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目 录摘要1关键词1Abstract1Key words 1引言11 酶活力的测定21.1 酶活力21.2 酶的活力单位21.3 酶的比活力21.4 酶活力的测定方法31.4.1 分光光度法 31.4.2 荧光法 31.4.3 同位素测定方法 31.4.4 电化学方法 32 酶联免疫吸附测定法（ELISA）及其应用32.1 酶联免疫吸附法的基本原理及特点32.2 ELISA 主要测定方法42.2.1 双抗体夹心法42.2.2 双位点一步法42.2.3 间接法测抗体42.2.4 竞争法42.2.5 捕获法52.2.6 应用亲和素和生物素的ELISA52.3 ELISA测量方法的改进及应用52.4 酶联免疫吸附分析法的应用实例63 其他的酶测定方法及其应用74 前景展望8致谢8参考文献8 酶及其在分析测定中的应用化学专业学生 张友云指导教师 张淑芳摘要：当今世界关于生物化学的研究越来越多，生命物质的特征本质也被提上日程，关于生物酶的研究方法也是多种多样。在酶促反应动力学中，PH、温度、激活剂对它们的活性影响；酶的作用机制和酶的调节研究得到了更多的关注；酶的活力测定研究日渐成熟，活力测定方法主要有分光光度法、荧光法、同位素测定法、电化学方法等；应用GlyPro酶法测定糖化血清蛋白(GSP)；探讨GSP的临床应用；应用胆碱酯酶生物传感器分析测定潜在的环境污染物等。酶联免疫吸附沉淀法(ELISA)的原理、特点、主要测定方法及其应用是目前分析化学领域中的前沿课题，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。关键字：酶的活力测定 GlyPro酶法 酶联免疫吸附沉淀法 胆碱酯酶 生物传感器 Enzyme and Its Application in Analysis and MeasurementStudent majoring in Chemistry Youyun Zhang Tutor Shufang ZhangAbstract：Nowadays ,the study of enzyme is worldwide.Determination of glycosylated serum protein(GSP) and other tests such as fasting plasma glucose(FPG). Many elements can affect the reaction ,such as PH, temperature ,activator,and so on. Enzyme mechanism and enzyme regulation get peoples much more attention;the study of enzyme activity is maturity day after day,the assay methods are such as: spectrophotometry , fluorometry, electrochemical method and so on;use the GlyPro method study the GSP;and study the clinical application of the GSP;use the Cholinesterase Biosensor study the potential pollutant and so on. The principle,characters , assay methods and applications of ELISA were inviewed in this paper.Key words: Enzyme activity；GlyPro；ELISA ；Cholinesterase；Biosensor；新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化，都是在酶催化下进行的。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，即没有酶参与生命活动一刻也不能进行。因此，从酶作用的分子水平上研究生命活动的本质及其规律无疑是非常重要的。1878年Kuhne才给酶一个统一的名词，即Enzyme,来自于希腊文，意思“在酵母中”。而后对于它的研究一直和它的催化作用的能力联系在一起。1926年，美国化学家从刀豆提取了脲酶并获得结晶，证明其有蛋白质性质。1930-1936年，Northrop和Kunitz得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结晶，并用相应的方法证明酶是一种蛋白质后，酶是蛋白质的属性才普遍被人们所接受。为此两人于1949年获得诺贝尔化学奖。随着科学技术的发展，人们发现了酶的氨基酸顺序，用X射线晶体衍射技术阐明了鸡蛋清溶菌酶的三维结构，人工合成了具有酶活性的胰Rnase,发现了具有催化功能的RNA核酶（这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶研究的新领域），研制成功抗体酶，这研究成果对酶学研究具有重要的理论意义和应用前景。随着DNA重组技术及聚合酶链式反应（PCR）技术的广泛应用，使酶结构和功能研究进入新的阶段。酶的催化作用与一般的催化剂有其共同点，但也有其特殊作用：一易失活，二具有很高的催化效率，三高度的专一性，四酶活性受到调节和控制，可以通过调节酶的浓度、激素、反馈抑制调节酶活性、抑制剂和激活剂等等。酶的专一性有结构专一性和立体异构专一性之分，得到的结论主要是酶和底物结构上的互补性。要对酶的性质和结构有进一步的研究，首先对于酶的活性做一下阐述。1 酶活力2的测定酶活力即酶的活性，酶的活力测定实际上是酶的定量测定，在研究酶的分离提纯、酶的性质和应用工作中都需要测定酶的活性。检查酶的含量及存在，不能直接用重量或体积来衡量，通常要用催化某一化学反应的能力来表示，即用酶活力大小来表示。1.1 酶活力酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率（reaction velocity 或reaction rate）来表示，两者呈线性关系。酶催化的反应速率越大，酶的活力越高，反应速率越小，酶的活力就越低。所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速率。酶催化的反应速率可以用单位时间内底物的减少量或反应物的增加量来表示。在酶活力测定实验中底物往往是过量的，因此底物的减少量只占总量的极少部分，测定时不易准确，而相反产物从无到有，只要测定方法足够灵敏，就可以准确测定。由于在酶促反应中，底物减少与产物增加的速率相等，因此在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。以产物生成量（或底物减少量）对反应时间作图。曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化，曲线上任何一点斜率都是相应时间的反应速率。曲线显示在反应开始的一段时间内斜率几乎不变，但随着时间的延长，曲线逐渐变平坦，斜率发生改变，反应速率逐渐降低，这时测得的反应速率不能代表真实的酶活力。引起酶促反应速率随时间延长而降低的原因很多，如底物浓度的降低;产物浓度的增加加速了逆反应的进行；产物对酶的抑制或激活作用以及随反应时间增长引起酶本身分子失活等。因此测酶活力应为初速率，避免上述因素影响。反应速率酶量呈线性关系，可以用初速率测制剂中酶的含量。1.2 酶的活力单位（U,activity unit）表示酶活力的大小即酶含量的多少。定义：在一定条件下，一定的时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。用每克酶制剂或与每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示(U/g或U/ml)。国际单位是规定：在最适反应条件下（25），每分钟内催化一微摩尔底物所转化为产物所需要的酶量为一个酶活力单位，即1IU=1 毫摩尔/min。酶的催化作用受测定环境的影响，要在最适宜条件下，即最适宜的温度、PH、底物浓度和缓冲液离子强度等，只有在最适宜条件测定才能真实反映酶活力大小。测时为保证是初速率，通常一底物浓度的变化在起始浓度的5%以内的速率为初速率。为准确底物浓度应足够大，整个反应对底物来说是零级反应。1.3 酶的比活力（specific activity）代表酶的浓度，用每mg蛋白质所含的酶活力单位数来表示，对同一种酶活力来说，比活力越大说明酶的纯度越高。 比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg可以用来比较每单位质量蛋白质的催化能力，经常使用。1.4 酶活力的测定方法5-9有两种方法：测定完成一定量反应所用时间和测定单位时间内酶催化的化学反应量，就是测定反应中产物增加量或底物减少量 ，主要根据产物或底物的物理或化学特性来决定具体酶促反应的测定方法，常用的方法主要有：1.4.1 分光光度法（spectrophotometry）这种方法主要利用底物和产物在紫外或可见部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应中反应进行的情况。优点是简便、节省时间和样品，可检测到nmol/L水平的变化。可以连续读出反应过程中光吸收的变化，是一种重要的方法，几乎所有的氧化还原酶都可以用此方法测定。由于此法有其独特的优点，可以把没有光吸收变化的酶反应，可以通过与一些能引起光吸收变化的酶反应偶联，是第一个酶反应的产物转化为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。1.4.2 荧光法（fluorometry）依据底物或产物的荧光性质差别来进行测定。因此方法的灵敏度比分光光度法的高若干个数量级，且荧光的强度和激发光的光源有关，所以应用越来越广，特别是在快速反应中。缺点是易受到其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸收和反射荧光，在紫外区尤为显著，因此应用时尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。1.4.3 同位素测定方法用放射性同位素的底物经酶作用后所得到的产物，经过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出酶的活力单位。优点时灵敏度极高，可达fmol或更高水平。已知六大类酶都可以用此方法。通常用于底物标记的同位素有3H,14C,32P,35S,和131I等。1.4.4 电化学方法（electrochemical method）pH测定法 最常用的是玻璃电极，配合一高灵敏度的PH计，跟踪反应过程中的H+的变化情况，用PH的变化来测定酶的反应速率。或用恒定PH测定法，在酶反应中，氢离子的变化可以用不断加入碱或酸来保持PH的恒定，用加入的碱或酸的速率来表示反应速率，可以测定许多酯酶的活力。另外用离子选择电极法测定某些酶的酶活力，用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应。此外还有一些方法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差，只是应用与个别酶活力的测定。2 酶联免疫吸附测定法4（ELISA）及其应用3酶联免疫吸附法 (ELISA) 是日前分析化学领域中的前沿课题 , 特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 2.1 酶联免疫吸附法的基本原理及特点： 酶联免疫吸附分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术主要的依据有三点：第一、抗原（抗体）能结合到固相载体的表面仍具有其免疫活性；第二、抗体（抗原）与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体（抗原）的含量。酶联免疫吸附分析法主要有三种测定方法：即间接法，抗体夹心法和竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品卫生分析。由于食品卫生分析中所测定的物质大都是低分子量的，但免疫动物产生抗体的抗原其分子量要求必须很大（至少 50000 ），因此，首先必须将小分子物质结合上高分子蛋白质，才能作免疫之用，而为了能使小分子物质结合上高分子蛋白质，则必须在小分子物质上导入一个活性基团，同时直接竞争法所需的酶标抗原的制备也需首先在小分子物质上导入一个活性基团。竞争酶联免疫吸附分析法具有灵敏度高、干扰小、简便、快速、操作安全、无污染、特异性很强和测试成本低等特点。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 2.2 ELISA4 主要测定方法ELISA是一种常规免疫学检测技术，操作简便易行并可以进行定量测定，是较为经济实用的方法，一般，ELISA多以可溶性物质为包被还原。它的主要测定方法是：双抗体夹心法,双位点一步法,间接法测抗体,竞争法 ,捕获法,应用亲和素和生物素的ELISA 。2.2.1 双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 2.2.2 双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 2.2.3 间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下 1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标样抗人IgG抗体。 4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 2.2.4 竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： 1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 2. 2.5 捕获法 测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： 1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 2.2.6 应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链亲和素（strepavidin）。 生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。亲和素生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。 另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素酶结合物，以放大反应信号。ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验。在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键。通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量。第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色。2.3 ELISA测量方法的改进及应用ELISA显色光度法的特异性和敏感性较好，是目前较为流行的SBMV检测法，但由于该方法采用传统的显色光度法作为检测方法，影响了该方法灵敏度的进一步提高。以生物酶作为标记物的伏安酶联免疫法是将酶催化反应、免疫技术和伏安法测定相结合的一种免疫分析法，目前有广泛的应用前景。例如，MAP-H2O2-HRP伏安酶联免疫分析测定南方菜豆花叶病毒13-14就是这一方法的应用实例，灵敏度明显提高，并且本体系以间氨基酚为底物，空白值较低，测定有力HRP的线性范围为1.0*10-51.0*10-4g/L，检出限为3.8*10-4g/L，酶促反应25min后即达到平衡，测定信号不再发生变化，有利于临床快速测定。成功的应用于SBMV的测定，检测下限比邻苯二胺显色光度法地5倍，且具有更宽的线性范围，样品基体对测定不产生干扰。本实验所用仪器是MP-1型电位溶出分析仪，三电极系统，滴汞电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，Philips8700 紫外可见分光光度计。实验过程采用标准免疫过程：加样洗涤伏安法测定。实验条件主要有偶合反应条件(在KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中的PH为6.26.6,表面活性剂采用增敏作用作用最强的Tween-40并且在37水浴中反应2min达到平衡，两小时内保持波高稳定)和伏安法测定条件(以BR缓冲液作为支持电解质)。2.4 酶联免疫吸附分析法的应用实例2： (1)黄曲霉毒素 B 1、 M 1 以及 T-2 毒素等的检测。黄曲霉毒素 B 1 的酶联免疫吸附分析法已列入国家标准方法的第二法（ GB/T500.922-1996 ）， F 1 毒素的酶联免疫吸附分析法已列入国家标准方法（ GB/T14933-1994 ），脱氧雪腐镰刀菌烯醇国家标准方法为 GB/T14929.5-1994 。 黄曲霉毒素 B 1 的酶联免疫吸附测定原理：利用固定相酶联免疫吸附原理，将 AFB 1 特异性抗体包被于聚苯乙烯量反应板的孔穴中，再加入样品提取液（未知抗原）及酶标 AFB 1 抗原（已知抗原），使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标 AFB 1 抗原结合的量 , 即样品中 AFB 1 多，则被抗体结合酶标 AFB 1 抗原少，颜色浅，反之则深，用目测法或仪器法与 AFB 1 标样比较判断样品中 AFB 1 的含量。最低检测浓度为 ：0. 01ug/kg ， 反应条件为：37 0.5h ，反应的过程为：样品提取 试剂制备免疫反应显色反应目视法、 仪器法结果判断 计算含量 。(2) 盐酸克伦特罗测定简介：测定的原理是抗原抗体反应，微孔板包被有针对兔 IgG （克伦特罗抗体）的抗体，克伦特罗抗体液加入，经过孵育及洗涤步骤后，加入 Clenbuterol 酶标记物，标准或样品溶液，克伦特罗与克伦特罗的标记物竞争克伦特罗抗体，没有连接的克伦特罗酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将无色的发色剂为蓝色的产物，加入反应停止液（ 1M 硫酸）使颜色有蓝转变为黄色，在 450nm 处测定，吸收光强度与样品中的克伦特罗浓度成反比。 克伦特罗（ Clenbuterol ）属于兴奋剂，一些年来，人们已经知道在畜牧生产中，适用于作改良剂，特别是改进脂肪型动物的肉与脂肪的比例或加速动物生长，然而直到现在这些化合物并没有被批准作为合法的加速生长调节剂，一些商家因利益驱使非法在饲料中添加“瘦肉精”盐酸克伦特罗，这给人民的生活带来了极大的安全隐患，盐酸克伦特罗主要残留在动物内脏一肝、肾、肺等，食用含盐酸克伦特罗的内脏会引起中毒。 (3) 真菌毒素的检测：黄曲霉毒素 B 1 、 M 1 以及 T-2 毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素 DON ），二乙酰草镰刀菌烯醇（ DAS ），玉米赤霉烯酮，赫曲霉毒素 A （ OA ）。 (4) 农药的检测：主要有除草剂与杀虫剂两大类，例如杀暝松（ FN ）、甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、草不绿（ Alachor ）、西维因（ Carbaryl ）、多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。(5) 以表面展示人源蛋白酶体亚基6蛋白的重组酵母细胞,结合酶联吸附免疫原理检测技术,以表面展示有人源蛋白酶体亚基6（proteasome subunit alpha6,PS6）的重组酵母细胞及其对应的单克隆抗体3D7D12D为研究对象,建立酵母酶联免疫吸附（yeast-ELISA）检测技术,应用于检测小鼠单克隆抗体及单抗效价.应用该方法最佳酵母浓度为0.50A600;测得单抗效价为15105,与常规ELISA效价接近;交叉试验和阻断试验表明该方法特异性强;同时该方法可用于检测抗血清.结果表明,yeast-ELISA可直接应用于检测单抗,测得效价与常规抗原包被间接ELISA具有良好一致性,特异性好,无交叉反应性. 其他类的检测：河豚毒素，植物毒素如罂粟碱、吗啡、藻类毒素，苯并芘，抗生素，激素类以及一些营养物质和食品添加剂如麸蛋白（ Gliaclin ），酱油蛋白（ Soy protein ），花生蛋白（ Peanut protein ），牛乳清蛋白（ Borine Whey Protein ）等。 随着食品工业的发展，对分析检测的要求越来越高，从而也使 ELISA 方法将更趋完善。一方面为提高 ELISA 方法的灵敏度和特异性，制备单克隆抗体的技术的发展，将和 ELISA 法互相结合，从而使食品卫生分析达到 DNA 分子结构水平，促使食品工业的健康发展。3 其他的酶测定方法及其应用(1) 应用GlyPro酶法自动分析测定糖化血清蛋白(GSP)10，本实验采用GlyPro12法，测定仪器为Bayer ADVIA 1650，此法为双试剂法，试剂1由蛋白酶组成，可将GSP分解为非糖化部分和糖化蛋白片段。糖化片段作为试剂2中一种特殊酶类酮胺氧化酶(KAO)的特异性酶解底物。HbAlc测定采用免疫透射比浊法，原理为：HbAlc和相应抗体反应生成可溶免疫复合物后，再加入聚半抗原，使和多余的抗-HbAlc抗体结合，形成免疫复合物，比浊法测定该复合物浓度，故HbAlc浓度越高，与聚半抗原结合的抗-HbAlc越少，吸光值越低。同时，用溶血剂使抗凝全血溶血后测定血红蛋白（Hb），所得HbAlc和Hb数值，求的HbAlc%。实验显示，GlyPro酶法检测GSP，无需预处理，810min出结果，具有良好的精密度和线性范围，使用于临床检验。(2) 过氧化氢的测定13在医学和环境分析中具有重要意义，其化学发光测定方法很多，但用过氧化物模拟酶来催化化学发光反应，测定过氧化氢的方法还很少。国内主要是北京大学慈云祥等合成了水溶性的金属卟啉，并作为过氧化氢模拟酶，进行了广泛、深入的研究。酞菁类化合物具有与卟啉相类似的母体结构，也具有过氧化物模拟酶的性质。我们已将四磺基锰酞菁在荧光分析中得到了成功的应用。化学发光实验表明，四磺基锰酞菁也能强烈的催化鲁米诺/过氧化氢体系的化学发光，结合流动注射技术，实现了对痕量过氧化氢的化学发光检测。该法的线性范围为4.0*10-32.0*10-5mol/L；检出限为6.8*10-9mol/L；对1.0*10-6mol/L的H2O2进行连续10次平行测定，相对标准偏差为2.4%。将此法应用于天然雨水中过氧化氢含量的测定，取得了满意的结果。(3)应用胆碱酯酶生物传感器分析测定有机磷及重金属等潜在环境污染物15 采用硝化纤维素为载体的固定化丁酰胆碱酯酶膜与银基汞膜电极耦合制的安培胆碱酯酶生物传感器。以该传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极组成双电极系统，用示波极谱仪接收电流信号。分析测定了有机磷（包括农用杀虫剂）和重金属等两类酶抑制剂，在较宽的浓度范围内示波电流值与抑制剂浓度的对数值之间具有良好的线性关系，最低检出限可达到2.0*10-6mg/L，上述酶传感系统可用于毒性评价和环境检测等领域。(4)干化学分析测定尿淀粉酶对急性胰腺炎诊断的临床价值14 急性胰腺炎是一种急腹症，必须及时作出正确的断。1929年Elman等发现血清淀粉酶升高对诊断急性胰腺炎有价值，使诊断有了可靠的客观指标，淀粉酶的测定便成为急性胰腺炎最常用也比较准确的测定方法，尿淀粉酶的测定因测定方法迅速简便而被作为急性胰腺炎首选的检查项目。一般而言，尿淀粉酶活力较正常高限大2倍以上才有意义，年龄性别对酶活力无影响。常用的碘一淀粉比色法方法虽然简单，但重复性不好，酶反应线性差，测定范围窄，高单位时往往误差较大，常困扰着临床的诊断与鉴别诊断，国内外专家在这方面做了大量的探讨。我们近1年来通过应用VitmsDT一60干化学分析仪测定尿淀粉酶，使用表明该法具有简便、快速、干扰因素少等优点，适应于急诊检验的需要。4 前景展望目前对于酶及其测定方法的应用的研究已经取得可喜成果，对于酶的活性测定分析已经非常成熟，确定了多种因素比如PH，温度，激活剂对酶的活性的影响，找到了适合酶最大活性的反应条件。人们预测，酶联免疫吸附沉淀法将会展现出广阔的发展空间和应用前景。应用酶可以合成许多具有生物活性的物质，在生命活动及环境研究分析中发生着重