分子生物学常用技术上

分子生物学常用技术 PCR产物 A T克隆 测序 重组表达载体 重组蛋白 制备抗体 转染细胞 1 PCR 2 核酸的纯化 凝胶回收Kit 3 连接反应 16 过夜 22 2h 4 CaCl2法制备感受态细胞 Kit 5 宿主菌的转化及蓝白筛选 6 挑克隆 2ml含抗生素的LB 7 提质粒 Kit 8 重组质粒的鉴定 双酶切反应 菌落PCR 9 测序 生物技术服务公司 10 菌种保存 20 30 甘油 LB 20 70 步骤 11 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 质粒转染 电转染 12 目的基因表达的鉴定 RT PCR NorthernBlot 原位杂交 SouthernBlot 13 目的蛋白表达的检测 原核表达 SDS PAGE 重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度 诱导时间和温度 重组蛋白表达的形式 WB真核表达 WesternBlot ELISA 免疫组化 14 重组蛋白的纯化 亲和层析 His tag GST tag 15 制备抗体 多抗和单抗 16 基因功能检测 提高 降低表达水平细胞周期检测 流式细胞仪细胞增殖检测 MTT细胞凋亡检测 流式细胞仪 TUNEL DNALadder抑瘤活性检测 体外 体内对血管化的影响 17 作用机制 实验XXX设备 加样器耗材试剂和配制方法 详细步骤 详细 1 核酸的分离纯化和鉴定 基因组DNA 总RNA 质粒2 基因的克隆与鉴定方法3 外源基因转移技术和表达体系4 检测方法 电泳技术 agarose SDS PAGE分子杂交 SB NB WB 基因芯片技术DNA序列测定生物信息学分析技术5 基因功能研究的方法6 组学研究技术 基因组学 蛋白质组学 内容 核酸的基本组成 AlbrechtKossel 1910年诺贝尔生理或医学奖 揭示核酸的化学成分 其对蛋白质 包括核物质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献 Lord AlexanderR Todd 核苷酸的基本结构 1957年诺贝尔化学奖 核苷和核苷辅酶 1962年诺贝尔生理或医学奖 发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义 DNA分子的二级结构 数量庞大dNTP dATP dCTP dGTP dTTP 3 5 磷酸二酯键 共价键 直线形多聚体方向 5 3 5 CAG 3 特点 DNA半保留复制 变性与复性 变性 指核酸双螺旋区的氢键断裂 变成单链 不涉及共价键断裂 不引起分子量降低 一 核酸的分离 纯化和鉴定基因组DNA的分离 纯化 PCR Southern blot 构建基因组文库实验材料 哺乳动物组织 50 100mg 哺乳动物细胞 5x105 107 六孔板 T25 实验步骤 RT匀浆 TEpH8 0组织 液氮冻存 研磨 消化 EDTA SDS 蛋白酶K RNase 37 55 抽提 酚 氯仿 异戊醇沉淀 异丙醇 NaAc 无水乙醇洗涤 75 乙醇干燥 风干溶解 TE H2O 注意事项 1 试剂 pH值准确 2 蛋白酶K 20mg ml 分装 20 避免反复冻融 3 抽提 完全 不要触及蛋白层 4 干燥 避免过分 5 操作 小心 机械剪切作用 80 100kb 2 总RNA的分离纯化 略 3 质粒 细菌等微生物细胞染色体以外 能独立进行复制和遗传 赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA分子 合格质粒的组成要素 复制起始位点 原核1个 真核多个抗性基因多克隆位点启动子增强子终止信号加polyA信号 第二步 筛选标记 如抗性 决定使用什么筛选标记 1 Ampr 水解 内酰胺环 解除氨苄的毒性 2 tetr 可以阻止四环素进入细胞 3 camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物 使之失去毒性 4 neor 氨基糖苷磷酸转移酶使G418 长那霉素衍生物 失活 5 hygr 使潮霉素 失活 如何阅读质粒 第一步 质粒类型 Ori位置 原核 真核 穿梭质粒 第三步 多克隆位点 内切酶位点 第四步 外源基因插入片段大小 10kb 大选大小找小 第五步 表达系统元件 启动子 核糖体结合位点 克隆位点 转录终止信号 克隆载体 表达载体 碱裂解法 Omega PlasmidMiniKitID6943 01 4 核酸纯度的鉴定 OD260和OD280应大于0 05 OD260 DNA RNA OD280 蛋白质 浓度 1OD260 50 g ml双链DNA40 g ml单链DNA 总RNA35 g ml单链RNA20 g ml单链寡核苷酸 纯度 OD260 OD280 蛋白质污染程度 DNA1 8 RNA1 7 2 1OD260 OD230 碳水化合物污染程度 2 0 二 基因的克隆与鉴定方法 基因的化学合成目的基因的克隆策略 1 根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因 2 根据表型变异克隆基因 3 基于图谱的基因克隆方法3 文库的构建与目的基因的克隆4 PCR反应与目的基因的克隆5 目的基因克隆的鉴别与分析 基因的化学合成前提条件 已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列适用 分子量较小 价值极高的目的基因历史 1979年 Khorana等首次合成Ecoli酪氨酸tRNA基因方法 磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法方式 固相合成法和自动合成法 2 目的基因的克隆策略 1 根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因a 一个基因的序列已知 PCR技术 目的DNA片段 b 一个基因的一段碱基序列已知 反向PCR RACE cDNA全长 探针 筛选cDNA文库 cDNA全长 c 一个或多个物种的某种基因序列已知 同源性比较 保守序列 探针 引物 文库筛选 PCR 从新物种中分离功能相似的基因 d 已知蛋白质的氨基酸序列 密码子的兼并性 可能的核苷酸序列 探针 筛选基因组 cDNA文库 基因序列 2 根据表型变异克隆基因 未知序列基因的克隆 转座子示踪技术 又称转座子标签法 酵母和植物 a 提总RNA 具有对比意义的两组 注意痕量DNA的污染b 反转录 得到细胞内所有基因的cDNA库下游引物 12组 T12MN M A C G N A C G T c PCR扩增 32P 35S上游引物 24 26组 10mer下游引物 同反转录共计288 312种PCR反应 mRNA差异显示 DD PCR 1992 只能分离与某种处理或特征有关的基因 步骤 d 电泳 测序胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶 放射自显影e 克隆 PCR差异带的回收 扩增和克隆f Northernblotting鉴定 排除假阳性g 序列分析 Blast 递交新序列h 全长基因 RACE或筛选cDNA文库i 基因功能研究 生物信息学 扩增条件 前1 4个循环采用不严格扩增条件 降低退火温度 增加引物与Mg2 浓度 促使引物与模板的错配 后续PCR循环则采用严格的扩增条件 基因片段的开放读框http www ncbi nlm nih gov gorf gorf html 氨基酸序列的功能结构域分析http www smart embl heidelberg dehttp www ebi ac uk interproscan ipsearch html 注意 a 与常规PCR不同 该方法可以保持样品中不同模板的相对比例 b 由于某一刺激因素常常影响数十 甚至数百基因的表达变化 但并不是每个基因的表达变化在此过程都起着重要的作用 c 电泳显示的单一扩增带并不表明它只含有单一的基因 优点 操作简单 敏感 快速 重复性好 要求的起始RNA量少 可同时检测某因素作用下表达升高与降低的基因 缺点 大规模地筛选 假阳性率高 得到的多为短片段 且都靠近3 端 发展 EDD ODD GDD LDD FDD 增强 有序 基因组 长程 荧光 消减杂交 又称扣除杂交 克隆差异表达的基因 3 基于图谱的基因克隆方法 依赖于遗传图谱和物理图谱 可以用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因 方法 染色体跳查 速度快 200kb片段染色体步查 40kb片段 举例 囊性纤维化跨膜传导调节蛋白 CFTR 囊性纤维化 常隐 亨廷顿病基因 HD 亨廷顿病 常显 肌营养不良基因 MD 肌营养不良症 X隐 3 文库的构建与目的基因的克隆 分类 按组成基因文库的重组DNA片段的供体来源分为两类cDNA文库 重组DNA片段来源于细胞表达出的mRNA 用于某类特定细胞中基因组的表达状态以及表达基因的功能鉴定的研究 基因组文库 重组片段供体是某种特定生物个体的基因组DNA 主要用于基因组物理图谱构建 基因组序列分析 基因在染色体上的定位 基因组中基因的结构和组织形式分析等方面的研究 基因文库 指采用体外克隆技术得到的一个重组DNA分子群体 1 cDNA文库 步骤 cDNA合成 连接到质粒 噬菌体载体上 转化或感染大肠杆菌 产生cDNA文库 cDNA copyDNA cDNA文库的筛选 2 基因组文库 概念 是由大量独立克隆形成的群体 指能够代表某种有机体整个基因组的一套克隆 步骤 DNA样品的制备 用限制性内切酶酶切基因组DNA 电泳分离回收约20kb的大片段 与限制性内切酶处理的载体连接 在体外包装成噬菌体颗粒 侵染大肠杆菌 文库的扩增 4 PCR反应与目的基因的克隆 发展历史基本原理反应体系常见类型建立PCR实验室 KaryB Mullis MichaelSmith PCR和定点突变突变 1993年诺贝尔化学奖 发明了聚合酶链反应 PCR 的方法 开创了基于寡聚核苷酸的定点突变方法及其在蛋白质研究中的发展 1 PCR发展史 1 1983年春 Mullis提出PCR的概念 2 1983年9月 Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做第一个PCR实验 只一个循环 3 1983年12月 同位素标记的10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断 4 1985年12月20日 Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文 方法中用了PCR技术 导致Mullis的文章到处被拒 5 1985年10月25日申请PCR专利 1987年7月28日批准 专利号4 683 202 这次Mullis是第一发明人 6 1986年5月 Mullis在冷泉港实验室做专题报告 全世界开始学习PCR方法 7 1986年6月 Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶 TaqDNApolymerase 这是1985年春天Mullis建议做的 8 1988年 第一台PCR仪问世 9 1991年 HoffmanLaRoche以3亿美元代价从Cetus公司获得全权开发权 10 1993年 Mullis获得诺贝尔化学奖 PCR和DNA重组技术一样意义深远 PCR仪的变迁 1 三个水浴锅 用手移动 Mullis等人当时用的 2 电加热块 自来水冷却 PE 1988 3 电加热块 内置循环液冷却 PE 1989 4 三个加热块 机械手 Stratagene 1994 5 半导体制冷和加热 MJ PE BioMetra Eppendrof 6 温度梯度 荧光检测 如Roche的Lightcycler 7 风加热8 Lab on chip式的PCR仪 所谓的芯片PCR 中国的状况1 1991年出现三个水浴锅 机械手原始PCR仪 华美 复日等 2 现在以半导体 Peltier板 制冷式为主 杭州博日 上海天呈 厦门安普利等 PCR相关的术语和产品 T vectorHotStartTaqRT PCRRAPD PCRDDRT PCRLM PCRInversePCRNestedPCRReal timePCRRACEFlowchipPCR TASMultiplexPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP PCRNASBARecombinantPCRAFLPSSCPInsituPCRTaqMan SYBRgreen 2 原理 模板变性 引物退火 DNA聚合酶进行DNA链延伸 PCR产物呈指数方式增加 25 30个循环 理论109分子 实际105 107 PCR产物生成曲线 log DNA Cycles PCR 3 4小时 特点 特异性 有效性 忠实性 1 操作简便省时 2 灵敏度高 3 特异性较强 但有一定的假阳性率 提高退火温度可以提高特异性 4 对原始材料的质量要求较低 5 有一定程度的单核苷酸错误掺入 因为TaqDNA聚合酶缺乏3 5 核酸外切酶活性 不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入 a 模板DNA 单链或双链DNA 避免DNA聚合酶抑制剂和能结合DNA的蛋白质污染 b 引物 人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸 0 1 0 5 mol L c Mg2 的浓度 反应产物的特异性和产量 1 5mmol L d dNTP 50 200 mol L 四种dNTP浓度相同 e Taq酶 Klenow Taq酶 高保真Taq酶 2 5U 100 l f 参数 94 5min 30 94 30sec 55 30sec 72 1min 72 7min 3 组成 10 TaqBuffer2 5 l引物 10 mol L 2 1 l H2O 管内总nmol数 10 ml dNTP 2 5mmol L 2 0 lH2O16 2 lTaq酶 0 5U l 1 3 l4 模板1 l 25 lPCR体系 PCRmix 存于 20 2 5mMdNTP80 l10 Taqbuffer100 lH2O648 l 25 l体系 20 l 反应15 l体系 12 l 反应 温度高 特异性高 2XMasterMix dNTP Taq酶 Taqbuffer loadingbuffer H2O7 l引物 10 mol L 2 1 lMasterMix10ul模板1 l Kit 天根生化 2XPfuMasterMix 加A尾 影响因素 模板 ng级的质粒DNA g级基因组DNA 引物 引物浓度不宜偏高 否则易形成引物二聚体 特异性Mg2 浓度 特异性及产量dNTPs浓度 正确性和产量Taq酶用量 非特异性循环参数 常规为25 30个循环 DNA聚合酶催化DNA链的延伸 DNA聚合酶的活性 大肠杆菌的DNA聚合酶 聚合酶 修复合成 不参与DNA复制 真核细胞的DNA聚合酶 DNA聚合酶 mt 应用 双链DNA的3 末端标记 TaqDNA聚合酶 Thermusaquaticus Cetus Roche TthDNA聚合酶 Thermusthermophilus Toyobo PfuDNA聚合酶 Pyrococcusfuriosus Stratagene DeepVentDNA聚合酶 Bio labs TflDNA聚合酶 Thermusflavus Promega TliDNA聚合酶 Thermococcuslitoralis Promega VentDNA聚合酶 Bio labs PwoDNA聚合酶 Pyrococcuswoesei Roche PfxDNA聚合酶 Thermococcuskodakaraensis Invitrogen DynazymeDNA聚合酶 Thermusbrockianus Finnazyme FDDNA聚合酶 Thermussterophilus 复旦大学 Tma Tne KOD 耐高温DNA聚合酶种类 1 长度一般为18 25个碱基 2 尽可能择碱基随机分布的序列 3 两条引物的G C的百分比应尽量相似 多为45 55 4 避免引物内部形成二级结构 5 两引物之间不应发生互补 特别是在3 端 6 引物3 末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率 最好选T G或C 而非A 7 引物5 端允许有一段序列不与模板配对 内切酶 保护碱基 引物设计 原则 软件 网站 第一步 查找目的基因序列 mRNA序列 NCBI GenBank 第二步 核酸内切酶位点分析 http www in 此处粘贴序列 第三步 选择载体 原核表达载体 His pET pRSETGST pGEX真核表达载体 pcDNA3 pcDNA3 1myc pCMV myc pcDNAmyc His pSecTag2HA pcMV HAFlagGFP pEGGFP N pEGFP C pIRES2 EGFPRFP病毒表达载体 pAdEasy His tag GGAGAA 1atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccaga451MNFQQRLQSLWTLAR1546cccttctgccctcctttgctggcgacagcctctcaaatgcagatg9016PFCPPLLATASQMQM30541gacgtagaagcagctctgaccaaagcccttggggaagtggacatt585181DVEAALTKALGEVDI195586cttctgacctggatgcagaaattctacaagctctga621196LLTWMQKFYKL 5 保护碱基 酶切位点 起始密码 目的基因5 末端序列3 1atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccaga451MNFQQRLQSLWTLAR15 上游引物 上游有标签读框 586cttctgacctggatgcagaaattctacaagctctga621196LLTWMQKFYKL 下游引物 反向互补 5 保护碱基 酶切位点 终止密码 目的基因3 末端反向互补序列3 下游有标签读框 1 T 2 A T 4 G C 3 52 T 22 1 46ln 3 5ln 2 GorC AorT 20 35nt3 T 81 5 16 6lg J 0 41 G C 600 l 0 63 FA J monovalentcationsl oligonucleotidelengthFA formamide14 70nt 温度高 特异性高 退火温度 图PCR产物电泳结果 1 5 Agarose 1 DNA相对分子质量DL2000 2 PCR产物 3 PCR空白对照 a 样品准备区 提取核酸 在没有DNA的干净环境中进行 PCR实验室 b 前PCR区 加样区 配制所用的试剂 c 后PCR区 反应后处理样品这一区域的所有试剂和仪器不能用于任何前PCR活动 a 阴性 无模板 阳性对照 阳性模板 b 配制PCR混合物 PCRbuffer dNTP H2Oc 控制污染 靶序列污染 气溶胶 注意事项 实验室分区 紫外线 距离1m 400 W cm2 照射 更换试剂 换仪器 换实验室 用另一套引物 用化学法修饰DNA 停试验 限制性核酸内切酶 识别DNA的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶 BamH 命名原则 EcoRI 发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用 1978年诺贝尔生理或医学奖 WernerArberDanielNathansHamiltonOSmith 按组织特点分类 GGCA 酶活性单位 一个活性单位 在适当的反应条件 1小时 完全酶解1 gDNA底物 限制性内切酶的量 标准的酶解反应 50 l反应体系 1U内切酶 最适反应条件 1小时 1 gDNA完全降解 单酶切 双酶切反应 30 l 37 2 4h 1 质粒2 5 质粒 2种内切酶3 DNA Hind 4 DL2000 迁移率 同样大小分子超螺旋 线性分子 缺口或松弛环状线性 缺口 影响因素 DNA 纯度 甲基化程度 分子结构缓冲液 pH值溶液 离子种类及浓度消化反应的温度反应体系中甘油浓度 星号活力 Star活力 改变酶反应条件 识别特异性降低 共性 甘油含量高 酶量不超过反应体积的10 1 30内切酶用量过大 100U gDNA 2 10U gDNA离子强度低 25mmol L 推荐BufferpH值高 pH7 5 8 5 EcoRI出现 pH7 0含有机溶剂 DMSO 乙酸等 DNA纯度二价阳离子 Mn Co Zn 等 Mg 诱发因素 BamH Hind 平端切口 粘端切口 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同 但切割DNA后 产生相同的粘性末端 称为同尾酶 这两个相同的粘性末端称为配伍未端 compatibleend BamH Bgl T4DNA连接酶16 12h4 12h室温15min 连接 BamH 切割反应 T4DNA连接酶 同一限制酶切位点连接 EcoR 切割位点 Bgl 切割位点 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似 不同限制酶切位点的连接 平端连接 EcoR 人工接头 互补现象 pUC系列质粒 lac操纵子 半乳糖苷酶氨基端 细菌 半乳糖苷酶氨基端缺陷型 蓝色菌落 外源DNA插入 白色菌落 半乳糖苷酶 缺陷型 蓝白筛选 a 大量扩增目的核酸片段b 检测基因的整合 表达情况c 在核酸中引入突变d 核酸测序e 克隆新基因f 生物多态性的研究 应用 医学领域 a 疾病基因检测 遗传病的产前诊断b 致病病原体的检测c 肿瘤治疗中癌基因的检测会推广到大部分疾病治疗前的检测d DNA指纹 个体识别 亲子关系鉴别 法医物证e 其他 动 植物检疫 转基因动植物检测 长片段PCR Taq酶 LATaq酶 5U 50 l反应 dNTP 2 5mM8 l延伸 5min循环 25 Hind 第一轮PCR 巢式PCR 模板数低 增加特异性扩增 提高扩增效率 需要两到三对引物 反转录PCR RE PCR 略 b 当突变位于基因的中间部位时 可以采用以下方法 研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要工具 定点突变 a 突变位点位于基因两侧 在引物中加突变碱基 方法一 方法二 定量PCR 普通PCR 对终产物进行定性和半定量分析 PCR产物的长度从100bp 数kb 定量PCR 实时检测每个循环扩增产物量的变化 通过Ct值和标准曲线对起始模板定量分析 PCR产物长度一般在60 150bps log DNA 不同样品有不同的生成曲线 非特异性 SYBRGreen 与DNA双链的小沟结合 双链时有荧光 单链时无荧光 特异性 Taqman 水解型杂交探针 5 端有报告基团R 3 端有荧光淬灭基团Q R和Q分开时有荧光 MolecularBeacon 分子信标 一端有荧光素 另一端有淬灭剂的发夹探针 环与目标序列互补 颈由互补配对序列组成 荧光标记试剂 SYBRgreen SYBRgreen 优点 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便 不必设计复杂探针 非常便宜 1 PCR反应缺点 容易与非特异性双链结合 产生假阳性 需要努力优化反应条件 对引物特异性要求较高 应用范围 起始模板测定 基因型分析 溶解曲线分析 TaqMan ABI公司1995年11月申请专利 应用范围 起始模板定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析 优点 对目标序列的特异性高 阴性结果确定 设计相对简单 与目标序列某一区域互补 重复性比较好 缺点 只适合一个特定的目标 委托公司标记 价格较高 不易找到本底低的探针 TaqMan MolecularBeacon MolecularBeacon 应用范围 起始模板定量 基因型分析 产物鉴定 SNP分析 优点 高特异性 是对目标序列检测SNP最敏感的试剂之一