【毕业学位论文】（Word原稿）海人酸致痫大鼠中神经肽Ghrelin与Nesfatin1表达变化及其意义的研究-癫痫的临床与实验研究

宁夏医科大学硕士研究生学位论文 前言 - 1 - 前 言 癫痫是人类最常见的神经系统疾病之一。据世界各地流行 病 学调查 结果显示 ，癫痫患病率在 15 ，一般为 46 。国内最新统计资料显示，我国癫痫患病率为 7 ，活动性癫痫患病率为 ，年发病率为 0万人，据此估算目前我国约有 900万左右的癫痫患者，同时每年新增加患者人数约 40万人 1。若癫痫患者能在医院或专科医师指导下正规服用抗癫痫药物， 70%80%患者经治疗后发展可得到完全控制或显著减少，从而能正常工作、学习或社会，但仍有 20%30%患者虽经正规的各种药物治疗仍难以控制，长期 频繁发作，使患者导致不同程度的精神或社会心理学障碍，给家庭、社会带来严重经济和技术负担，这还有待于临床医师和基础科研工作者共同的努力 2。 癫痫由于其发作 具有不可 预见 性 ，发作 时 的程度不能 由 人为控制，而发作部位又 位于机体 的中枢神经系统， 因 而给直接研究带来 极大地 困难， 所以 建立 癫痫 实验性动物模型，对于癫痫 疾病 发生机制 的研究、 癫痫 诊断和 治疗策略 的探讨、 抗癫痫药物的 筛选和评价 ， 都 具有 十分 重要 的 意义。 但迄今为止， 人们使用 的 100多种癫痫 动物 模型，尚无一种能完全模拟 出 人类 难治性 癫痫（ 所有临床、病理、生理学特征 2。 海人酸 (点燃模型作为一种经典的癫痫动物模型， 具有慢性、自发性、可复发性的特点， 能 从行为学和脑电上 最大程度上 的模拟人类复杂部分性和继发性全身强直阵挛发作，被认为是 较为理想的研究难治性颞叶癫痫的工具 3。 尽管目前对于该模型的 点燃 特征、药物反应 及 致痫机制等方面 已有较多的 国内外报道，但大多 都是采用系统给药（静脉或腹腔内注射）方式制备，偶有局部给药（脑室内、单侧或双侧海马、杏仁核、纹状体等）的报道 4。 神经肽存在于脑和几乎所有的周围 神经组织， 在生物进化中作用广泛， 扮演 着 神经激素、神经递质、神经调质和细胞因子等多种角色， 对 机体发育的各个阶段 的 生理功能都 起重要的调控作用 5。 随着 多肽化学、放射免疫测定、免疫组织化学技术的发展，特别是 近年来 分子生物学技术的 飞速 进展，大大促进了 对 神经肽的研究， 它已经 成为近二三十年来神经科学中进展最快、成果极丰硕的一个前沿 领域 。 在这其中， 对 于 癫痫发生、发展与神经肽类物质 的 关系 也在进行着 不断深入 地研究 ，人们 逐渐 认识到： 癫痫在其发宁夏医科大学硕士研究生学位论文 前言 - 2 - 生、发展的过程中，除了神经元的明显病理改变外，还反映在细胞形态、数量、代谢活动等 内分 泌 方面的异常， “ 癫痫发作时，机体内神经肽 水平会发生短暂而显著的 改变 ”已成为共识 6，而这些可以影响脑功能代谢和神经兴奋性的改变能否成为一种新的癫痫诊 治 与 疗效 评估方法，也 是 近年来的研究热点。 最新 发现的 对于人体自身摄食和能量平衡调节起着重要作用的两种神经肽 ， 人 2008年的研究发现它们与癫痫的发作程度和治疗效果存在着密切的关系 7。但目前此方面尚缺乏许多对重要问题的深入研究和分析，而且现有的实验结果也不尽相同，甚至存在截然相反的结论。 本研究 以 鼠 杏仁核 为靶点，应用 立体定向 技术， 注射微量 功建立复杂部分性癫痫动物模型，观察 致痫大鼠 行为学、脑电图和病理学改变特点 ；在动物模型基础上，统一实验条件，控制影响因素， 采用免疫学的经典方法 ， 联合观察神经肽 大鼠致痫后未治疗与治疗过程中的变化特征，初步探讨其在癫痫诊治和疗效评估中的作用 和意义， 以期在 癫痫诊治和疗效评估中建立更为便捷、敏感的 方法，为更深入的研究癫痫发病机制提供理论依据。宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 3 - 材料与方法 型的制作 料 验动物 清洁级 68 周龄雄性 D)大鼠 96 只 ， 体重 250宁夏医科大学实验动物中心提供。所有大鼠 均在单笼饲养， 避强光、避噪音、自由进食水。 饲养一周后， 将大鼠分别称重， 按 体重由小到大排列，编为 196 号，根据随机数字表取得随机数，再将随机数 由 小到大编 列为 序号（数字相同的按先后顺序排列）， 依次分为海人酸致痫后生理盐水灌胃组（ ）和海人酸致痫后丙戊酸镁灌胃组（ 两组又各分为 3h、 6h、 12h、 24h、 3d、 7d、 14d 七个时点亚组，每时点 6 只。同时设 立空白对照组和假手术对照组，每组均 6 只。 排除标准：每 2 天准确测量一次大鼠体重和鼻 式计算肥胖指数： 体重 （ g） x 1000/身长 （ 1/3；凡高于或低于平均值 20%者，从实验组中排除 8。 要实验试剂与仪器 海人酸：美国 司，货号： 格： 10 双 蒸馏水：宁夏医科大学实验中心提供 戊巴比妥钠：广州思乐实验化工有限公司分装，货号： 格： 25g； 无水乙醇：安徽安特生物化学有限公司，生产批号： 0610093602， 规格： 500 75%乙醇：安徽安特生物化学有限公司，生产批号： 0611083803， 规格： 500 自凝牙托粉：上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂，生产批号： 200712； 自凝牙托水：上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂，生产批号： 200722； 生物胶：美国 司，货号： 丙戊酸镁：湖南相中制药公司，生产批号： 国药准字 格： 60 片； 验仪器 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 4 - 多通道生理记录仪： 号： 脑立体定位仪： 号： 柔性颅骨钻： 号： 漆包镍铬电极：上海鼎阜金属材料有限公司 ， 直径 冷光四孔手术无影灯：广东汕头医疗器械厂 。 其他器械：手术刀、 手术刀片、止血钳、眼科剪、 持针器、弯针、角针、碘酒，酒精、棉球、取暖灯、有机塑料箱、 25菌注射器、无菌手套等，由宁夏医科大学颅脑重点实验室提供。 验方法： 将 于无菌生理盐水中，浓度 巴比妥钠 (65mg/醉大鼠，于脑立体定向仪 上 固定大鼠头部， 75%乙醇 消毒 局部 皮肤，正中 纵形 切 开大鼠头皮 约 1 向两侧分离 皮肤、皮下组织和骨膜，创面止血 ，充分 暴露颅骨及前后囟。按照大鼠脑立体定位附图谱 9， 10： 所有大鼠均以右 侧 额 部 （前囟前 开 左侧小脑（前囟后 12开 膜下 为皮层记录电极和参考电极，电极与生理记录仪连接好后，用 5鼠 的杏仁核 部位 （前囟后 开 膜下 入 1） ， 于 10 15注射完毕，停留 5拔针，牙科水泥将插件固定在颅骨表面。空白对照组仅安放电极，不进行立体定向注射。 假手术对照组同等条件下注入生理盐水 l。 术后 持续 观察大鼠 肤色、 呼吸 和 心率 变化 1h， 各项指标 均无异常后 ，将鼠放回 单笼 饲养，连续观察 4周。 型建立后药物灌胃治疗： 痫成功的大鼠分为两个亚组，分别于术后第二日开始用大鼠专用灌胃针经口腔灌注生理盐水和丙戊酸镁，每日 1 次，总剂量为 250d)。 2. 致痫大鼠的 行为学观察和脑电图监测 观察 痫 大鼠中 的 行为学 变化 ，根据 评分标准 划分 发作级别 11： 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 5 - 0 级：脑电图记录有发作波形。而没有抽搐动作； 1 级：咀嚼、眨眼、立须等面部肌肉的抽搐； 2 级：以点头运动为主的颈部肌肉的抽搐； 3 级：单侧前肢的阵挛、抽搐； 4 级：双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起； 5 级：双侧后肢强直，身体背曲强直，站立、跌倒伴全身阵挛。 致痫大鼠达到以下两个条件视为模型成功： (1)连续出现 级以上发作超过 3次； (2)脑电图出现正常背景上的棘波、棘慢波和尖波改变 12。 从开始刺激至试验结束，进行大鼠 自由活动状态 时脑电图监测。 3. 大鼠灌注 采集标本 要实验试剂 4%多聚甲醛：武汉博士德生物工程有限公司，产品编号： 格： 500 磷酸氢二钠：天津市光复科技发展有限公司，生产批号： 20080509，规格： 500g； 磷酸二氢钠：天津市光复科技发展有限公司，生产批号： 20080212，规格： 500g； 蔗糖：天津市凯通化学试剂有限公司，生产批号： 20080816，规格： 500g； ：西安百灵克科技有限公司，生产批号： 82590678，规格： 100g； 化钠注射液：宁夏启 元国药有限公司，生产批号： 080812格： 500 盐酸：成都市科龙化工试剂厂，生产批号： 2008113，规格： 500 氢氧化钠：成都市科龙化工试剂厂，生产批号 ： 20080419，规格： 500 固定液的配置（ ：磷酸二氢钠 馏水 1000：磷酸氢二钠 馏水 750；： 4%多聚甲醛 44g+蒸馏水 550氧化钠 1g+。 验仪器 普通电子天平：余姚市金诺天平仪器有限公司，型号： 精密 电子天平：梅特勒 海）有限公司，型号 ： B/T 5374 4 、 冰箱：青岛海尔股份有限公司，型号 ： A； 实验室 特勒 海）有限公司，型号 ： 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 6 - 数显恒温磁力搅拌器：常州国华电器有限公司，型号 ： 78 式高速离心机：上海力康发展有限公司，型号： 0802634A； 离心管：福州迈新生物技术开发有限公司，型号： 格： 磁力搅拌器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号 ： 注取材 致痫各组 大鼠 按实验设计时点在药物灌胃后不同时间、空白对照组和假手术对照组在统一时间 处死： 均以戊巴比妥过深麻醉后，先自鼠尾静脉采集鼠血 2后剪开胸腹腔，暴露心脏、肝脏，灌注针由左心室进针，穿入主动脉，止血钳固定，剪破右心耳，快速灌注生理盐水 200洗血液，随后用配置好的固定液先块后慢固定 30 40 分钟，灌注结束后开颅取视乳头至丘脑之间的脑组织。 所采集的血液在室温自然凝固 1020，离心 20右 ( 20003000r/收集上清液，置于 存。脑组织以常规石蜡包埋，自视交叉处连续冠状切片，片厚 6m，将切片置于经防脱片剂处理过的载玻片上，置烤箱 60过夜， 4保存备用。 4. 放射免疫方法（ 测血清 量 验原理 放射性同位素标记抗原和未标记抗原一起加入相应的抗体时，两种抗原产生相互的竞争，而生成有标记的抗原 抗体复合物，它们在一定的限度内呈反比，利用这个原理测定未知的抗体。 要实验试剂 剂盒：美国 物试剂公司，产品编号： 格： 125管，检测范围： 10 试剂盒内提供： 冲液（ 4 倍浓缩） 50准品冻干粉 抗 血清冻干粉 13125干粉 抗兔 体血清冻干粉（ 13常兔血清 (13存。 验仪器 智能放免计数测量仪： 上海原子核所日环光电仪器有限公司 ，型号： 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 7 - 微量 移液器：武汉博士德生物工程有限公司，型号： 格： 540 移液器吸头：武汉博士德生物工程有限公司，型号： 格： 1 （ ）：武汉博士德生物工程有限公司，型号： 格： 2 剂的配置 准品稀释梯度的配置 将 准品用 冲液溶解，取 10 990冲液稀释，浓度为 128，000pg/为标准系列 0 点。再取八只试管，分别编号为 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、H，自 0 管中取 10入 A 管，用 990冲液稀释， A 管浓度为 1280pg/余各管加 500冲液。从 A 管中取 500到 B 管，摇匀；从 B 管中取 500到 C 管，摇匀；重复以上倍比稀释操作直到 H（表 1）。 25释配置：每瓶用 13 冲液溶解，加样前摇匀。 释配置：每瓶用 13 冲液溶解，加样前摇匀。 释配置：每瓶用 13 冲液溶解，加样前摇匀。 验步骤 分别标号为 白管）、 准管 )、 微量加样器加样； 加 冲液 200 0管分别加 冲液 100 释标准品 100 测样品管分别加血清样品 100 管充分摇匀，放入 4温育箱孵育 24 小时； 育后取出，各管分别加 12500 管充分摇匀，放入 4温育箱孵育 24 小时； 育后取出，各管分别 0000 分摇匀后，室温放置 90 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 8 - 管加入 500冲液后， 1700r/心 20弃上清液； 能放免计数测量仪内计数各管每 射性粒子数（ 能放免软件分析系统计算 浓度。 5. 酶联免疫吸附方法（ 测血清 量 验原理 将 体包被于微孔板中，制成固相载体，向微孔中依次加入标 准品和样品，其中的 连接于固相载体上的抗体结合，洗板之后加入生物素化的体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入 记的亲和素，再次彻底洗涤后加入底物（ 色。 过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色。颜色的深浅与样品中的 正相关，用酶标仪在 450计算样品浓度。 要实验试剂 剂盒：美国 物试剂公司 ，产品编号： 格：96 孔，检测范围： 1 试剂盒内提供：酶标板（ 8 12）；浓缩洗涤液（ 20） 25准品（ 1000ng/1瓶；抗 体 2 瓶；生物素化 瓶；酶标抗体（ 1 瓶；阳性对照 1 瓶；底物（ 1 瓶；终止溶液 1 瓶； 存。 验仪器 标仪： 北京测迪科技有限公司 ，型号： 剂的配置 准品稀释梯度的 配置 取试管六只，分别编号 A、 B、 C、 D、 E、 F，依次加入 450物素化 50准品加入 A 管，混匀后浓度为 100ng/ A 管中取 50到 B 管，摇匀；从 B 管中取 50到 C 管，摇匀；重复以上倍比稀释操作直到 F（图 2）。 涤液的稀释配置：取 20缩洗涤液（ 20）加 380馏水配置成为 400 材料与方法 - 9 - 洗涤液（ 1） 验步骤 每孔加入抗 体 100 加 冲液 200温下孵 育 去溶液，每孔加入洗涤液（ 1） 200置 30s 后甩尽液体，在厚叠吸水纸上拍干。洗板 5 次； 相应的孔中分别加入标准品、阳性对照和样品各 100温下孵育 去溶液，洗板 4 次； 每孔加入 100轻混匀，室温孵育 45 去溶液，洗板 5 次； 每孔加入 100处室温下孵育 30 每孔加入 50止液，确定蓝色变为黄色，立即在 标仪450读数； 半对数纸上作出标准曲线图，根据样品的 计算计数处相应的 3）。 6. 石蜡切片制作 要实验试剂 多聚赖氨酸（ 福州迈新生物技术有限公司，产品编号： 格 10 二甲苯： 洛阳昊华化学试剂有限公司，批号： 061204，规格： 500 固体石蜡：沈阳圣丰石蜡制品有限公司 ， 产品编号： 验仪器 石蜡轮转切片机：沈阳誉德电子仪器有限公司，型号： 自动磨刀机：上海医械模具厂 ， 型号： 自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂，型号： 电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司，型号： 210765； 电热恒温水热箱：北京长源实验设备厂，型号： 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 10 - 号： 验步骤 玻片的处理 载玻片泡 入 酸 内 48小时， 用流动的 自来水冲洗，蒸馏水 短时 浸洗 后 烤箱烤干，逐片放入 洗 ，置电热恒温鼓风干燥箱中晾干。再入蒸馏水中洗去残留多聚赖氨酸， 以上过程 重复三次，白片安实验设计写好编号 ， 用锡纸包好放于 冰箱中备用。 规石蜡切片的制备 水洗：流水冲洗已经固定的组织块 30 脱水： 70%乙醇 1200% 乙醇 1205% 乙醇 120无水乙醇 60水乙醇 60无水乙醇 60 透明：二甲苯 20二甲苯 20二甲苯 20 浸蜡：石蜡 （ 56 ） 60石蜡 （ 62 ） 30 包埋： 切片： 包埋好的标本 取下丘脑室旁核、视上核部分行冠状切片，片厚 6m， 细致贴 裱在多聚赖氨酸处理过的载玻片上，室温过夜自然干燥，置于玻片盒中，行常规 甲苯胺蓝法）。 7. 石蜡切片 海马区 色 验试剂 要试剂 中性树胶：天津市光复精细化工研究所，生产批号： 20080311； 苏木精：上海润成生物科技有限公司，生产批号： 208格： 25g； 氧化汞： 泰兴市生物化工公司，生产批号： 20070614，规格： 100g； 硫酸铝钾： 天津市河东区红岩试剂厂 ,生产批号： 84780548， 规格： 100g； 冰醋酸： 济南凯丰化工有限公司，生产批号： 格： 500 伊红 Y： 北京红星化工研究所，生产批号： 01格： 500g。 要溶液配制 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 11 - 苏木精液（ 木精） 苏木精 化汞 酸铝钾 水乙醇 10馏水 200醋酸 8馏水加热溶解硫酸铝钾，无水乙醇溶解苏木精，混合两种液体 约 1冷却后加入氧化汞 续加热至染液变为紫色，用纱布盖住瓶口 ，使用前用滤纸过滤后每100冰醋酸 4 1%盐酸乙醇分色液 浓盐酸 70%酒精 红 Y 水溶液 伊红 Y 蒸馏水 100 冰醋酸 1 滴 验步骤： 甲苯 ： 5 甲苯 ： 5 水乙醇 ： 3 水乙醇 ： 3 5%乙醇： 3 0%乙醇： 3 0%乙醇： 3 馏水： 1 木精液染色： 10 水冲洗： 1 %盐酸乙醇： 3 洗： 1 红 Y 液染色： 3 水冲洗 ： 0%乙醇： 2 0%乙醇： 2 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 12 - 5%乙醇： 2 水乙醇 ： 2 水乙醇 ： 2 甲苯 ： 5 甲苯 ： 5 性树胶 封片 ， 上镜观察 。 8. 石蜡切片 海马区 色 是 1892 年由 德国病理学家 立 的 ， 它的原理是 用碱性染料如结晶紫、甲苯胺蓝等将 胞内的 尼氏体与核内 的 染色质产生显色反应 ，将其 染成蓝色 ，更好地 显示神经元胞体的形态。 作为 神经系统 的 常规染色方法， 理想的 色结果 应为 ：细胞核淡蓝色，尼氏体深蓝色， 而主要 背景无色。 要实验试剂： 甲苯胺蓝 ： 上海蓝季科技发展有限公司 ，生产批号： 20092410，规格： 25g； 配制：甲苯胺蓝 0%酒精 合溶解，常温下可保存 6 个月。 验步骤： 规切片脱蜡至水（同步骤 ； 入经预热至 50 的 1甲苯胺蓝 (溶液中，并在 56 温箱中染5 馏水漂洗 ； 0酒精中反应约 5酒精分化，镜下控制，以尼氏小体显示清晰为度 ； 醇 脱水，二甲苯透明 ， 中性树胶封片，上 镜观察（同步骤 ； 9. 免疫组化方法测定下丘脑 要试剂 抗：美国 司 兔抗 体（浓缩型）：产品编号： 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 13 - 兔抗 体（浓缩型）：产品编号： 抗：北京博奥森生物技术有限公司 通用型 谱免疫组化试剂盒：产品编号： 试剂盒内提供： 3% 3闭用正常沈阳血清工 作液 3物素标记山羊抗兔 根酶标记链霉卵白素工作液 3 剂盒：北京天根生化科技有限公司 物显色试剂盒：产品编号： 试剂盒内提供： 物储存液（ 20）： 3氧化氢溶液（ 20）： 3 应缓冲液（ 1）： 60 l 枸橼酸抗原修复液（ 枸橼酸：上海试剂一厂，生产批号： 06 枸橼酸三钠：北京化工厂，生产批号： 840825； 储备液的配制： A 液：枸橼酸三 钠（ 2 蒸馏水 1000 B 液：枸橼酸（ 21g + 蒸馏水 1000 工作液的配制： A 液 82 B 液 18 蒸馏水 900 其余试剂同 前 。 验步骤： 以 操作。 蜡切片从 4冰箱中取出恢复常温 20 规切片脱蜡至水（同步骤 ； 泡 5 l 枸橼酸抗原修复液微波修复， 92 15然冷却； %0消除内源性过氧化物酶的活性； 加封闭用正常山羊血清工作液封闭抗体，室温孵育 10去，勿洗； 加适当比例稀释的一抗（ 释度 1:100； 释度 1:150；宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法 - 14 - 1%释）， 4冰箱过夜； 洗 33 次； 加生物素标记二抗（山羊抗兔 37湿盒孵育 10 洗 33 次； 加辣根酶标记链霉卵白素工作液， 37湿盒孵育 10 洗 33 次； 色剂显色（ 室温，镜下控制反应速度； 馏水冲洗终止染色； 精液染色： 1 洗 33 次； %盐酸乙醇分色： 30 秒； 洗 33 次； 醇 脱水，二甲苯透明 ， 中性树胶封片，上镜观察（同步骤 ； 阴性对照以 代一抗。 10. 统计学处理 所有切片均用 清晰彩色病理图象分析系统进行图象分析，要求为：在同一强度同一放大倍数下进行采图，每只大鼠测 6 张切片，每张切片随机取 5 个视野，测定每个视野的吸光度值，取平均值作统计。 采用 计软件分析，使用 件绘制图表。实验数据均用均数标准差 ( )表示，完全随机设计多样本均数的比较用单因素方差分析 (验 )；进行多样本均数与对照组均数间的两两比较时，方差齐性条件下，用最小显著法（ 验），方差不齐条件下，用 验组中各时点比较用t 检验。以 P 差异有统计学意义。 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 结果 - 15 - 结 果 1. 实验一般情况 立体定向操作下向 84 只致痫组大鼠脑内杏仁核部位 注射 海人酸 药物， 诱发 出 癫痫的大鼠 82 只，成功率为 实验 过程 中因大鼠体重异常排除 3 只：假手术对照组1 只、 2h 组 1 只、 4d 组 1 只。 药物灌胃过程中 d 组 、 4d 组各死亡 1 只，考虑与灌胃手法、灌胃后大鼠的个体差异有关。 共有 91 只大鼠完成全部实验。 2. 痫大鼠行为学改变： 自 射 入 各组大鼠 脑内相应部位后 1h 左右，大鼠开始 逐渐 麻醉清醒， 起初仅为较少的 自主 活动，表现出凝视、湿狗样抖动、口的咀嚼运动、点头和搔头动作，并可出现 射的对侧肢体 轻微 阵挛、抽搐，伴口腔流涎。随着时间推移，大鼠 抽搐动作加剧， 主要表现为阵发性奔跑及旋转 、躯体 立起、向上窜跳、跌倒、四肢抽搐，出现全面强直阵挛发作，每次发作 持续 23复间歇发作数小时。 57h 后发作减少，约10h 左右 发作 基本 停止，逐渐恢复到正常 平静 状态。 24h 至 7d 期间，大鼠约 抽搐 发作 12次，主要为 2 级至 4 级发作；之后，大鼠进入发作静止期，癫痫症状几乎完全消失 ， 但极 易激惹 ， 抓持时 常 有攻击行为，此期持续 至致痫后 1015d，大鼠进入自发性反复癫痫发作的慢性期，主要表现为咀嚼和点头运动， 少数 严重者可出现抽搐和跌倒 ，此间发作持续 的 时间很短，仅为几秒至至十几秒（图 4）。 3. 痫大鼠脑电图改变： 脑电图 (通过脑电图描记仪将脑自身微弱的自发性生物电活动放大记录 的 一种曲线图。由于癫痫是 以 大脑神经元突发性异常放电 、 神经网络对该放电异常扩布 所 导致 的 大脑功能短暂障碍的一种慢性疾病 ，因而 于 癫痫的诊断、疗效评估 等 方面都 有着极为 重要的应用价值。 燃致痫大鼠后， 同步记录 其 脑电波形 可见： 正常大鼠脑电频率以 10 15幅小于 500 V。 射后，大鼠麻醉状态下的脑波比较规则，大多数导联 记录 到 波形为节 律规则的慢波， 并且 形态相似；而在 5 级发作时， 致痫 组 大鼠 都出现明显的癫痫样波 ， 与 空白 对照组相比，高幅 慢波增多，节律不规则 且 呈 多种形式 ， 常见 波型宁夏医科大学硕士研究生学位论文 结果 - 16 - 有单 发 棘波、多 发 棘波、双相棘渡、棘慢波等，其中以多发棘波最多（图 5）。 4. 痫大鼠 神经元形态学 改变： 通过 色（图 6）和 色 （图 7） 可见： 空白 对照组大鼠 海马区 神经 元细胞排列规则，轮廓清晰，胞浆透明，细胞核呈圆形、椭圆形，核仁明显。 射出现痫样表现的 3h 后（发作急性期），神经元细胞排列不整齐， 星形细胞明显水肿 、变性，胞体固缩，核仁不清，胞核裂解，胞浆消失 ； 至 7d 时（发作静止期）神经元几乎完全缺失， 已经 失去 正常 带状排列规则，出现新生毛细血 管 ， 星形胶质细胞体积增大，胶质疤痕形成， 可见显著的 出血 并发 血管增生 现象； 此后， 14d 时（发作慢性期）神经元 已经消失 ，凋亡细胞数量 明显 增多，胞浆淡染， 细胞 周围卫星灶形成 (由于神经元受损造成的胶质细胞在神经元周围堆积 所致 )，腔隙层、辐状层和锥体细胞层有神经元吞噬现象 。 5. 痫大鼠血清 动态变化 测结果显示（表 2） 空白对照组和 假手术对照组 间无统计学差异 (p而与空白对照组和 假手术对照组 相比， 和 各时点血清中 平均降 低 (而与空白对照组和 假手术对照组 相比， 和 各时点血清 平均升高 (p而以 升高更为明显（图 10）； 与 相比，各时点血清 平有 显著降低 (p但都高于空白对照组和 假手术对照组 ，且在灌胃 7d 后两者差值达到高峰（图 11）。 6. 痫大鼠下丘脑 动态变化 免疫组化结果 (表 4)显示： 性表达为胞浆内出现圆形或椭圆形的棕黄色颗粒（图 12、图 13）。与空白对照组和 假手术对照组 相比， 和 达均降低 (p而 与 各时点 达水宁夏医科大学硕士研究生学位论文 结果 - 17 - 平相比较， 胃组都有所升高，尤其是在灌胃 24h 和 7d 后有统计学意义 (p，但都低于空白对照组； 胃组和 胃组各时点下丘脑 达均升高(p而 与 各时点 达水平相比较， 都有所降低，并且在各点都有统计学意义 (p，但仍高于空白对照组 。 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 讨论 - 18 - 讨 论 癫痫是由大脑神经元异常放电引起的以短暂性中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病，以神经功能失常为特征 13。 据世界各地流行 病 学调查 结果显示 ，癫痫患病率在 15 ，一般为 46 。国内最新统计资料显示， 我国癫痫患病率为 7 ，活动性癫痫患病率为 ，年发病率为 0 万人，据此估算目前我国约有 900 万左右的癫痫患者， 其中活动性癫痫 600 万， 若癫痫患者能在医院或专科医师指导下正规服用抗癫痫药物， 70%80%患者经治疗后发展可得到完全控制或显著减少，从而能正常工作、学习或社会，但仍有 20%30%患者虽经正规的各种药物治疗仍难以控制， 最终发展为难治性癫痫， 长期频繁发作 ， 使患者导致不同程度的精神或社会心理学障碍，给家庭、社会带来严重经济和技术负担 。随着科学技术的进步，新的抗癫痫药物不断的出现，电生理技 术发展及神经影像学的开发，癫痫的治疗已得到突飞猛进的发展。但由于癫痫疾病的病因庞杂，种类繁多，临床表现多样，且有各种各样的地形综合征和相关情况伴同，加以长期以来对于本病的发生机制不清，诊断技术方面特别是不够精准，这些都限制着癫痫疾病的防治 14。 癫痫 因 其发作 具有不可 预见 性 ，发作 时 的程度不能 由 人为控制，而发作部位又 位于机体 的中枢神经系统， 因 而给直接研究带来 极大地 困难， 所以 建立 癫痫 实验性动物模型，对于癫痫 疾病 发生机制 的研究、 癫痫 诊断和 治疗策略 的探讨、 抗癫痫药物的 筛选和评价、痫性活动扩散后脑功能和结构慢性改变 的观察 ， 都 具有 十分 重要 的 意义。 自从 1883 年次采用冷冻大脑组织造成脑内致痫灶起，癫痫的实验性研究已经有 120多年 15。癫痫的动物模型主要为电点燃模型和化学点燃模型，后者是用化学致痫药物的阈下剂量反复刺激点燃动物脑部的某些结构，逐渐积累刺激效应，最终引起癫痫样发作。癫痫动物应该具有慢性、自发和反复性发作的特征。但迄今为止， 人们使用 的 100 多种癫痫 动物 模型，尚无一种能完全模拟 出 人类 难治性 癫痫的所有临床、病理、生理学特征。 称红藻氨酸或海藻氨酸 , 是从日本的一种天然海藻中提取出来 的、脑内兴奋性氨基酸递质 谷氨酸的结构类似物，其神经兴奋作用强于谷氨酸 30100 倍 16。目宁 夏医科大学硕士研究生学位论文 讨论 - 19 - 前较为肯定的机制理论是： 入脑内后可以作用在谷氨酸和门冬氨酸能末梢突触前的 体上，直接与神经元突触后膜的非 体即离子型谷氨酸受体中的 体和 3 羟基 基 恶唑（ 体结合，一方面是激活了 体，刺激兴奋性氨基酸的释放和抑制其再摄取，产生兴奋性突触后电位，引起突触后神经元去极化， 大量内流，使神经元严重水肿，迅速馈变死亡，导致痫性发作 17， 18。而脑内的特异性高亲和力 体存在于海马、纹状体等部位，尤以海马 就是说在此区域最容易出现神经元过度兴奋和兴奋氨基酸毒性作用 19。 2009 年 出了关于 痫机制的新机制： 体结合后，激活 L 型 道导致神经细胞内 度升高，即早基因 达，启动细胞走向程序性死亡，而升高的 使得脑内氧自由基增多，过量的自由基与 应，进一步分解成羟自由基和 些活跃的化合物可引起细胞生物膜的分解、脂质的破坏和神经元损伤 ，导致细胞功能紊乱，甚至死亡，最终导致动物急性癫痫发作及以后长期反复发作 20， 21。 杂的致痫原因应该是以上两种机制并存的结果 22。 痫模型的给药方式有两种：一种是局部给药，包括脑室内给药 (剂量为 g/脑内局部注射 (剂量为 g/另一种是全身给药 (皮下、静脉或腹腔内注射，剂量为 412mg/23。 虽然对于该模型的特征、致痫机制、药物反应等方面国内外报道较多，但 既往报道中大多采用全身给药制备，用量大而且易造成毒性反应；此外， 血 的通透性很差，皮下给药后能到达脑内受体的药量不足初始剂量的1%，其低生物利用率可导致明显的种属和个体差异，甚至会出现“全或无”反应 24。对于 在脑内 局部给药建立点燃模型的系统研究报道 较少 。 在本研究中，利用精确的立体定向手术方法将 l 注射到 大鼠 脑内 杏仁核 ，用 药量 仅为 全身给药方式的千分之一左右，微量的药物浓度既可以 使癫痫发作表现明显 ，又能够保证实验 动物存活而不会因癫痫发作过度致死 ； 同时， 在近 5 年的 海人酸全身给药致痫模型文献报道 中， 诱发成功率 约 为 6785%25 而在本次实验中， 致痫成功率为 这些都可以明显降低实验成本，提高实验成功几率。 通过对致痫大鼠的行为学观察、 录和 病理学检测，本研究 证实