噬菌体展示技术ppt课件

主讲 叶思灵 噬菌体展示技术 什么是噬菌体展示是一项筛选技术 将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达 融合蛋白展示在病毒颗粒的表面 而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内 表型 基因型展示肽 编码基因 使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系 使各种靶分子 抗体 酶 细胞表面受体等 的多肽配体通过淘选得以快速鉴定 简介 Landmarksofphagedisplay 1985第一次发表噬菌体展示技术 展示多肽SmithGP Science 1985 228 1315 71988噬菌质粒系统1990抗体片段的展示1993展示cDNA文库1994 1995研发了 phagetwo hybrid 技术1996首次体内invivo淘选试验1998噬菌体展示载体作为基因导入载体1999Combinationofphagedisplaywithhigh densityarrays2001AutomatedphagedisplayselectionKillingcancercellsbytargeteddrug carryingphagenanomedicinesPublished 3April2008BMCBiotechnology2008 8 37doi 10 1186 1472 6750 8 37 展示系统DisplaySystem CellBased1 PhageDisplay2 CellSurfaceDisplayCellFree1 RibosomeDisplay2 mRNADisplay 噬菌体展示系统的分类 根据噬菌体不同PhageM13 f1 fdT7 T4 lamda根据载体不同VectorTruePhagePhagemid根据文库不同Library随机肽库 cDNA文库 抗体文库 蛋白质文库 M13噬菌体的组成和结构 丝状噬菌体 M13 f1和fd 单链DNA病毒 6407bp 基因组编码11种蛋白质 其中5种为结构蛋白质 与展示密切相关的有两种结构蛋白质 DNA在细菌内滚环复制 细菌不被裂解 但生长速度减慢 并且分泌大量噬菌体颗粒 LifeCycleofM13 pIII蛋白结合于E Coli的F纤毛 病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA 以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白 且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA 第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中 37 感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体 次要衣壳蛋白pIII 406aa组成 5个拷贝 位于噬菌体的尾部 由三个功能区组成 N1穿膜区 作用于E coli细胞膜上的TolA蛋白 与噬菌体的入侵有关 N2受体结合区 负责结合F菌毛 CT疏水区 组装前黏附在细菌内膜上 与噬菌体组装终止有关 G1 G2 甘氨酸片段 在感染过程中 增加各个功能域之间的灵活性 主要衣壳蛋白pVIII 每个病毒子含约2700个拷贝 约10 能有效地融合外源多肽或蛋白 以pIII融合子方式表达的多肽是低价的 而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的 每个病毒子 200个拷贝 这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体 而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上 所有Ph D 文库都是pIII融合方式 每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽 pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同 pVIII展示的多肽比较小 如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装 pIII只要不影响感染 可以展示300aa的多肽 噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86kDa 丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽 每个病毒子含 个拷贝的pIII蛋白 这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力 拷贝数不同 噬菌体质粒 方便克隆 增强遗传稳定性 噬菌体质粒特征 携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因 没有其他噬菌体基因 有质粒复制起点 322ori 和噬菌体复制起点 f1ori 用于合成ssDNA 有包装序列信号 packingsignal 有供筛选的抗生素标记基因 Helperphage 提供噬菌体质粒复制 合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶 f1oridefect 噬菌体展示技术流程 淘选的方法 亲和淘选直接包被法淘选法 优点 简单直接 缺点 偶尔会导致配体结合位点难以进入可能是由于分子的立体封阻或者是靶分子表面的部分变性而引起液相法 先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合 然后将噬菌体 靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上 如 链霉亲和素包被的表面 建库 例子 含编码12肽DNA序列为5 CATTCTCACTCGGCCGACGGGGCT NNK 12GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA3 其中N代表A T C G四种碱基 K代表G T两种碱基 NNK 12为编码随机12肽部分 划线部分含有Bgl 识别序列 扩增 嵌合 噬菌体扩增 亲和淘选 噬菌体肽库与靶分子相互作用洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体将特异性结合的噬菌体洗脱下来三轮淘选后 克隆测序 噬菌体展示的应用 抗原表位分析 制备特异性抗体 制备疫苗 多价疫苗 构建新型的生物催化剂如Renetal 1997 将T4DNA连接酶展示于T4噬菌体 所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端 有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上 制造人工的多酶复合体 或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上 制造superenzyme 筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具 Dennis从肽库中筛选到非竞争性地抑制FVIIa活性的肽段 噬菌体展示的应用 蛋白质 蛋白质相互作用噬菌体cDNA文库与芯片相结合 a 合成噬菌体cDNA文库 b 生物淘选 c 铺板 挑克隆入微孔板 为制备芯片做准备 噬菌体展示的应用应用举例 用病人IgE血清对6种不同的cDNA文库淘选 5轮后 挑出38 000个克隆 鉴别了233种蛋白 其中47种为已知 186种是新的过敏源 烟曲霉 Aspergillusfumigatus 已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌 草本枝孢 小麦黑霉病菌 Cladosporiumherbarum鸡腿蘑 Coprinuscomatus 皮屑牙胞菌 Malasseziafurfur 花生和人肺组织 Crameri R etal 2001 Tappingallergenrepertoiresbyadvancedcloningtechnologies Int Arch AllergyImmunol 124 43 47 噬菌体表面展示肽库优缺点 优点 M13无需体外包装 电转化效率高 库容量大2 8 109 M13噬菌体纯化步骤简单 可加速淘选进程 可避免细胞蛋白的污染