 100 g ml ampicillin 进行选择 4 鉴别阳性和假阳性互作 酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性 用以下标准可以区分阳性和假阳 性 阳性 正确的诱饵序列和捕获物都是激活 AbAr报告基因所必需的 假阳性 在诱饵序列突变的情况下 诱饵仍可以激活 AbAr报告基因 用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认 用 Yeastmake