加味益气聪明汤对VD大鼠行为学及单胺类神经递质的影响

加味益气聪明汤对VD大鼠行为学及海马区胆碱能神经递质的影响白雪彭艳（四川医科大学附属中医医院四川泸州646000）摘要目的：观察加味益气聪明汤对血管性痴呆(VD)大鼠行为学及大脑皮层单胺类递质5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）的影响。方法：60只实验大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组（简称“对照1组”）、复方苁蓉益智胶囊组（简称“对照2组”）、加味益气聪明汤组（简称“实验组”）。采用一次性永久性结扎双侧颈总动脉(2-VO)法制备VD模型;选用Morris水迷宫实验检测大鼠的行为学变化，选择荧光分光光度法测定大脑皮层区5-HT、DA、NE的含量。结果：与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期（EL）明显延长(P0.01)，经过有效区及平台的次数显著减少，平台及有效区停留时间明显缩短(P0.01)，模型组、对照1组、对照2组以及实验组大鼠皮层区NE、DA、5-HT含量减低(P0.01)；与模型组比较，对照1组、对照2组、实验组EL明显缩短(P0.05或P0.01)，经过平台及有效区次数明显增多，平台及有效区停留时间明显延长(P0.05或P0.01)，对照1组、对照2组、实验组大鼠皮层区NE、DA、5-HT明显增多(P0.01)。结论：加味益气聪明汤能提高大脑皮层区NE、DA、5-HT的含量，调节传递效能，从而改善大鼠学习记忆能力。关键词：加味益气聪明汤;血管性痴呆;行为学;神经递质TheeffectofJiaweiYiqiCongmingDecoctiononsynapticplasticityofhippocampalneuronsinRatswithVascularDementiaAbstractObjective:investigatingtheinfluenceofJiaweiYiqiCongmingDecoctiononbehaviorofVDratsandsurveyingtheimpactonthemonoamineneurotransmittersinthecerebralcortexs5一HT,DA,NE.Methods:dividingrandomlythe60maleSDratsintoshamoperationgroup,modelgroup,Nimodipinegroup(Thecontrolgroup1),Cistanchecompoundyizhicapsulegroup(Thecontrolgroup2),JiaweiYiqicongmingDecoctiongroup(Experimentalgroup).Theoperationgroupwithanoperationhasleftandrightcarotidarteryligation(CCA)forpreparingforVDmodel(CCA).ShamoperationgroupwithoutligationjustSeparatedandexposedbilateralcarotidarteryintheprocessofoperation.Detectingeachgroupbehaviormainlythroughthewatermazeexperiment;Detectingthedeterminationofcerebralcortexcontentof5-HT,DA,NEthroghthefluorescencespectrophotometery.Results:ToComparewiththeshamoperationgroup,theratsinthemodelgroupwhoseescapinglatency(EL)wereprolonged(P0.01),theplatformandeffectiveregionaltimeshortenedobviously,andthenumberofstridingacrosstheplatformandeffectiveareaweresignificantlyreduced(P0.01);thecontentofcortexNE、DA、5-HTinthemodelgroup、thecontrolgroup1、thecontrolgroup2andtheexperimentalgroupweredecreaseddistinctly(P0.01).ToComparewiththemodelgroup,theratsinthecontrolgroup1、thecontrolgroup2andtheexperimentalgroup,whoseELwereobviouslyshortened(P0.05orP0.01),Crossingthenumberofplatformandeffectiveareawereincreasedsignificantlyandthetimeofstayingontheplatformandtheeffectiveresidenceweresignificantlyprolonged(P0.05orP0.01),andthecontentofcortexNE、DA、5-HTwereincreasedvisibly(P0.01).Conclusion:JiaweiYiqicongmingDecoctioncanimprovethecontentofthecerebralcortexNE、DA、5-HT,AdjustthetransferefficiencytoimprovelearningandmemoryfunctionKeyWords:JiaweiYiqiCongmingDecoction;vasculardementia;synapticplasticity;protectionmechanism血管性痴呆（VascularDementia，VD）是因脑血管意外导致脑组织缺血缺氧性损伤无法纠正，从而致使智力脑区受损，最终促使认知功能发生障碍的一系列临床综合征。VD逐渐成为当前威胁老年人群健康及生存质量的主要疾病之一1，目前尚缺乏特殊疗法及药物。前期实验已证实2：复方制剂中重用风药可增加VD大鼠海马CA1区锥体细胞数目，以及对额叶皮层神经元MIT的形态具有改善作用，可以增强SOD活性、降低MDA的含量和改善VD大鼠的学习记忆能力。本实验在前期实验的基础上加用益气补肾的药物研究加味益气聪明汤对VD大鼠行为学及单胺类神经递质的影响，从而探讨其改善记忆能力的可能作用机制。1材料与方法1.1实验动物健康雄性SD大鼠，普通级，2月大，体重（24040）g，由泸州医学院动物房提供。1.2主要实验药品及仪器加味益气聪明汤（黄芪、人参、葛根、石菖蒲、远志、水蛭、地龙、菟丝子、女贞子、杜仲等），由泸州医学院附属中医院制剂室制备中药汤剂浓缩液,1ml浓缩液里含有约2.2g的生药量。尼莫地平片：20mg/片,山西亚宝药业,批号：20140328。复方苁蓉益智胶囊：0.3g/粒，辽源誉隆亚东药业，批号20141008。Morris水迷宫系统，5-HT标准品(Sigma美国)，DA标准品(Sigma美国)，NE标准品(Sigma美国)1.3制备模型一次性永久性结扎双侧颈总动脉(2-VO)法制备VD模型，大鼠术前禁食12h、禁水6h，1%戊巴比妥钠以3ml/kg腹腔麻醉，固定，剪毛，酒精消毒，铺手术洞巾，于颈部正中做切口，钝性分离出双侧颈总动脉（CCA），0号丝线双重结扎双侧颈总动脉，术后3d碘伏消毒伤口及周围皮肤。假手术组行颈正中切开，仅分离CCA但不结扎,随即缝合。筛选标准：最后一天假手术组大鼠逃避潜伏期（EL）的平均数为参考值，手术组各只大鼠与假手术组比较，P0.05者纳入实验。1.4动物分组与给药通过水迷宫实验选择学习记忆相近的大鼠60只，随机分为假手术组12只，手术组48只，采用双血管阻断法制备VD模型。术后一周进行Morris水迷宫实验，筛选出造模成功的VD大鼠，随机分为模型组、尼莫地平组（简称“对照1组”）、复方苁蓉益智胶囊组（简称“对照2组”）、加味益气聪明汤组（简称“实验组”）。尼莫地平组予以6.25mg/kg/d，复方苁蓉益智胶囊组予以0.375g/kg/d，加味益气聪明汤组予以14.58g/kg/d，均按所需剂量配制成2ml/d进行给药，模型组、假手术组予2ml/d蒸溜水灌胃,一共持续给药30天，1次/天。1.5皮层组织的采集断头处死大鼠后,迅速在冰浴上剥离大脑皮层，用4预冷的生理盐水洗尽血液,水分吸干后称重并记录,锡箔纸包裹后放入冻存管,放于-80的冰箱内保存待测。1.6检测指标在大脑皮层冰浴上按1:9(W/V)加入4oCPBS液,用手工匀浆器将标本匀浆化，制备组织匀浆，以2000转/分冷冻离心10min，收集上清液待测。严格按照试剂盒上的操作说明进行DA、NE、5-HT含量的测定。1.7统计学方法最终数据采用SPSS17.0软件进行分析,采用均数士标准差（S）描述计量统计资料,方差分析选用单因素分析方法(one-wayXANOVA),方差齐的采用两两比较用LSD-t法，方差不齐的采用TamhanesT2选项。检验水准=0.05，P0.05以及=0.01，P0.01为差异有统计学意义。2结果2.1行为学变化定位航行试验：与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期（EL）明显延长，差异有统计学意义(P0.01)，对照1组、对照2组及实验组EL有所延长，但差异无统计学意义（P0.05）；与模型组比较，对照1组、对照2组、实验组的EL明显缩短,差异有统计学意义(P0.05或P0.01)；与对照1组比较,对照2组、实验组大鼠EL稍延长，差异无统计学意义(P0.05）；与对照2组比较，实验组EL稍变短，差异无统计学意义(P0.05，见表1）。空间探索实验结果：与假手术组比较，模型组大鼠在平台及有效区停留时间缩短明显,经过平台次数、有效区次数明显减少,差异有统计学意义(P0.01)；与假手术组比较，对照1组、对照2组及实验组大鼠平台停留时间明显缩短，经过有效区的次数减少，差异有统计学意义(P0.05或P0.01),在有效区停留时间稍有缩短，经过平台次数稍有减少,差异无统计学意义(P0.05)；与模型组比较,对照1组、对照2组及实验组大鼠平台及有效区停留时间延长,经过平台及有效区次数增加显著,差异有统计学意义(P0.05或P0.01)；对照1组、对照2组、实验组两两比较，平台停留时间、有效区停留时间及经过平台与有效区次数均有变化,但差异无统计学意义(P0.05见表2)。表1治疗后各组大鼠逃避潜伏期时间变化（n=12，XS）Table1thechangesofescapelatencyofratsafterposttreatment（n=12，XS）分组例数第一天第二天第三天第四天第五天假手术组1215.4224.3311.2614.837.315.436.896.476.225.00模型组1231.3728.0429.5932.0928.9934.3428.8238.3127.8727.71对照1组1217.4116.3717.0916.8916.5215.8412.5612.0410.5710.99对照2组1217.4517.0115.1816.7915.0015.3814.6513.2312.6114.32实验组1219.7822.4115.4514.1914.6816.6213.5217.8011.2311.19F值2.1163.1724.7174.4667.479注：与假手术组比较，表示P0.01,表示P0.05；与模型组比较,表示P0.05，表示P0.01；与对照1组比较，表示P0.05；与对照2组比较，表示P0.05。表2治疗后各组大鼠经过平台、有效区次数以及停留时间变化（n=12，XS）Table2thechangesofthetimespentintargetplatformandeffectiveregionaltimeandthenumberofacrossvirtualplatformandeffectiveregionaltimeafterposttreatment（n=12，XS）分组例数（n）平台停留时间（s）有效区停留时间（s）经过平台次数（次）经过有效区次数（次）假手术组1214.015.1734.634.9912.293.5013.143.72模型组123.251.6014.992.462.401.145.601.34对照1组128.723.4533.5814.339.505.799.821.83对照2组128.666.1930.557.668.273.048.641.63实验组128.865.0731.279.599.274.749.002.66F3.6323.7544.8248.105注：与假手术组比较，表示P0.05，表示P0.01，表示P0.05；与模型组比较,表示P0.05，表示P0.01；与对照1组比较，表示P0.05；与对照2组比较，表示P0.05。2.2皮层区单胺类神经递质检测与假手术组比较，模型组大鼠皮层区5-HT、DA、NE含量均明显降低（P0.01）；对照1组、对照2组及实验组较假手术组大脑皮层区5-HT、DA、NE显著降低（P0.01）。与模型组比较，对照1组、对照2组及实验组皮层区5-HT、DA、NE含量均明显增高，（P0.01）。与对照1组比较，对照2组皮层区5-HT、DA、NE含量均有所降低（P0.05或P0.01），实验组较对照1组皮层区5-HT、DA、NE含量均稍有降低（P0.05）。与对照2组比较，实验组皮层区5-HT、DA、NE含量均稍有增高（P0.05，见表3）。表3大脑皮层区5-HT、DA、NE含量变化(n=10,XS)Table3Thechangesof5-HT、DA、NEinthecerebralcortex(n=10,XS)组别N5-HT含量(ng/L)DA含量(pg/ml)NE含量(ng/L)假手术组10374.5119.1915.590.18195.553.78模型组10248.5317.6810.040.54134.025.81对照1组10335.6213.3013.260.44168.607.39对照2组10314.5913.2512.220.36158.707.85实验组10318.9114.5312.570.12164.398.97F36.76573.1928.979注：与假手术组比较，表示P0.01；与模型组比较,表示P0.01；与对照1组比较，表示P0.05，表示P0.01,表示P0.05；与对照2组比较，表示P0.05。3.讨论Morris水迷宫是目前公认的客观评价学习记忆功能的方法3,4，行为学检测是验证VD药物治疗的基本药效学指标,其行为学变化主要表现在学习记忆能力减退以及认知功能的减退，故可选择Morris水迷宫来评价大鼠的学习记忆能力。研究表明，脑组织内的单胺类神经递质与记忆的形成和保持密不可分，它主要包括5-HT、NE、DA，在正常生理功能情况下，三者的分泌及代谢均保持着一定的水平,并且它们之间相互制约协调,从而维持稳定的功能。5-HT可维持人体正常的智力,合成于神经元突触末梢,在大脑皮质、海马等区域广泛存在,维持大脑不同区域的突触联系,可促进神经元的分化作用,在调节大脑的智能方面具有重要的作用5,6。去甲肾上腺素(NE)也参与了中枢的学习记忆功能,它可通过对突触传入活动的调节作用，减少干扰刺激的传入，保证有效的信息量,经过择优劣汰的方法整理信息,因而更好地记录与保存有效信息7。多巴胺(DA)主要由多巴和酪氨酸合成,在多巴胺p-羟化酶(DBH)的作用下可转化成去甲肾上腺素，可作用于与学习、记忆、思维等密切相关的神经元,在学习和记忆过程中起着关键性作用，是中枢神经系统中重要的儿茶酚胺类神经递质，通过相应的膜受体发挥作用，在突触可塑性、行为学以及学习相关的基因表达中发挥作用8。大多数医家从“补肾活血”着手治疗VD，因此，本实验选用“复方苁蓉益智胶囊”作为中药阳性对照组。它主要由王永炎院士研发且已经上市的中成药，对痴呆患者认知功能有明显的改善作用，具有补肾养肝，化浊活血，益智健脑的作用，主要药物有制首乌、荷叶、肉从蓉、地龙、漏芦等。复方苁蓉益智胶囊作为中成药已广泛应用于临床，取得了一定的疗效，故本次实验选用复方苁蓉益智胶囊作为中药阳性对照9。加味益气聪明汤是导师白雪教授在继承全国名老中医王明杰教授玄府理论学术思想上以及长期临床工作中总结治疗VD的经验方，主要有开通玄府、益气活血化瘀、补虚达神治疗VD，充分体现了风药增效、补虚达神之意10。现代药理学研究表明，人参内的GSRb1、GSRb3、GSRg1通过对皮层神经细胞的保护作用,减少神经细胞的损伤11；GRS和GSLS通过增加海马、皮层等部位5-HT、DA、NE的含量,改变脑内胆碱能神经功能12；地龙提取物通过改善神经元突触的形态结构，调整中枢内神经递质的释放13等途径改善VD大鼠的学习记忆能力。本实验以加味益气聪明汤治疗VD大鼠，实验组大鼠在D1-D5EL显著缩短，同时经过平台及有效区次数、平台及有效区停留时间均明显延长，与模型组比较，差异有统计学意义（P0.05），与对照1组、对照2组的效果相同（P0.05）。实验组皮层区皮层区5-HT、DA、NE均有升高，与模型组比较，差异有统计学意义（P0.01）,与对照1组、对照2组效果相同（P0.05）。说明加味益气聪明汤能增加大鼠皮层区5-HT、DA、NE的含量，从而改善大鼠的学习记忆能力，起到治疗VD的目的。但其具体作用机制及途径尚不清楚，希望在未来的研究中能进一步补充及完善。参考文献1DinizBrenoS,ButtersMerylA,AlbertStevenM,etal.Late-lifedepressionandriskofvasculardementiaandAlzheimersdisease:systematicreviewandmeta-analysisofcommunity-basedcohortstudies.J.Mentalsci,2013;202(5):329-335.2白雪,钱海霞,唐红梅,等.祛风通窍方对血管性痴呆大鼠血液流变学及神经元细胞的影响J.泸州医学院学报,2013,36（