电子自旋共振技术在评价啤酒新鲜度中的应用.docx

图 1 pbn 结构及反应方程式电子自旋共振技术在评价啤酒新鲜度中的应用田玉红，纪秀萍，张宇昕，郝俊光（青岛啤酒股份有限公司科研中心 ，山 东 青 岛 266061）摘 要： 利用电子自旋共振技术(esr)测定强化实验时啤酒中产生的自由基，其拐点 lag time 表达了啤酒的内源抗氧化活力 eap，从而预测啤酒的新鲜度。在对市售啤酒的测定中，将该法测定结果与专家品评结果作相关性分 析，相关系数达到 0.48，显示有较好的相关性，该指标可用于评价啤酒的新鲜程度以及预测啤酒的货架保质期。 关键词： 啤酒； esr； 自由基； 新鲜度中图分类号：ts261.5；ts261.7；ts261.4文献标识码：b文章编号：10019286（2009）12006203application of electron spin resonance in the evaluation of beer freshnesstian yu-hong , ji xiu-ping，zhang yu-xin and hao jun-guang(scientific researh center of tsingtao brewery co. ltd., qingdao, shandong 266061, china)abstract: electron spin resonance (esr) is used to detect the free radicals in beer during the forcing test. the inflextion lag time indicated theendogenous anti-oxidative potential of beer and beer freshness could be predicted consquently. market beer was detected and the results were compared with the taste panel, and the correlation coefficient was 0.48 which showed good correlativity. this index could be used for evaluating beer freshness and further predicting its shelf period.key words: beer; esr , free radicals , freshness啤酒新鲜度是市 场消费者非常关注的品质指标 ，也是各大啤酒公司的核心竞争力 。 啤酒在贮存期 的 风 味 稳 定性的研究报道较多 ， 主要集中于单一与老化 相 关 的 物 质或单个抗氧化指标1-4。 由于啤酒的组成复杂 ，此 类 表 征均具有一定的局限性 。 随着核磁共振 、电子自 旋 共 振 、 质谱等现代分析技术的广泛应用 ， 人们对啤酒 老 化 机 理 有了越来越深入的认识 ， 开始从自由基等角度 研 究 成 品 啤酒的老化5-8。成品啤酒的风味物质是动态变化的 ， 啤酒 中 老 化 物 质的出现 ，与啤酒的氧化紧密相关 。 研究表明 ，氧 以 活 性 氧的形式参与了啤酒中的氧化还原反应 ， 包括 超 氧 阴 离子 自 由 基(o 2-)、羟 自 由 基(oh)等 。 啤 酒 氧 化 反 应 的 实 质是自由基反应, 啤 酒 中 的自由基反应涉及的网状反应 结构涵盖了大部分老化反应 。自由基 （free radical fr）是指具有未配对电子的原子 、原 子 团 、分 子 或 离 子 ，表 现 出极活泼的化学性质 ，存在时间非常短 。由于测定手段的问 题， 很长一段时间里研究人员无法了解有关自 由 基 的 情 况，直至自旋捕集技术的出现 ，研究者才能从真 正 意 义 上 测定自由基 ，如氧自由基 。这种方法的原理是利用自旋捕 集剂与自由基反应生成相对稳定的自旋加合物 ， 通 过 测 定该加合物来表征原自由基 。 自旋捕集剂是一 类 不 饱 和的抗磁性物质 ，通常为氮酮和亚硝基化合物 ，现 在 已 经 合成上百种自旋捕集剂 ，最 常 用 的 有 tnb (nitrosotert -butane)，dmpo(5,5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide)，pbn( phenyl-tert-butynitrone)等 。 pbn 是较常用的氧自由基 捕集剂 ，结构及反应方程式结构及反应方程式见图 1。esr（electron spin resonance）是 建立在自由基捕捉 技术基础上的自由基检测技术 ， 通过对特定 条 件 下 自 由 基的检测来反映啤酒抗氧化能力 。 新鲜啤酒 中 含 有 内 源 性 抗 氧 化 物 质 ，如 二 氧 化 硫 、抗氧化的酚类化合物 （类 黄酮 ，花 色 素 ，黄 烷 醇 ）、类 黑 素 、vc、谷 光 甘 肽 等 ，随 着 老 化 的 进 程 ，抗氧化物质逐渐被消耗尽 ，自 由 基 开 始 被 pbn 捕获并被 esr 检测到 。 自由基从少量被检测到转变成大 量产生的拐点对应的时间就是 lag time，其 值 表 达 了 啤 酒的内源抗氧化活力 eap (endogenous anti-oxidative potential)，从而决定了啤酒的风味稳定时间 。本 文 研 究 了 利 用 esr 测定强化实验时啤酒中的自 由基的测定方法 ，对市售商品啤酒进行了测定 ，并 将 测 定收 稿 日 期 ：20090915作 者 简 介 ：田 玉 红 （1980-），女 ，工 程 师 ，硕 士 ，从 事 啤 酒 研 究 。图 2 esr 测定 lag time 的原理图 3 esr 检测啤酒的 lag time 图示田玉红，纪秀萍，张宇昕，郝俊光电子自旋共振技术在评价啤酒新鲜度中的应用63结果与专家评委的品评结果作分析 ， 考察了该 方 法 的 实际应用效果 。1材料与方法1.1材料和试剂啤酒，市售商品啤酒 。 pbn 购自 sigma-fluka 公 司 。无水乙醇为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司 。1.2仪器和设备纯水仪 ，milli-q plus，离心机 ，sigma3k30 型 ，涡 旋 混 匀 器 ，ika ms 3basic,esr(electron spin resonance) 电 子 自 旋共振仪, 德国，bruker 公司； 软件：bruker elba for e- scan。1.3测定方法（1）配 制 1 mol/l pbn-乙 醇 溶 液 ：准 确 称 取 0.443 gpbn 于 称 量 纸 上 ，转 移 至 仪 器上的棕色样品瓶中 ， 加入 2.5 ml 无 水 乙 醇 ， 置于涡旋混匀器加速溶解 ， 配 制成 1 mol/l pbn-乙 醇 溶 液 。 此溶液现用现配 ，每 个 样 品 需 0.5 ml 该溶液 ，根据样品数量决定配制量 。在 实 验 中 发 现 ，利 用 esr 测 定 lag time 时 ，温 度 的控制是检测的关键控制点 。 设定温度为 60 时，pbn 捕 捉自由基的量在一个周期内 （200 min）能 达 到 拐 点 ，而 温 度 在 58 以 下 时 ，样 品 中的自由基含量缓慢增长 ，在 测 定设定的条件下无法检测到 lag time。 实 验 表 明 ，在 样品测定时应严格控制机械浴温度和环境温度 。2.3 lag time 值与品评结果的比对分析取市售商品啤酒 ， 利 用 上 述 测定方法对样品进行 lag time 值 的 测 定 ， 同时与新鲜度得分进行相关性分 析。 品评小组由 6 个以上的专业评委组成 ，实 行 10 分 制 打 分 法 ，分 值 越 高 ，新 鲜 度 越 高 ，具体评判测定标准见表 1。 检测结果与新鲜度品评得 分 见 表 2，相关性分析结果 见表 3。， ， ，（2）啤 酒 经 离 心 除 气 ，于 5500 r/min 离 心 5 min。取9.5 ml 除气啤酒于棕色样品瓶中 ， 加 入 0.5 ml 1 mol/lpbn 乙醇溶液 ，涡旋混匀器加速混匀 。(3）用 bruker elba for e-scan 设置检测顺序和调用 方法，进行检测 。 esr 条件：机械浴温度为 60 ；中心磁 场:3465 g；扫描宽度 20 g；微波功率 4.33 mw；放 大 倍 数2.51102；调 制 频 率 86 khz；调 制 幅 度 2.0 g；采 集 次 数 为4 times；数据处理方式采用 s 拟合。2结果与分析2.1esr 检测方法的原理及建立利用 esr 测定 lag time 的原理见图 2。 新鲜啤酒产 生的羟基自由基会首先被啤酒内源性抗氧化物 质 ， 如 二 氧化硫 、 抗氧化的酚类化合物等清除 ， 而随着 老 化 的 进 程 ，抗氧化物质逐渐被消耗尽 ，而自由基开始被 pbn 捕 获并被 esr 检测到 。 自由基从少量被检测到转变成大量 产 生 的拐点对应的时间就是 lag time，其 值 越 大 ，说 明 啤酒的内源 抗 氧 化 活 力 eap 越 大 。 很 显 然 ，自 由 基 的 沉 默 诱 导 期 由 eap 决 定 ， 而 eap 又决定了啤酒的风味稳 定时间 。 在该方法中 ，典型的检测结果见图 3。图 3 中，菱形的点代表检测到的自由基的强 度 ，曲 线 的拟合方式采用 s 拟 合 ， 粗 实 线 对 应 的 时 间 就 是 lag time。 该时间越长 ，则 eap 越高，其风味稳定性越高 。 样 品的检测周期大约 200 min 左 右 ，在 一 个 周 期 内 ，可 以 同 时测定多个样品 。 在实验条件下啤酒的 lag time 一般小 于 150 min。 测定的稳定性较好 ，rsd6 %。2.2esr 检测方法中温度的控制 %p10 fi % ,-.a8 & 1/ k:! #$(% k: ) #$*+01 k:) 23 #$*+ ,% 表 1表 3 结 果 显 示 ，lag time 值与新鲜度得分之 间有较好的正相关性 ，相关系数为 0.48，可以 通 过 该 指 标 的测定来预计啤酒的新鲜程度以及评价啤酒 的 货 架 保 质 期。3 结论lag time 值准确地反映了啤酒中自由基含量的变 化，从而预估了啤酒中老化物质的产生 。在与新鲜度品评 结合时 ，与品评得分之间有较好的正相关性 ，相 关 系 数 为大 会 现 场 颁 奖 仪 式 64 酿酒科技 2009 年 第 12 期 （总 第 186 期 ）liquormaking science technology 2009 no12(tol186) lag time - - - - - lag time % lag time % 10.481参考文献：1grigsby j h,palamand s r.the use of thiobarbituric acid as amean of the degree of beer staling.j. j.am.soc.brew.chem.1976，(34)：89-98.严 敏 ，李 崎 ，顾 国 贤.利 用 dpph 自由基清除率评价啤酒内源 性 抗 氧 化 能 力j.食 品 工 业 科 技 ，2005，26（8）：82-83.shigeki a, tatsuji k, chikako s.estimation of antioxidative activity and its relationship to beer flavor stability j . j.am. soc.brew.chem. 1999,57(1)：34-37.付 兆 辉 ，李 琦 ，顾 国 贤.啤酒老化的预测tba 值 测 定 方 法 的 探 讨 j.食品与发酵工业 ，2004，(3)：97-101.m. uchida and m. ono, improvement for oxidative flavor stability of beer-role of oh-radical in beer oxidationj. j. am.soc.brew.chem. 1996, 54(4)：198-204.严 敏 ，李 琦 ，顾 国 贤.啤酒中自由基的 esr 研 究j.中 国 酿 造 ，2006，155（2）：24-26.李 琦 ，严 敏 ，董 建 军,等.利用电子自旋共振 （esr）技 术 研 究 啤 酒原辅料自由基及其对麦汁自由基的影响j.分 析 实 验 室 ，2007，25（5）：84-88.严 敏 ，李 琦 ，董 建 军,等.利用电子自旋共振 （esr）研 究 啤 酒 酿 造过程中的自由基j.食 品 科 学 ，2007，28（2）：64-66.2345670.48， 可以通过该指标的测定 来评价啤酒的新鲜程度以 及预计啤酒的货架保质期 。 而且该方法可在一 个 检 测 周 期内对多个样品同时进行测定 ，稳定性较好 ，rsd6 %，有较高的应用价值 。8! 第七届全国核心期刊与期刊国际化、 网络化研讨会在昆明召开本刊讯：由中国科学技术期刊编辑学会、中国科学技术信息研究所和万方数据股份有限公司共同举办的第七届全国核心期刊与期刊 国际化、网络化研讨会于 2009 年 11 月 7 日12 日在昆明隆重召开，来自全国 31 个省、市、自治区 900 多名代表参加了会议。万方数据库股份有限公司顾问宋培元先生主持会议，中宣部出版局副局长刘建生，新闻出版总署报刊司副局长张泽青，科技部条财 司处长马晋并，中国科技期刊编辑学会副理事长李军、游苏宁、刘泽林，中国科学技术信