【毕业学位论文】(Word原稿)转GFP青枯雷尔氏菌无致病力菌株对番茄青枯病免疫抗病效果的研究-细胞生物学

学校编码： 10384 分类号 密级 学号： 200426066 硕 士 学 位 论 文 转 疫 抗病 效果的研究 on of an on in 者姓名 指导教师姓名： 专 业 名 称：细胞生物学 论文提交日期： 2007 年 月 论文答辩时间： 2007 年 月 学位授予日期： 2006 年 月 答辩委员会主席 ： 评 阅 人： 2007 年 月 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指 导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。 声明人（签名）： 年 月 日 厦 门 大 学学 位 论 文著作 权 使用 声 明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文 在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1、保密（ ），在 年解密后适用本授权书。 2、不保密（ ） （请在以上相应括号内打“”） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 目录 摘要 1 前言 1 菌性青枯病的分布与危害 1 枯雷尔氏菌的概况 1 枯雷尔氏菌的形态及生理生化特征 1 枯雷尔氏菌的选择性培养基 2 枯雷尔氏菌的保存 2 菌性青枯病的发生 2 枯雷尔氏菌的致害特性 2 枯病发生的土壤条件 2 枯雷尔氏菌传染途径 3 枯雷尔氏菌致病侵染方式 3 菌性青枯病的流行规律与预测预报 4 菌性青枯病防治方法 4 物防治 4 业防治 7 学防治 8 色荧光蛋白（ 应用 8 子结构和发光机制 8 用的优点 9 跟踪观察微生物方面的应用 10 论文的研究目的及意义 10 2 材料与方法 12 验材料 12 株 12 养基 12 茄苗 12 备仪器 12 生物学试验基础方法 12 枯雷尔氏菌平板培养 12 枯雷尔氏菌液体摇床培养 13 体血球计数器法 13 板菌落计数法 13 枯雷尔氏菌的无菌水保存 13 枯雷尔氏菌回接番茄苗的方法 13 验方 法 13 生物学特性研究 14 染特性的研究 14 疫抗病效果 的研究 15 疫接种防病盆栽试验 17 3 结果与分析 19 生物学特性研究 19 因 前后菌落形态观察 19 枯雷尔氏菌无致病力菌株 转 因 前后 单细胞形态观察 20 染特性的研究 20 同侵染浓度侵染效果的观察 20 染进程的测定 20 同接菌方法侵染番茄组培苗效果的观察 21 度对 对 番茄组培苗侵染的影响 22 染番茄组培苗菌量的 消长动态 23 种时间对番茄组培苗侵染的影响 23 同浸根时间侵染番茄盆栽苗效果的观察 23 疫抗病效果 的研究 24 致病力菌株 染番茄组培苗菌量消长动态 24 番茄组培苗青枯病的 免疫抗病效果 25 疫接种防病盆栽试验 30 致病力菌株不同菌株和接菌方法对番茄盆栽苗侵染动态的比较 30 致病力菌株对番茄盆栽苗 免疫抗病效果 的观察 34 4 结论与讨论 36 侵染特性 36 染番茄组培苗菌量消 长动态 36 番茄组培苗青枯病的 免疫抗病效果 37 致病力菌株不同菌株和接菌方法对番茄盆栽苗侵染动态的比较 37 番茄盆栽苗青枯病的 免疫抗病效果 38 望 39 参考文献 40 致谢 45 转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 I 转 疫 抗病 效果的研究 摘要 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌 (起的 植物 毁灭性病 害 ， 广泛 分布 于热带 、亚热带及温带地区。 青枯雷尔氏菌 寄主广泛，可以侵染 44个科数百种植物，对农业造成了重大的经济损失。 青枯病的 生物 防治 越来越引起大家的重视。本文观察比较了青枯雷尔氏无致病力菌株 20626后的菌落形态和单细胞形态； 研究了无致病力菌株选出了最适侵染体系；研究了 疫抗病效果 ，并将其用于盆栽苗实验，初步研究了对番茄盆栽苗的 免疫抗病效果 。 研 究结果表明 ：无致病力菌株 0培养的情况下，侵染效果较好 ，将这个体系应用于日后的研究中。 没有出现像摇瓶培养时出现的平台期。不同的浸根时间对 远低于 在 组培苗体内 的繁殖量。 1混合回接组培苗的各处理中，均表现出发病时间有推迟的现象，其中菌液浓度为 104d 开始有组培苗发病，比对照推迟了 3d 。 疫抗病效果 影响较大。当 培苗的发病时间由所延迟但发病率并没有明显降低。当 培苗不仅发病时间有所延迟，发病率也显著降低。 1d， 比对照延迟了 7d；早 5病率为 远低于对照的 100%。 将 验也能取得一定的 免疫抗病效转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 ， 发病 率为 低于对照组的 关键词 ：青枯雷尔氏菌；无致病力菌株； 生物 防治 转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 on of an on in is a in R. of at 4 it to a in It of on of 20626on on of of on of by 04of be in in of t in in in to by 04047V 1, to d 3d 20626or at t d to 1d 7d d 转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 as 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 1 1 前言 菌性青枯病的分 布与危害 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌（ 起的毁灭性土传病害，主要分布在热带、亚热带和温带地区，在我国南方各省市均有严重发生 1。 青枯雷尔氏菌可危害 44 个科的 300 余种植物 2，危害较重、分布较广的主要寄主有马铃薯、番茄、烟草、茄子、花生、辣椒、姜、香蕉、甘薯、麻等。近年，又陆续在油橄榄、桑、木麻黄、木薯、番荔枝、澳洲松、桉树等木本植物，蚕豆、大豆、豇豆、羽扇豆、南瓜、大白菜、萝卜、茴香、棉花、三叶草、聚合草、草莓等草本植物上也发生了青枯病，可以说青枯病 是分布广、造成损失严重的植物病害 3。 青枯病对茄科植物的危害极为严重， 1988 年对南京地区茄科作物青枯病调查报道表明，一般田块发病率为 25严重田块可达 804；蕃茄生长过程经常受到青枯病的危害，特别在番茄结果期，适逢高温高湿的雨季，可引起毁灭性的危害 5。马铃薯对青枯病十分敏感，通常造成 20产量损失，严重时可造成 75%以上的损失 6。我国南方各省都有青枯病危害，福建烟草的青枯病发病率一般为 10严重田块达 100，以至全田烟草枯死，此病已成为福建烟草生产的主 要障碍之一 7。此外，在花生、辣椒、番茄、茄子、甘薯、生姜等作物上，青枯病发生亦很严重，易感病作物面积近 500 万亩 8。随着研究的进展，青枯病的新寄主不断发现，以及全球气温变暖等因素，世界范围内青枯病发生越来越普遍，并日趋严重 9。近年来，我国南方桉树、木麻黄、桑树等林木青枯病害发生日趋严重，造成较大经济损失，林木青枯病害也已成为林业上的一种毁灭性病害 10。 枯雷尔氏菌的概况 枯雷尔氏菌的形态及生理生化特征 青枯雷尔氏菌（ 菌体呈长椭圆形，近杆 状，革兰氏染色阴性， 菌体大小为 微米，极生鞭毛 1，不形成荚膜和芽孢，菌体内均有聚 显微镜或电子显微镜下显示两极着色较深的特征。 青枯雷尔氏菌生长最适温度为 27， 41 以上不生长 11，为好气性细菌。不同寄主上的菌落形态无明显差异，在肉汁胨琼脂平板上， 32 下培养 48 小时后，出现直径为 1灰白色不规则或近圆形菌落，边沿光滑。 枯雷尔氏菌的选择性培养基 养基是青枯雷尔氏菌的选择性培养基。在 养基上，在 30 下划线培养 48 小时后，可出现两种菌落 ：（ a）菌落呈不规则形或近圆形， 具有较宽的白边，流动性强，中心呈粉红色或浅红色稀液状，这是致病性强的野生型菌转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 2 株，（ b）菌落为圆形，干燥而较扁平，菌落白边很窄，中心呈玫瑰红色，这是致病性弱或丧失致病力的变异型菌株 12。 枯雷尔氏菌的保存 青枯雷尔氏菌菌系的分化十分复杂，很容易发生变异，研究需要稳定的菌株，所以研究青枯菌的保存是一项重要的任务。张长龄等 13对青枯雷尔氏菌的保存作了详细的研究。 实验结果表明，斜面菌苔灌水可保存 1 年，斜面菌苔灌蜡可保存 10 年， 4温度对保存无影响。经常移植，对青枯雷尔 氏菌的致病力影响很大，连续移植 5 次后，青枯雷尔氏菌的致病力 100%的丧失。斜面菌苔灌水在常温下保存 10 年，青枯雷尔氏菌的致病力丧失 50%，但是其生化型则无任何变化。 葛芸英等用不同 灭菌水常温保存不同浓度的番茄青枯雷尔氏菌， 6 年后检测存活情况，结果表明灭菌水常温保存番茄青枯雷尔氏菌效果与初始菌浓度和无菌水 关，用无菌水保存青枯雷尔氏菌是一种保存时间长，保存性状稳定的方法 14。 菌性青枯病的发生 枯雷尔氏菌的 致害特性 青枯雷尔氏菌对植株危害极大，以番茄为例，在菌侵染番茄苗后，苗期一般不表现症状， 往往植株高 30 厘米左右开始发病。植株先是顶端叶片开始下垂，然后下部叶片萎蔫，最后中部叶片至全株萎蔫。发病初期，病株仅在白天萎蔫，傍晚以后回复正常，发病后期，萎蔫的叶子无法恢复。发病后 2全株即凋萎。如气温较低，连阴雨或土壤含水量较高时，病株可维持一周后酷死，但叶片仍保持路色。病株表皮粗糙，茎部可见到维管束变褐，用手挤压，有白色菌脓从切口处溢出，此法可作为田间快速诊断青枯病的方法之一 15。 枯病发生的土壤条件 当土壤温度为 22，含水量超过 25%， ，发病最重，高温、高湿易诱发青枯病 16。 每年初次降雨来的早或晚，降雨天数的多少和降雨量的大小，都影响病情的发展。南方菜区进入高温季节，连阴雨天或降大雨之后，气温突然增高，温湿度适宜于病原菌的生长，随后就是一个发病高峰 15。 此外，植株幼苗生长不壮，多年连作，中耕伤根，低洼积水，土壤偏酸等，均可促进发病，加重危害 17。廖泳梅自 5 个县（市）采到 26 个土壤样品，发现所在土壤对青枯雷尔氏菌均有一定的抑制作用，青枯雷尔氏菌在土壤中 3 天后的检出率在 20%以下 18。袁立和等人研究发现沙壤土不利于番茄青枯病的发生，而沙质土及粘质土有利于青枯病 的发生 19。 枯雷尔氏菌传染途径 青枯雷尔氏菌主要在土壤及遗落在土壤中的病株残体上越冬，亦能潜伏于种子中或生长在各种寄主体内 17。越冬作物的营养体和繁殖体可将病菌进行远距转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 3 离传播。青枯病的初侵染来源主要为土壤、病残组织和未沤熟的农家肥料。这些病原菌借灌溉水、带菌肥料、带病菌的种子或附着在幼苗上的病土以及人畜和生产工具而传播 20。附生于作物表面的菌源可由雨水传播，雨水将表面的菌源洗落于地，可使土壤表面的病原菌浓度增高。雨水中的病源体被认为是地面上的一个重要侵染来源，在大风雨情况下青枯雷尔氏菌可在邻 近的健株上广泛传播 21。传播到叶上的病原菌在 95%生存期可超过 15 天 13。 曾东方等 22从湖北红安花生青枯病病地采集的花生种子，未经晾晒直接播于温室，青枯病发病率分别为 对种子进行青枯雷尔氏菌分离，带菌率 但风干 2 个月后播种，未见传病现象。将花生种子用病菌悬浮液浸泡 24 小时后，经烘，晾，晒干燥处理 3 天，当含水量降到 10%左右时，分离不到青枯雷尔氏菌。说明花生青枯病可通过种子传播，但病原菌的发病与湿度的关系较大。 枯雷尔氏菌致病侵染方式 青枯雷尔氏菌在一般条件下是 从植株根部伤口侵入 23。幼苗移栽时造成的根部伤口比成苗伤口更易引起青枯雷尔氏菌侵入。伤根后立即接种，植株感病受害严重，而 24 小时后再接种植株则几乎不受伤害 24。接种量大时，就是没有伤口也能侵入，此时病菌一般从次生根萌发处或根毛与皮层连接处侵入，但侵入率较低 25。 研究发现病菌侵入番茄植株后可以迅速地（ 4h 内）侵入到根部皮层的细胞间隙内， 2后便可在内皮层细胞间隙和导管薄壁组织看到有病菌的存在， 4后细菌进入并且塞满木质部导管， 6 天后，在整段茎杆都可以轻易的检查到菌 体，到第 8 天植株呈现出极度萎蔫状，随着导管及其周围组织功能的进一步衰褪，植株迅速倒伏并死亡。在植株体内形成的、从根部及倒伏在地面的茎杆释放出来的 病菌， 开始在土壤中营腐生生活，等待着入侵新的寄主 26。 菌性青枯病的流行规律与预测预报 青枯病的预测预报目前一般采用综合法，即根据病虫形态、生理、生态等特点，综合气象变化、作物长势发育、农事活动等，预测病害的发生期，并与历史上病害的发生进行比较，综合起来进行分析。 番茄在 5月份进入发病高峰，此时10厘米地温平均 25 ，气温 23 左右 17。 烟草青枯病是福建烟草 的主要病害，一般在每年 4月下旬或 5月上旬由南向北开始发生， 5月中、下旬遇上适宜的气候可发生大流行，春烟区发生危害较重。该病发生危害与品种、耕作类型、栽培管理、地形地势等有密切关系 27。孙晓扬等报道南部地区姜青枯腐败病的始发病期是 5月中下旬， 7月中旬至 9月中旬为主发病期，此阶段土温在 28 左右，土壤高温，病害易发生流行， 9月中旬后病势下降， 10月中旬停止，发病期达 140用抗病良好的姜种及种姜消毒处理、轮作换茬、净土种植、健身栽培、药剂防治等系列系统控制技术，可有效地控制病害的严重发生，减少损失 28。 转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 4 菌性青枯病防治方法 物防治 致病力菌株 的利用 在 80 年代和 90 年代，用青枯雷尔氏菌无致病力菌株防治植物青枯病在国内外青枯病的生物防治研究和应用方面发表论文最多。台湾 9用无致病力产细菌素的青枯雷尔氏菌（ 称 121菌株、 30用 株及其噬菌体、 1用 欣正等 32用 株 治番茄青枯病，均在温 室或小区试验取得良好的防效，但普遍出现后期防效降低的现象，大田试验尚未取得成功，可能是由于 株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏与其它微生物的竞争力所致。郑继法等 33研究发现三个烟草细菌性青枯雷尔氏菌的无毒产细菌素菌株 烟草青枯雷尔氏菌 4有 免疫抗病效果 。 康耀卫等 34将青枯菌无毒突变株 种于花生植株，发现其体内过氧化物酶的活性增强，接种植株的叶片组织粗提液对致病力菌株有很强烈的体外抗菌作用，将这种粗提液与致病菌株同时注入花生叶片内，亦表现出抑制发病的作用， 而且这种抑病作用随着粗提液浓度下降而减弱。 株 细菌素敏感的毒性菌株 免疫抗病效果 明显高于不敏感菌，说明细菌素在生防中起着重要的作用，此后从 纯出具生物活性的细菌素，分子量为 19000D，该细菌素具有蛋白质性质，含 16 种氨基酸 35。陈庆河等 36用紫外诱变法获得的青枯无致病力菌株诱导番茄，发现植株产生了对青枯病的抗性反应，该菌株对致病菌没有直接的抑制作用，且对番茄不能致病，番茄经无致病力菌株处理后，体内与抗病反应相关的苯丙氨酸解氨酶(过氧化物 酶 (多酚氧化酶 (性显著增强；酚类物质和木质素含量也显著提高；病程相关蛋白 (量也提高。日本 37在研究中发现一株无致病力 R. 株 其接番茄，可诱导植株产生一种比对照浓度高很多的细菌生长抑制物番茄素（ 孢杆菌的利用 芽孢杆菌属是生防菌研究中的重点，原因是其分离频率高、易培养、易保存、有效期长等特性。印度 8用 36菌株防治香蕉、茄子和番茄青枯病，分别取得了温室试验 50%、 61%和 95%，田间试验 50%、 49%和 36%的防效，同时植株鲜重和生物产值也得到提高。南京农业大学植保系与山东生物研究所合作，用芽胞杆菌 00%的防病效果，增产 39。 罗宽等 40,41从烟草根际和根表土壤分离鉴定了七株抗青枯病生防菌，并用其中三株 (一株属不动杆菌属，两株属芽孢杆菌属 )进行了抑制烟草青枯病的试验，并初步研究了转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 5 抗菌物质的理化性质。结果表明芽孢杆菌对多个烟草 青枯病菌株有广谱性抑制作用，但效果有一定著异。 42将 株的悬浮液撒入有严重病害的土壤中，染病植株的死亡率明显下降。 对于芽孢杆菌的防病机理，邱清华等 43的试验表明其抗菌物质可能为蛋白质性质的物质。杨合同通过用巨大芽孢杆菌菌株 明 39。 单胞杆菌的利用 从土壤中分离到的革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌和链霉菌菌株，往往很少能够在植物的根区定殖并形成一个庞大的群体 44，而 细菌常能在植物根围土壤中大量增殖，许多菌株对植物有抑制病害、促进生长的作用，可能是因为 礼远和康耀卫 45用荧光假单孢菌（ P. 液具有明显保护免受土壤青枯雷尔氏菌侵染的能力。靳绍菊等 46报道，通过分析研究，番茄青枯雷尔氏菌的拮抗菌多数属于荧光假单孢菌属，经多次分离筛选，从土壤中分离出了对作物无不良影响而对番茄青枯雷尔氏菌有拮抗作用的菌株 104 个，经试验，利用这种拮抗菌防治番茄青枯病，当发病株率在 25%以下时，免疫抗病效果 可达 100%；但当发病株率达 45%时， 免疫抗病效果 仅为 50%左右。 日本 47从洋葱假单孢杆菌（ 株中提取出一种抗青枯雷尔氏菌的物质 2少量该物质加入含 R. 土壤悬浮液中可杀死病原菌。 根真菌的利用 菌根真菌由于一部分在根外，一部分在根内，而占有独特的生态位。它们从寄主得到营养成分供应，这一优势使它在与根系更紧密的联系中，获得更大的更有功能的总生物量， 并以此增加对植物的作用（与仅限于根际的其它微生物相比）。因此菌根真菌作为根际群落的组成，其重要作用受到越来越广泛的承认。一些学者研究了桉树 现 种 的桉树可以不发病或者发病较轻，死亡率较低，而且还对桉树生长有明显的促进作用 48。 枯拮抗菌的利用 黎定军等 49对来自湖南嘉禾、郴县、永州、永兴、桂阳和湘西等 23 个烟区青枯病发病较轻的烟地根际土壤进行了室内细菌分离，获得 317 个菌株。测定了这些菌株对青枯雷尔氏菌拮抗性，筛选出有明显抑菌作 用的菌株 48 个，其中最有效的拮抗菌株 10 个。对该 10 个菌株相互之间的拮抗性测定结果表明，有 6个菌株相互之间无拮抗作用，可在烟草青枯病的生物防治中应用。丁爱云等 50从山东滕州、临沂等县（市）的烟草、番茄和辣椒根际采集土壤样本 15 份，经内分离纯化获得细菌 102 株、放线菌 55 株。以烟草赤星病菌、野火病菌和青枯转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 6 雷尔氏菌等为对象，对 157 个菌株进行平板对峙培养法抑菌测定，分别筛选出有拮抗活性的细菌 33 株和放线菌 22 株。郑福庆等 51从广东省不同地方、不同作物的根围及根际土壤中，筛选到对番茄青枯病病菌具抑菌效果的 菌株 20 个，盆栽试验表明，这些菌株可推迟番茄青枯病发生 10， 免疫抗病效果 高达 80%。 因工程生防菌的利用 康耀卫等 52采用转座子 变青枯雷尔氏菌，获得了世界首例植物青枯雷尔氏菌胞外蛋白输出缺失突变体（简称 变体）。该突变体 在缺失了多种胞外蛋白外输功能后，也失去了对寄主的致病力。 变体接种到植物体内后，在局部范围内有一定的定殖能力。 业防治 壤添加剂的施用 带菌土壤是青枯病最主要的初侵染源，如果能消除或减少土壤中的菌源，则能避免或减少病害的发生，因此施用有机物和无机物于土壤，可以降低土壤病菌浓度，这已成为防治土传病害的一种措施。姚革等 53于 1992在四川用一种土壤添加剂对烟草和番茄青枯病进行了小区防治试验，盆栽试验结果显示：添加剂的防病机制主要是通过促进土壤中有益微生物群体增长实现的，施用添加剂的土壤 比对照土壤中放线菌和芽孢杆菌的数量增加 10。竹内妙子等使用不带土壤的营养液栽培番茄也可防除番茄青枯病，通过防止原菌带入现场，营养液经 60 5分钟加热消毒， 制在 下，在栽培结束时对发病现场用氯剂进行消毒等均能有效防止番茄青枯病的发生 54。 物轮作和套种 除了引入有益微生物来防治青枯病以外，作物轮作和套种亦不失为经济、简便、有效的防病措施。 55发现，在青枯病发病 2 年以上时间的田块上种植，非寄主植物可使 青枯雷尔氏菌 的种群密度降至一个很低的水平。国内吕成宽等用番茄 套种洋葱防治番茄青枯病，结果发现：套种洋葱的番茄青枯病发生迟、传播慢，主要表现在首先抑制或杀死病菌，使发病推迟，其次是发病后能控制病害的迅速蔓延 56。 性砧木嫁接苗 由于番茄的抗青枯病基因遗传是隐性或多基因的，以杂交遗传育种方式选育抗病新品种，机率小，难度大，目前尚未见有成功的报道。而通过筛选抗病砧木，以嫁接方式培育抗病嫁接苗，是一条效果显著方法简便的途径 57。生产实践证明，采用嫁接技术，将 “红宝石 “、 “益农 101”等优质番茄品种与抗性高、亲合力强的砧木品种进行嫁接，培育出的嫁接苗，可以有效地抵抗 青枯病的侵染、危害，从而达到高产稳产之目的 58。 学防治 生素防治 转 枯雷尔氏菌无致病力 菌株 对青枯病防治效果 的研究 7 常用的有链霉素，四环素及有效霉素等。在印度的一项实验中，用 现青枯菌对链霉素、氯霉素、利福平、万占霉素、螺旋霉素和四环素有敏感性，其中四环素是最有效的一种 59。 除单独使用外，抗生素也有复配或合用的例子。如使用链霉环素 (链霉素与四环