【毕业学位论文】(Word原稿)青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究-生物农药与仿生农药

学校编码： 10384 分类号 _ 密级 _ 学 号： 200426073 厦 门 大 学 硕 士 学 位 论 文 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 on 导教师姓名： 教授 专 业 名 称： 论文提交日期： 论文答辩 日期： 学位授予日期： 2007年 月 日 答辩委员会主席： 教授 评 阅 人： 教授 教授 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 指导教师 厦门大学 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 2 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。 声明人（签名）： 年 月 日 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 3 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和 电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1、保密（ ），在 年解密后适用本授权书。 2、不保密（ ） （请在以上相应括号内打“”） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 4 目 录 中文摘要 英文摘要 1 前言 物青枯病的发生与危害 枯病原菌的分类地位 主范围 害特性 枯雷尔氏菌 多态性研究 染特性多态性 主分布多态性 态特征多态性 传特性多态性 枯雷尔氏菌的种下分类 理小种 化型 清型 源型 病型 因型 肪酸甲酯 (图分析方法的研究现状 理 法 用 图分析方法在微生物鉴定中的应用 图 分析方法在微生物多样性研究中的应用 论文的研究内容、目的及意义 2 材料与方法 验材料 株 养基 品试剂 备仪器 生物学试验基础方法 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 5 原菌的分离、纯化与鉴定 株平板培养 株液体摇床培养 体血球板计数 落计数 体保存 验方法 枯雷尔氏菌的分离与形态观察 枯雷尔氏菌的分离 本的采集 离方法 枯雷尔氏菌形态多态性观察 枯雷尔氏菌菌落形态观察 枯雷尔氏菌单细胞形态观察 枯雷尔氏菌种下分类的研究 理小种测定 化型测定 病型测定 枯雷尔氏菌脂肪酸 的检测与 分析 枯雷尔氏菌脂肪酸 的测定 肪酸的提取 肪酸的检测 同培养条件对青枯雷尔氏菌脂肪酸分布的影响 养基的影响 养温度的影响 养时间的影响 的影响 枯雷尔氏菌 脂肪酸 多态性分析 一寄主分离的青枯雷尔氏菌的脂肪酸分布多态性 同寄主分离的青枯雷尔氏菌的脂肪酸分布多态性 枯雷尔氏菌 脂肪酸多态性的 聚类分析 肪酸 型 与青枯雷尔氏菌种下分 类 的关系 肪酸 型 与 生理小种 的关系 肪酸 型与 生化型 的关系 肪酸 型 与致 病型的关系 枯雷尔氏菌 脂肪酸型 判别模型的建立 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 6 3 结果与分析 枯雷尔氏菌形态特征 落形态特征 细胞形态特征 枯雷尔氏菌种下分类 枯雷尔氏菌 生理小种 的测定结果 枯雷尔氏菌 生化型 的测定结果 枯雷尔氏菌致病型的测定结果 枯雷尔氏菌脂肪酸 的检测与 分析 枯雷尔氏菌脂肪酸 模式图 (图 )分析 同培养条件对青枯雷尔氏菌脂肪酸分布的影响 养基的影响 养温度的影响 养时间的影响 的影响 枯雷尔氏菌 脂肪酸 多态性分析 一寄主分离的青枯雷尔氏菌的脂肪酸分布多态性 同寄主分离的青枯雷尔氏菌的脂肪酸分布多态性 枯雷尔氏菌脂肪酸多态性的 聚类分析 肪酸 型 与青枯雷尔氏菌种下分 类 的关系 肪酸 型 与 生理小种 的关系 肪酸 型 与 生化型 的关系 肪酸 型 与致病型的关系 枯雷尔氏菌脂肪酸型判别模型的建立 4 结论与讨论 枯雷尔氏菌种下分类 枯雷尔氏菌脂肪酸分布特征 同培养条件对青枯雷尔氏菌脂肪酸分布的影响 枯雷尔氏菌 脂肪酸 多态性分析 肪酸 型 与青枯雷尔氏菌种下分 类 的关系 枯雷尔氏菌脂肪酸型判别模型的建立 论与展望 参考文献 致谢 附录 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 7 摘 要 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌 (起的毁灭性土传病害， 是最重要的作物病害之一。 在寄主范围、地理分布、致病特征、流行特征、种下分类 等方面存在较大的差异，具有明显的多态性。 本论文研 究 40 个菌株的生理小种、生化型和致病型； 利用 气相色谱技术检测菌株细胞内的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多态性；研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与青枯雷尔氏菌现有种下分 类 方法之间的关系 ；并利用统计分析方法初步探讨脂肪酸型判别模型的建立。 研究结果表明， 青枯雷 尔氏菌在 菌体形态、 致病性、生理生化等方面都存在 较大 的差异，呈现出明显的多态性分布 。 青枯雷尔氏菌生理小种 1 的菌株在致病力上存在着分化，属于不同的致病型；生化型的划分与其致病型的划分不存在相关性。 在一定范围内，青枯雷尔氏菌生理小种和生化型对于标记菌株特性具有一定的意义 ，但是， 其分析结果对致病力分化的分析作用，值得进一步探讨。 脂肪酸多态性研究结果表明， 同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌，其脂肪酸都存在着明显的多态性；对 40 株青枯雷尔氏菌的脂肪酸进行聚类分析，可以聚成三类，即 脂肪酸 I 型 、 脂肪酸 和 脂肪酸 ；青枯雷尔氏菌生理小种 1 存在着不同的脂肪酸 型 ，青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生化型之间不存在相关性，但是脂肪酸和致病 型 之间存在一定的相关性： 脂肪酸 I 型 为无致病性菌株， 脂肪酸 为过渡性菌株， 脂肪酸 为强致病性菌株。 青枯雷尔氏菌 脂肪酸型 判别模型 的建立 ： 于一个未知脂肪酸型的青枯雷尔氏菌菌株，首先测定脂肪酸谱图，取出 14:0)、 17:0)、 18:0)，代入方程，计算 1 2 时，归为脂肪酸 I 型，当 2 3 时 ,归为脂肪酸 ，当 时 ,归为脂肪酸 ， 模型的 判别准确率达 达到了实用水平，说明了该建模方法思 路合理。 脂肪酸 已广泛应用于细菌 鉴定 中 ，但是 对 同一种细菌脂肪酸多态性的分析尚未见报道。 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间的相关性有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴 定的新指标。 青枯雷尔氏菌的脂肪酸型的研究，为其种下分 类 建模的标准化和计算机自动分析方法的建立，提供可靠的基础。脂肪酸型的模型建立也为其他植物病原菌的致病性研究提供了思路和方法。 关键词：青枯雷尔氏菌；脂肪酸；多态性 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 8 on is a of as as . 0 . in by . to to to of to up . It no to . In to . is to . on by of of . of to to I in II to It of no to . to to of to up 4:0( 17:0( 18:0(to as up on of . 枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 9 be by of to be in . of . up to 枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 10 1 前言 物青枯病的发生与危害 枯病原菌的分类地位 青枯病从发现至今已有 140 多 年的历史 ， 美国 其病原物定名为青枯假单胞杆菌 ( 研究表明 ， 假单胞杆菌(为 5 个 源群，青枯假单胞杆菌包括在 源群 1。根据 子杂交，以同源性分析为基础，建议将其列入 2。通过对 16S 因序列测定 和 聚类分析 等 大量工作，青枯病 原菌 被列入 雷尔氏 属 ( 与 同一属 ，名为 青枯雷尔氏菌 (et 3,4。青枯病原菌的中文名称也经历了变化，起初称为青枯假单胞杆菌，随着其分类地位的变化，而后称为青枯雷尔氏菌 5，本研究中采用的青枯病原菌的中文名为青枯雷尔氏菌。 青枯雷尔氏菌 属变形菌门 (、 - 变形菌纲(伯克氏菌目 (伯克氏菌科 ( 雷尔氏 属 ( 主范围 青枯雷尔氏菌引起的 植物 青枯病， 主要分布在热带、亚热带和温带地区 。 青枯雷尔氏菌可危害 44 个科的 300 多种植物 6， 表现出高度的侵染寄主的多态性，被侵染的寄主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有种子植物和被子植物，有双子叶植物和单子叶植物等。 危害较重、分布较广的主要寄主有马铃薯、番茄、烟草、茄子、辣椒、花生、姜、香蕉、 甘薯 、麻等 7。近年又陆续有报道在油橄榄、桑、木麻黄、木薯、番荔枝、澳洲松、桉树等木本植物，以及蚕豆、大豆、豇豆、羽扇豆、南瓜、大白菜、萝卜、茴香、棉花、三叶草、聚合草、草莓等草本植物上也发生青枯病 ，可以说青枯病是危害最大、分布最广、造成损失最重的植物病害之一 8。 害特性 郑继法等 (1997)研究指出，青枯雷尔氏菌侵害寄主 (特别是茄科寄主 )后，寄主植物 (如番茄、辣椒、茄子等 )在发病时出现青枯症状，即植物的叶子萎蔫下垂，但叶子仍呈绿色。发病初期，部分叶子发生萎蔫；发病中期，大部分叶子在阳光下发生萎蔫，在早晚恢复正常；发病后期，萎蔫的叶子无法恢复。青枯萎蔫作为青枯雷尔氏菌危害寄主植物的重要致害特征。横切病株茎部可见到维管束变褐，用手挤压，有白色菌脓从切口处溢出，此法可作为田间快速诊断青枯 病的方法之一 9。 结合各地生姜、番茄、辣椒、茄子、烟草、花生作物的生长期，在各作物进入生殖生长初期，气温在 28 以上，晴雨交替的日子，青枯病较为多发。青枯病对茄科植物的危害尤为严重。我国南方各省茄科作物上都有青枯病发生危害，对南京地区茄科作物青枯病调查结果表明，一般田块发病率为 25%严重田块可达 80%10。马铃薯青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 11 对青枯病十分敏感，通常导致产量损失 20%严重时损失可达 75%以上 11。番茄生长过程经常受到青枯病的危害，特别在番茄结果期，适逢高温高湿的雨季，可引起毁灭性的 危害 12。福建烟草的青枯病 发病率一般为 10%严重田块 为 100，以至全田烟草枯死 绝收， 此病已成为福建烟草生产的主要障碍之一 13。此外，在花生、生姜、甘薯等作物上，青枯病发生亦很严重，易感病作物面积近 044。随着研究的进展，青枯病原菌新寄主不断发现 15。全球气温变暖等因素，在世界范围内，青枯病发生危害越来越严重 16。近年来，我国南方桉树、木麻黄、桑树等林木青枯病害发生爆发，造成林业生产巨大经济损失 17。 枯雷尔氏菌多态性研究 青枯雷尔氏菌是一个比较 复杂的细菌，适应性强，寄主范围很广 18，青枯雷尔氏菌在寄主范围、地理分布、致病特性、流行特征、生理小种分化上存在较大的差异 19， 具有明显的多态性 。 染特性多态性 青枯雷尔氏菌可危害 44 个科的 300 多种植物 6， 被侵染的寄主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有种子植物和被子植物，有双子叶植物和单子叶植物等，表现出高度的侵染寄主的多态性； 不同植物、不同地点、不同季节青枯病流行规律表现出多态性。对生 姜青枯病 而言， 始发病期是 5 月中下旬 ； 7 月中旬至 9 月中旬为主发病期，此阶段土温 在 28C 左右，土壤高温，病害易发生流行 ； 9 月中旬后病势下降， 10 月中旬停止，发病期达 140d 左右 20。 主分布 多态性 青枯雷尔氏菌在不同寄主植株体内的分布及致病力存在显著差异，番茄和茄子病株体内青枯雷尔氏菌的平均含菌量显著高于烟草、花生和生姜，青枯雷尔氏菌的致病性大小依次为生姜 番茄 花生 烟草 茄子。青枯雷尔氏菌在不同侵染状态植株体内的分布及致病力存在显著差异，以茄子、花生和生姜健康与病株分析为例，仅有花生的健康与发病植株同时存在着青枯雷尔氏菌，而茄子和生姜健株无青枯雷尔氏菌侵染。 青枯 雷尔氏菌在不同发病阶段植株体内的分布及致病力差异显著，在茄子发病初期，植株下部茎青枯雷尔氏菌的含菌量均显著高于中上部茎；当病程发展到中期时，植株体内不同部位青枯雷尔氏菌的含菌量均显著下降，从发病中期到后期含菌量未发现显著性差异，但是，随着发病进程，青枯雷尔氏菌弱化指数下降，致病性则大大增强 14,21。 态特征多态性 不同作物上分离的青枯雷尔氏菌形态存在着多态性，同一作物的不同时间、不同地点病株上分离的青枯雷尔氏菌形态存在着多态性，同一病株分离的青枯雷尔氏菌形态也存在着多态性，同一青枯雷尔氏 菌分离产生的青枯雷尔氏菌形态同样存在着多态性 21。对青枯雷尔氏菌基本形态的描述有短杆状、椭圆形、短椭圆形、长椭圆形等等，其大小也有近两三倍的差异 22。青枯雷尔氏菌的大小和形状与寄主植物、菌株同源性、菌落特青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 12 性、致病性等无必然的联系。对青枯雷尔氏菌不同条件下形态多态性的研究， 提示了青枯雷尔氏菌的不同株系可以同时存在， 其多态性 与特定的寄主、时间、空间 等因素变化有关，不同的菌系对外界条件的适应性不同，表现出竞争的差异性，形成 了 菌系 的 多态性。这种多态性对于研究致病性变化具有重要意义。 传特性多态 性 用 究青枯雷尔氏菌 遗传物质的异质性，能很好揭示其多态性。 1996 年日本学者从发生青枯病的茄子和番茄分离了 18 株青枯雷尔氏菌，用 法进行分析，结果表明，不同寄主的青枯雷尔氏菌菌株存在着较高的遗传多态性，不同地区的菌株遗传多态性差异显著。不同寄主青枯雷尔氏菌存在着不同的菌系 23。 何自福等从 200 个随机引物中筛选出 17 个引物用于上述 31 个菌株 析，共扩增出 523 条带，其中 468 条为多态性带，占 聚类分析这 31 个菌株，又可聚为 4 个簇群：第 的丰顺、金丰等抗病番茄品种上；第 群分离自抗病的番茄新品种新星、年丰和石碣紫红茄上；第 群主要分离自辣椒和茄子；而第 子和辣椒这 3 种寄主植物。上述试验结果说明，广东茄科青枯菌的致病力存在明显的分化现象，其 在较高的遗传多样性 24。 枯雷尔氏菌的种下分类 青枯雷尔氏菌的种下分 类 复杂， 前人主要从生理小种 (25、生化型 (26、血清型 (27、溶源型 (28、 致病型 (29、 基因型 (30等方面对种下分 类 进行研究 。 理小种 生理小种 (据青枯雷尔氏菌对不同寄主致病性的表现进行划分。 生理小种分为 3 个类型，选用茄子与香蕉作为鉴别寄主，采用排除法，即若不侵染香蕉则非生理小种 2，若可侵染茄子则非生理小种331。 国际上对青枯雷尔氏菌种下分类研究较多 ，卢同 (1998)综述了国际上对青枯雷尔氏菌 生理小种分类标准 ： 能侵染烟草及多种茄科植物，浸润于烟叶上能产生坏死枯斑反应，在含 ；能侵染香蕉和海力康 (浸润烟叶产生过敏反应，在 ；侵染马铃薯和番茄，对烟草弱侵染，在烟叶上形成黄化斑，在 ；能侵染马铃薯和茄子、浸润烟叶产生过敏性反应，酪氨酸酶活性中等的定为生理小种 432。 我国一些植病学者对木麻黄、甘薯、马铃薯、花生、聚合草、油橄榄、姜、桑等作物青枯雷尔氏菌的生理小种进行研究，结果表明：桑青枯雷尔氏菌属于生理小种 1 和 4，马铃薯青枯雷尔氏菌属于生理小种 1 和 3，而木麻黄、花生、聚合草、油橄榄、姜、番茄、甘薯等作物的青枯雷尔氏菌均属于生理小种 117,25,32 化型 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 13 生化型 (据青枯雷尔氏菌对生化物质的利用进行划分。自 60 年代以来，国际上对不同寄主的青枯雷尔氏菌株的生化型进行了研究，澳大利亚的 据青枯雷尔氏菌株对 3 种双糖 (乳糖、麦芽糖、纤维二糖 )和 3 种六碳醇 (甘露醇、甜醇、山梨醇 )的利用情况，把青枯雷尔氏菌区分为 4 个生化型 36。张广民等对山东省姜瘟病株进行了 生化型研究，表明山东省姜瘟病菌存在 个生化型 37。曾宪铭等分析了 13种作物上的青枯雷尔氏菌的生化型，发现来自茄子的青枯雷尔氏菌属于生化型 同地点采集的青枯雷尔氏菌的生化型存在着差异 26。林美琛等分析了浙江省番茄青枯雷尔氏菌的生化型，表明属于生化型 占 生化型 I 的占 生化型 占 还有 新型 ，无法划入现有的生化型分类标准 38。同一菌株在无菌水中保存一段时间后，其生化型会发生变异，这表明青枯雷尔氏菌的生化型并不是一个稳定的分 类特征，因此生化型的划分在分类学是否有意义值得进一步探讨。 清型 血清型 (根据青枯雷尔氏菌对血清的交互凝集反应进行划分。从 80 年代开始，我国研究青枯雷尔氏菌的学者，采用交互凝集反应法和琼脂双向扩散法，对桑和木麻黄的血清型进行了研究，结果表明：桑和木麻黄青枯雷尔氏菌分属于血清型 I、 以代表不同生化型的 4 个青枯雷尔氏菌的膜蛋白为免疫原制备了 4 个相应的抗血清，对我国植物青枯雷尔氏菌的血清分型进行了研究，琼脂双扩散试验结果表明：来自我国 6 个省的 19 种寄主植物的 212 个青枯雷尔氏菌株可分为 8 个血清型，其中血清型 I 为优 势类群，包括茄科主要植物等 13 种寄主的 147 个菌株，占全部供试菌株 6939,40。 90 年代福建省农科院采用酶联免疫吸附法 (应用单克隆抗体技术，用甘薯青枯雷尔氏菌免疫的 小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交融合，建立了 4 株分泌抗甘薯青枯雷尔氏菌的特异性、有鉴别力的杂交瘤细胞株： 中杂交瘤细胞株染色体数范围为 98 测定 156 株甘薯青枯雷尔氏菌的血清型，结果表明：甘薯青枯 雷尔氏菌可分为 7 型 (27。 源型 溶源型 (利用青枯雷尔氏菌对植物病原菌噬菌体的专化性反应进行划分。采用单层平板法，用分离自桑青枯雷尔氏菌的噬菌体 定 19 个桑青枯雷尔氏菌株，结果表明：桑青枯雷尔氏菌噬菌体 侵染桑青枯雷尔氏菌株而不侵染番茄、花生、木麻黄、马铃薯、辣椒、烟草、姜和甘薯的青枯雷尔氏菌株，用两个噬菌体可将 19 个桑青枯雷尔氏菌株区分为 6 个溶源型 28。 由于溶源型分化检测方法的测定过程复杂，噬菌体的分离保存难度大，目 前很少应用于青枯雷尔氏菌种下分类的研究。 病型 致病型 (根据青枯雷尔氏菌 对寄主的致病性差异进行划分。植病工作者根据青枯雷尔氏菌对寄主的致病性差异划分为不同致病型：分为强、弱或强、中、弱或更多的致病类型。 卢同等 (1998)对作物青枯雷尔氏菌致病型的研究进行了综述 32，认青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 14 为对作物青枯雷尔氏菌致病型的确定，关键在于鉴别品种的选择。 在研究中，对鉴别寄主的选择上，有的学者是选择对青枯雷尔氏菌抗感反应敏感的，鉴别性能稳定的，室内抗感反应与大田实际鉴别结果相一致的代表性品种 作为鉴别寄主 41。有的学者是把青枯雷尔氏菌的数百个菌株与同一作物的数百个品种致病反应结果进行聚类分析，用相关系数作为聚类的相似性指标，用类平均法进行系统聚类分析，把经过聚类分析选定的品种作为鉴 别 寄主 42。 黄福新等 1998 年对广西 21 个产烟县收集的 65 个菌株进行了分析，以烟草、马铃薯、番茄、茄子、辣椒、花生、香蕉为鉴别品种，结果表明强致病性菌株占 不同地方存在差异很大 29。王国平等 (1996)以烟草 鉴别品种，分析分离自湖南省烟草上的青枯雷尔氏菌菌株，结果表明强致病性菌株占 采用不同的鉴别品种，对青枯雷尔氏菌致病力类型划分有很大的影响 43。 因型 对基因型 (研究报道，目前多见于国外 。 1992)设计了两对不同的引物，利用聚合酶链式反应 (测青枯雷尔氏菌，引物 青枯雷尔氏菌具有高度特异性；另一对引物 6S 物 6S 青枯雷尔氏菌是非特异性的 30,44。 1999)采用特异性 引物 7株不同的青枯雷尔氏菌进行检测 45；所用引物 4个碱基的片段，在不同的菌株组之间显示该片段存在许多点突变。 肪酸甲酯 (图分析方法的研究现状 脂肪酸是生物体内不可缺少的能量和营养物质， 是生物体的基本结构成分之一，在细胞中绝大部分脂肪酸以结合形式存在，构成具有重要生理功能的脂类，它是构成生物膜的重要物质；是 有 机体代谢所需燃料的贮存形式；作为细胞表面物质与细胞识别、种族特异性和细胞免疫等密切 相关 46,47； 具有结构多样性和高的生物学特异性，是特别有效的生物标记物 48。目前脂肪酸作为一类重要的生物活性物质，已经引起了 国内外同行的相当重视 。 脂肪酸甲酯 (图分析方法是鉴于脂肪酸可作为生物标记物而发展起来的分析技术。 过分析微生物细胞膜上磷脂脂肪酸 (组分来鉴定微生物的种属、分析微生物多样性，是一种简便、可靠的分析方法。由于用于 以该方法又称为 理 图分析方法的原理是基于脂类几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分 ,不同微生物体内往往具有不同的磷脂脂肪酸组成和含量水平，其含量和结构具有种属特征或与其分类位置密切相关，能够标志某一类或某种特定微生物的存在，是一类最常见的生物标记物 49,50,51。但是古生菌不能使用 图进行分析 ,因为它的极性脂质是以青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 15 醚而不是酯键的形式出现 52。此外 ,磷脂不能作为细胞的贮存物质 ,一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化 合物就会马上消失 ,因此，磷脂脂肪酸可以代表微生物群落中 存活 的那部分群体 53。 法 利用有机溶剂将样品中的脂肪酸浸提出来，然后进行分离纯化，将磷脂脂肪酸甲基化转化成脂肪酸甲酯，最后利用标记脂肪酸，通过气相色谱等仪器分析，得到样品的磷脂脂肪酸组成图谱，进而得到不同脂肪酸的含量和种类，即所谓的 图 1)。根据谱图中脂肪酸甲酯的多样性，利用相关的数据库和相关的计算机分析软件，便可鉴定出样品中微生物的种类或得到样品中微生物群落结构组成多样性、比 例以及微生物生物量等方面的信息。对于该研究，主要是通过气相色谱 (以及气相色谱 用实现的，由于脂肪酸本身挥发性较小，所以要将脂肪酸甲基化转化成脂肪酸甲酯以增加脂肪酸的挥发性，供 图 1 he 应用 图分析方法在微生物鉴定中的应用 脂类是最常见的生物标志物， 现代微生物学研究表明：微生物细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与微生物 种微生物具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱 54，脂类 作为标志物用于细菌鉴定早在 60年代就开始了 48。 利用 从细胞组分水平上鉴定微生物的重要内容，开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径。不同微生物的脂肪酸在组成和含量上有较大差异，它和微生 物的遗传变异、耐药性等有极为密切的关系。大多数革兰氏阳性菌 (G+)中支链 脂肪酸丰度很高，而在大多数革兰氏阴性菌 (菌中 丰度较高 55。一些细菌如考克斯氏体属、土拉弗朗西丝菌属 56、假单胞菌属和结核分枝杆菌属细菌 57有其特殊的脂类，可经磷脂脂肪酸分析实现鉴定。短链脂肪酸已经用于陆源厌氧细菌的鉴定。 成功的测定了分枝杆菌属 4株菌的脂肪酸，确定其主要由 16种脂肪酸组成，并分析了它们之间的差异 58。张文君等报道海洋细菌不同属的脂肪酸甲脂链的长短、双键位置及取代长度会 各有差异，这意味着甲脂化可以作为海洋细菌的分类和鉴定的一种方法 59。张国赏等用气相色谱 功地坚定了 7个属的 12株菌 46。 根据微生物细胞脂肪酸的组成，一般可通过单次实验比较准确的将微生物鉴定到脂肪酸提取 脂肪酸纯化 他类酯化合物 析 样品 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 16 种，但是脂肪酸是一种可随着培养条件变化而发生改变的细胞组分，并且气相色谱、质谱等是高精密度的分析仪器，因此，分析过程的条件选择和质量控制则显得非常重要，必须对培养基成分、微生物培养条件、微生物纯化、菌龄、色谱条件等实验条件进行标准化，否则会严重影响方法的准确度和重复性。 目前已有一种商业化 的微生物 生物鉴定系统 (美国 ， 落的收集、微生物细胞皂化释放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的萃取和洗涤，到最后的鉴定、结果的判断都有一套完整的标准化程序，可以避免上述不利条件的影响。 微生物在标准的培养条件下培养和收获，经过氢氧化钠和甲醇试剂皂化和甲基化，通过正己烷和叔丁基乙醚的萃取，再经氢氧化钠洗涤后，注入 统中分析。系统根据各脂肪酸组分保留时间计算等链长 (确定目标组分 的存在、采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度 (从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果。一般以最高 菌种名称作为鉴定结果，但当其报告的几个菌种的 较接近时，则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断。 生物鉴定系统分析的脂肪酸碳原子数是 9间，碳原子数小于 9 或者大于 20 的脂肪酸不被该系统分析。生物鉴定系统具有分析周期短、操作简单、准确度高等优点，目前国内外 已有将 用于微生物鉴定的文献报道 60,61。 图分析方法在微生物多样性研究中的应用 生物多样性是当今国际上共同关注的问题，它也因此日益成为学术界的热点研究领域之一。土壤微生物多样性一直是微生物生态学研究的重要内容。总 菌和放线菌是特异的，且大多数情况下磷脂脂肪酸的某专一类型在某一土壤微生物分类群中占优势 62,63，至今，已经积累了大量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据。一般来说，生物细胞膜中所含的 ：真菌大多含有多个不饱和键， 及 细菌往往不含有多个不饱和键的脂肪酸，它含有的主要是链长为奇数的、带支链的、主链上含有环丙基或羟基的脂肪酸， 、 、 、 、 、 、 10代表放线菌指标；G+含有较大比例的带支链的脂肪酸； 除广泛的用于土壤微生物多样性的分析外， 还应用于 沉积物、地下水，以及与水处理相关的生物膜和菌胶团等微生物群落结构和功能的研究中 64,65。. 989年用 人们提供了一种分析沉积物样品生物多样性的简便方法 66。 67。 . . 析生物膜上捕食 (应对微生物生物量、群落结构、营养状况、新陈代谢活动的影响 49。 青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究 17 论文的研究内容、目的及意义 细菌性青枯病是危害严重的植物病害，其分布范围之广，为害作物种类之多，引起了各国植病工作者的关注。 1976 年，在美国举行了第一届国际细菌性青枯病学术研讨会68； 1985 年，在菲律宾又举行了亚太地区细菌性青枯病学术研讨会； 1992 年在中国台湾举行了亚洲细菌性青枯病学术研讨会 69； 1994 年在中国武汉召开了花生细菌性枯萎病害研讨会 70； 1997 年，在法国举行了第二届国际细菌性青枯病学 术研讨会； 2002 年初，在南非又举行了第三届国际细菌性青枯病学术研讨会，各国植病工作者都极为关注青枯病的研究，以期能在世界范围内控制青枯病害。 对于细菌性青枯病的防治，前人已做了大量的工作，提出了多种防治措施。农业轮作防治方法是防治青枯病的有效措施 71,72，但是由于我国人多地少，耕地有限，此措施运用受到极大的限制，所以轮作措施也只是在局部地区起到部分防治作用 73。从理论上讲，青枯病防治最根本的防治办法是培育抗病品种 74，国外已有这方面报道，采用培育抗病品种的方法，培育了 80 种抗青枯病的品种 70。但是，青枯雷尔氏菌为土传病害，其腐生性较强，存在着许多不同的生理小种，抗病育种工作就显得更为复杂和艰巨 75。在化学防治上，虽然室内的毒力测定筛选出不少对青枯雷尔氏菌有较好抑制作用的药剂76，由于病原细菌从土地表层到深层均有分布，由根部侵入植株移到导管而引起青枯病77，所以田间防治效果不稳定，难以控制病害 78，迄今为止还没有一种化学农药可以有效地控制青枯病的发生，青枯雷尔氏菌对化学农药产生抗药性，大量使用化学农药造成环境污染和生产成本的上升，所以化防也不是经济合理的措施 32。 近年来 ，青枯病的生物防治越来越引起国内外的重视 79。用于青枯病生物防治的因子主要集中于 霉菌、假单胞杆菌、芽孢杆菌、菌根真菌等。目前已发现对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的微生物主要有：多粘芽孢杆菌 (荧光假单胞杆菌 (其它的芽孢杆菌方面的拮抗菌，国内外有不少研究用这些拮抗菌防治细菌性青枯病，取得不同程度成功的例子，如弱毒力青枯雷尔氏菌的利用80、荧光假单胞杆菌 81等。尽管如此，青枯雷尔氏菌的生物防治还不能适应生产需 要，青枯病生防菌仍处于研究阶段，防治效果不稳定，青枯雷尔氏菌的生物防治仍然存在许多困难。而通过土壤添加剂改造土壤中微生态环境，使之向不利于青枯病的转化，能起到防治青枯