【毕业学位论文】（Word原稿）青海血蜱cDNA表达文库的构建和“隐藏抗原”基因的筛选、克隆与表达预防兽医学硕士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 青海血蜱 达文库的构建和“隐藏抗原”基因的筛选、克隆与表达 of s of 海血蜱 达文库的构建和“隐藏抗原”基因 的筛选、克隆与表达 摘 要 青海血蜱 （ 及其传播的血液原虫病严重威胁着我国畜牧业的发展。目前对蜱的防治主要以药物防治为主。但随着蜱耐药性的产生以及环境污染和药物残留等严重公共卫生问题的出现迫使人们寻求防治的新途径。在众多控制蜱的方法中，免疫学防制是前景最诱人的方法。本研究采用两种不同的免疫途径制备了羊抗青海血蜱唾液腺蛋白阳性血清和羊抗青海血蜱唾液蛋白阳性血清。应用 法，将上述两种血清分别与青海血蜱唾液腺蛋白提取物杂交以进行蛋白的差异 显示。结果表明 羊抗青海血蜱唾液腺蛋白阳性血清能识别青海血蜱唾液腺更多的蛋白带。这些差异蛋白的分子量分 别为 4931 通过制备性电泳，将所发现的差异条带切取回收并免疫家兔，获得兔抗青海血蜱差异蛋白阳性血清。以 半饱血青海血蜱的唾液腺、马氏管和卵巢等器官为材料，构建青海血蜱的 达文库 ,库容量约为 2 106 利用兔抗青海血蜱差异蛋白阳性血清对青海血蜱 达文库进行免疫学筛选 ,共获得 5 个阳性克隆 。经鉴定这 5 个基因均为青海血蜱所固有的新发现基因，它们的大小 依次为 1085726617847 1178在大肠杆菌中分别对 因进行了表达，利用表达产物免疫 羊所得阳性血清能与青海血蜱天然蛋白发生免疫学反应。说明表达产物具有良好的免疫原性和反应原性。这为研制青海血蜱的分子疫苗奠定了基础。 关键词 ：青海血蜱 ,兔抗青海血蜱差异蛋白阳性血清 ,达文库 ,免疫学筛选 ,诱导表达 he of to is of a of as of as as of by In by By to by of of 931by A a 06 as . of 085726617847bp 178bp to to be by of be a of V 目 录 第一章 绪论 1 究目的和意义 1 内外研究现状 2 能性抗原的选择 2 商业化的抗蜱疫苗 6 蜱免疫的评价标准 7 究内容和方法 7 第二章 青海血蜱唾液腺及其分泌物中蛋白组分的差异显示及兔抗青海血蜱差异蛋白阳性血清的制备 9 10 料 10 验方法 11 验结果 20 20 20 20 21 第三章 青海血蜱 达文库的构建 23 料与方法 24 料 24 验方法 25 果 33 33 链 测结果 34 片段 选择 34 库基础库容量 34 增文库库容量 35 论 35 第四章 青海血蜱 达文库的免疫学筛选和阳性克隆的克隆与鉴定 39 方法 40 料 40 法 40 果 47 阳性克隆的筛选结果 47 性克隆的鉴定 48 用 48 论 49 第五章 阳性克隆的诱导表达及其免疫原功能的初步分析 52 料与方法 53 料 53 法 53 果 56 组质粒诱导表达的结果 56 组蛋白的免疫活性分析 56 论 56 第六章 结论 59 参考文献 60 附录 66 致谢 76 作者简历 77 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 究目的和意义 蜱 (于节肢动物门（ 蛛形纲（ 蜱螨目 (蜱亚目（ 蜱总科（ 该总科又分为三个科，即硬蜱科（ 软蜱科 (纳蜱科 ( 孔 繁瑶， 1981；汪明， 2003）。目前世界已知蜱总科的种类约 800 余种，其中硬蜱科 (最大多数，包括 3 个亚科共 13 属约 650 种，其次为软蜱科，包括 4 属共约 100 种，纳蜱科种类最少，截止目前，只记录了一属一种（ 邓国藩， 1978）。在我国，已记录的蜱有 101 个种和亚种，分别隶属于 9 个属，其中以血蜱属的种类最多，共 43 种，约占总数的 2 5，硬蜱属 20 种，约占总数的 1 5，牛蜱属种类最少，只有一种（ 邓国藩等， 1991）。蜱是家畜体表的一种吸血外寄生虫，少数寄生于鸟类、爬虫类，个别寄生于两栖类。其生 活史为不完全变态，可分为卵、幼虫、若虫和成虫四个时期（ 孔繁瑶， 1981）。蜱是许多脊椎动物的吸血寄生虫，它能引起被感染动物贫血、食欲减退、体重下降、血液成分变化等。如日本和澳大利亚学者(et 1993)的研究表明微小牛蜱（ 使被感染牛的外周血淋巴细胞中的 T 淋巴细胞减少，而重度感染的牛的 B 淋巴细胞也会减少，也能抑制牛的免疫应答。正是由于这种免疫抑制才使得蜱的存活及蜱传病的发生成为可能。蜱及其传播的血液原虫病是人和家畜疾病的重要来源，同时它还传播多种 病毒、立克次氏体、原虫、蠕虫、螺旋体及细菌类疾病。其中大多数是重要的自然疫源性疾病和人畜共患病，严重危害人畜健康，制约着畜牧业可持续发展。青海血蜱（ 1978 年由邓国藩命名的一个新种，分布于青海、甘肃、宁夏、四川、云南等海拔高度在 1， 600 4， 200 米的区域，国外未有记录。该蜱主要寄生于绵羊、山羊。成蜱和若蜱 4 7 月份活动， 5 月份最多，随后逐渐消失， 9 月份又出现， 11 月份消失。该蜱生活于山区草地或灌木丛，属三宿主蜱，在自然界（高寒地区） 3 年完成 1 个世代 ，在实验室内 1 年能完成一个世代（袁改玲等， 2002）。已证实青海血蜱是羊泰勒虫（ 和中华泰勒虫 (及羊的巴贝斯虫（ 的传播媒介 (et 2002；et 2002a, 2002b, 2004)，同时也能传播一种感染牦牛的泰勒虫（ （ et 2002c）。 传统防治蜱的方法是化学防治，由于化学药物需恰当使用加之成本昂贵使得该法耗资巨大，许多小农场主也因不能 接受防治成本是该病长期反复感染的原因之一。然而，更主要的问题是蜱不断出现抗药性及药物造成的环境污染。例如，在澳大利亚，微小牛蜱已对砷、有机磷农药、氨基甲酸等多种药物产生抗药性（ et 1994）。从社会和科学关注的角度看，完全依赖化学药物预防不是长久之计，需研制一种能替代化学防治的方法，这样才能符合农业可持续发展的要求。而且随着免疫学、分子生物学和生物技术的发展，使对蜱实施可持续控制（绿色控制）成为可能。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 蜱宿主病原间存在着复杂的免疫反应（ 薄新文等， 1998；袁改玲， 2002）。其 一，蜱及其传播的病原体对抗宿主的免疫应答。蜱通常通过绕行、偏离或者抑制等手段来对抗宿主的免疫防御系统。蜱传播的病原体为了生存、扩散和防御宿主对其的消除作用直接导致了病原体对宿主先天或后天特异性获得性免疫的多种防御机制的产生。其中免疫逃避机制包括：抗原变异、抑制某些分子对微生物的杀伤作用、对主要组织相容性复合物分子的负调节和破坏抗原提呈、调节补体系统、偏离 T 淋巴细胞反应、改变由细胞因子介导的信号转导作用和产生伪装趋化因子及细胞因子等。而且，通常一种病原体常能形成多重免疫逃避机制（ et 2001）。其二，宿主对蜱感染的免疫，包括非特异免疫和特异免疫，两者经常协同作用。非特异性免疫又称天然免疫，是动物在长期演化过程中所形成遗传特征，它在一定程度上反映了动物被感染后迅速提高免疫反应水平的能力，品种不同，甚至个体不同，其在天然条件下对感染的反应能力也不同。例如，2002）通过对非洲的大量羚羊进行调查后发现，虽然在野外受到很多蜱的侵袭，但在羊体上蜱的数量极少，这可能是羚羊经常受到蜱的侵袭，在进化过程中逐渐形成了对蜱的非特异性抵抗力。另外，赵忠芳等（ 1998）对不同体况动物自身抗蜱能力 作了研究，发现以卡介苗作为免疫增强剂能提高兔对蜱的抵抗力，提出在蜱活动季节灭蜱时，应该考虑动物身体状况，加强动物营养，对种用动物以免疫增强剂进行接种，以减少疾病的发生。特异性免疫又称获得性免疫，为后天所获得。这种免疫是由于作为抗原的寄生虫激发宿主机体所产生的一系列识别与排斥的复杂的生物学反应。特异性免疫清除相应抗原的能力，显著强于非特异性免疫力，是进行人工免疫的基础。这种后天获得的特异性免疫不能遗传（童竞亚， 1996）。蜱吸血能诱导宿主的免疫应答，当宿主获得抗蜱免疫后可导致蜱吸血量减少，饱血程度下降，吸血 时间延长，产卵量下降，以及蜱和卵的死亡率升高等。蜱叮咬的部位常会有显著的病理变化，当宿主再次被蜱叮咬时，就会发生获得性免疫应答。宿主经蜱诱导产生的免疫反应可使皮肤产生痒觉，刺激宿主的清除反应，使宿主减少荷蜱量。由此可见，宿主对蜱的抵抗力可以有效地控制蜱的感染。如果通过疫苗免疫使宿主从易感变成有抵抗力必然有助于对蜱种群的控制。此种良好前景使得人们开始致力于对宿主免疫机理和疫苗的研究。抗蜱疫苗可有针对性的消灭特异性蜱种，有利于环境保护和人类健康，易于管理且成本低廉。本研究的对象是巴贝斯虫病和泰勒虫病的传播媒介 青海血蜱，其研究结果对于蜱及蜱传病的防治都具有重要意义。 内外研究现状 疫苗免疫是畜禽病虫害可持续控制技术中最为有效的方法之一，家畜外寄生虫病的防治也是如此。 能性抗原的选择 藏抗原”概述 疫苗的开发首先在于功能性抗原的选择，尽管人们多次证实用半饱血微小牛蜱雌蜱的提取物免疫牛能增强牛抗该蜱的能力 (et 1986; et 1996; et 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 1988a;1988b)，但这与疫苗的实际发展相距甚远，因 为研制理想疫苗的前提是保护性抗原的寻找和详细分析。常规的抗原是正常的寄生虫与宿主作用过程中与宿主相接触的寄生虫分子，由于寄生虫与宿主间的选择相容性在进化过程中得以发展，使这些抗原所诱导的保护性免疫在寄生虫控制中的效力不足。上述缺陷使得人们开始寻求内在的生理目标 新的抗原或“隐藏抗原”。这些抗原通常情况下可能不与宿主接触，很可能有较好的免疫原性，能诱导对寄生虫损害更大的宿主的免疫应答。采用不同于传统疫苗研究的技术路线，筛选出外寄生虫在正常发育过程中从未与宿主免疫系统接触的“隐藏抗原”，由这些“隐藏抗原”诱导 的宿主免疫保护可避开寄生虫的免疫逃避机制，因此其免疫原性良好的组分可作为疫苗候选抗原，并可用于研究外寄生虫的免疫机理，探讨以分子疫苗防制外寄生虫感染的新方法，提高对外寄生虫及其传播的传染性疾病及血液原虫病防治的水平，减少有害化学药物对环境及肉、蛋、奶的危害，提高畜牧业可持续发展能力。而且事实也证明科学家们在寻找“隐藏抗原”方面已有很多成功的实践。例如， （ 1972）的研究表明饲喂于用斯蒂芬斯疟蚊（ 肠抗原免疫的兔体上的蚊子比饲喂于未免疫或用整个蚊子的研磨物免 疫的兔体上的蚊子有较高的死亡率，这也许就是“隐藏抗原”的雏形。尽管 (1979a)没有给出“隐藏抗原”的确切定义，但他们还是第一次记录了“隐藏抗原”能显著提高家畜抵抗吸血节肢动物侵袭的能力。 （ 1989; 1995）对微小牛蜱提取物进行组分纯化，并进行免疫攻击试验，利用这种方法已经分离到截止目前最为有效的“隐藏抗原”，如微小牛蜱的 原，并利用该抗原研制成功了抗微小牛蜱的重组疫苗。已发现的“隐藏抗原”还有丽蝇属铜绿蝇的 et 1993)和 捻转血矛线虫的 et 1993)。 发现的功能性抗原 免疫学、分子生物学和信息技术的迅速发展为蜱的功能性抗原的发现及研究提供了有力的手段。截止目前，已从微小牛蜱、长角血蜱、小亚璃眼蜱等多种蜱的唾液腺、肠道、马氏管、卵巢和肌肉等组织与器官中分离和鉴定出多种重要的功能性抗原。利用这些功能性抗原免疫的动物均能产生不同程度的抗蜱免疫。 微小牛蜱有关的功能性抗原 在蜱的免疫学防治方面，对微小牛蜱研究较多也较早，而且 成为最著名的保护性抗原。 原是 (1989)从半饱血微小牛蜱雌蜱肠道中分离出的一种膜结合糖蛋白，分子量为 89000，等电点为 微克级的抗原免疫牛所产生的抗体即对牛有抗蜱保护作用，当微小牛蜱吸食了用 原免疫的牛的血液时，血液中的抗体即与蜱肠道表面的相应糖蛋白结合，从而使蜱肠道受到严重损伤，当牛血液渗入蜱的血淋巴后，能更进一步引起蜱的大规模死亡及繁殖和生存能力的下降等。并已证明 一种“隐藏抗原”。但天然 原在微小牛蜱体内含量甚微，限制了从蜱中大量分离和纯化该类蛋白，于是人们寻求 用分子生物学手段来获得重组蛋白。 (1994)证实 原在不同株的微小牛蜱肠道细胞膜上均有存在，用重组蛋白 备的疫苗对不同株的微小牛蜱以及已经对有机磷农药产生抗性的微小牛中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 蜱都能产生免疫抵抗。该结果提示可用重组 疫牛来防制微小牛蜱。于是 (1989) 构建了一个库容量为 8 105 微小牛蜱 库 , 并根据 内切蛋白酶 化序列设计了 4 个寡脱氧核苷酸探针，用此探针从文库中分离和鉴定出一个编码 其序列包 含一个 1982 个碱基的开放阅读框 , 预测的 组蛋白含有 650 个氨基酸 , 其中包括 19 个氨基酸的信号序列和近 C 端 23 个氨基酸的疏水区。推测的蛋白结构含有由 6 个半胱氨酸残基构成的多次重复区，提示该蛋白含有多个表皮生长因子样结构域。大肠杆菌中对 599 个氨基酸的 白和 651 个氨基酸的 该包涵体免疫的牛对微小牛蜱具有明显的抵抗力。然而，原核表达的重组 函体对动物的免疫保护作用不如天然 是澳大利亚墨尔本大学的 (1990) 利用真菌的 动子系统对微小牛蜱的 因在丝状真菌 进行了高效表达和分泌。表达产物包含 泌信号及其全部成熟多肽，但无疏水碳端。所分泌的 重组蛋白分子量约为 83到 87根据氨基酸序列推测的分子量为 69表达水平约为 ，未在细胞内检测到该重组蛋白。在被转化的细胞中检测到了高水平的编码 巴的 1994) 和1996) 等对在毕赤酵母（ 表达的重组蛋白 生化特性进行了研究，结果显示在该系统中表达的 7到 40的是 1997) 的研究恰恰证实了正是因为这种颗粒状的结构才提高了 原的免疫原性及其在控制微小牛蜱方面的巨大潜力。但可惜的是尽管以重组蛋白 基础的抗微小牛蜱疫苗好多试验中以其对牛的强大保护力征服了广大用户，但在阿根廷 A 株 微小牛蜱面前它却显得苍白无力。于是古巴科学家 (2000) 利用反转录 微小牛蜱 A 株中分离了 因，并在毕赤酵母（ 进行了表达，表达产物为一颗粒状糖蛋白。试验表明以该重组蛋白为基础的疫苗对不同地域的微小牛蜱具有更广谱的抗性。然而通常以单一抗原为基础的抗蜱疫苗往往不如以几种靶抗原为基础的抗蜱疫苗的保护效果，于是人们也在不停地寻找微小牛蜱的其它保护性抗原。例如， （ 1991）从半饱血微小牛蜱雌蜱中分离出 的一种羧基二肽酶，是在微小牛蜱的唾液腺和肠道中大量分布的一种“隐藏抗原”。 （ 1996）证实 增强 为疫苗抗原对微小牛蜱的抵抗作用。（ 1998）也从半饱血的微小牛蜱雌蜱中分离出 原，尽管该抗原对动物的免疫保护性不如 么显著，但当其与 合应用时，能增加后者的免疫性。研究还发现微小牛蜱自然感染宿主不能产生针对 免疫应答，提示它又是一种“隐藏抗原”。免疫荧光分析显示该抗原在蜱肠道、唾液腺和卵巢等的表面广泛分布。另一方面，一些细胞因 子能调节动物的免疫应答， （ 1999）曾尝试用编码 列与一些羊的细胞因子基因联合应用，最后辅以一次 组蛋白来免疫绵羊，并获得了强烈的抗体应答。单克隆抗体技术在寻找抗蜱保护性抗原和评价抗蜱抗体是否对蜱具有损伤性等方面也发挥着重要作用。 (1995) 利用 18 种抗微小牛蜱中肠抗原的单克隆抗体作探针分别与不同发育阶段的微小牛蜱的各种器官杂交，结果证实了常规抗原存在于成蜱的肠道表面、唾液腺型腺泡和马氏管及幼蜱的肠道中，但在成蜱的卵巢和发育中的卵中不存在。在此之前， 他们用单克隆抗体 淀了一种抗原，当用 10 日龄微小牛蜱幼蜱攻击用该抗原免疫的牛时，该蜱的产卵量减少 62%且对牛的保护率达 99%以上。对抗微小牛蜱中肠和生殖管组织的单克隆抗体筛选时发现，有一种单中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 克隆抗体能与不同发育阶段的微小牛蜱的组织中的不同大小的蛋白反应，有一种只与 中肠提取物反应（ et 1991）。在巴西 , (1997) 用微小牛蜱的胚和肠道提取物免疫 c 小鼠，将该小鼠的脾细胞和 骨髓瘤细胞杂交，制备了 四种单克隆抗体。这些单克隆抗体均能识别不同发育阶段的微小牛蜱的组织或器官。当他们将这些单克隆抗体注射入饱血微小牛蜱雌蜱的下腹后，发现单抗 使该蜱的产卵量显著下降。 长角血蜱有关的功能性抗原 (1999)测定了一个能编码分子量为 29胞外基质样蛋白的 隆，所编码蛋白 长角血蜱唾液腺相关，此胞外基质样蛋白的结构类似于胶原蛋白。该蛋白能在饱血或未饱血的长角血蜱成蜱或非成蜱中表达，重组蛋白对兔具有明显的免疫保护作用 ，曾被作为抗长角血蜱疫苗的候选抗原。然而， 组蛋白只能刺激家兔产生抗长角血蜱幼蜱和若蜱的免疫，而对成蜱无任何抗性。于是 (2001) 又对所构建的长角血蜱成蜱的 达文库进行了免疫学筛选，并结合 和 3末端快速扩增技术克隆了两个编码该蜱唾液腺蛋白的 别命名为 析表明此二基因也能在蜱的其它器官中表达。他们在大肠杆菌中成功表达了重组 白，并对其作为抗蜱疫苗抗原的可行性也做了分析，结果显示 种重组蛋白均可作 为抗长角血蜱“鸡尾酒”疫苗的有效成分。蜱的肌肉组织在蜱吸血时发挥着重要作用，自然也有人将寻找保护性抗原的目光盯到了蜱的肌肉组织。 (2001)用经长角血蜱反复叮咬的家兔的阳性血清从该蜱的 达文库中筛选出了 0 基因。其预测的氨基酸序列与黑腹果蝇（ 的肌原蛋白 I 亚基的 隆同源。免疫化学分析结果显示，天然 0 蛋白广泛存在于长角血蜱的各种组织中。同样，一些酶类如几丁质酶、抗氧化酶和丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在蜱的生活史中也是非常重要的。几 丁质酶与蜱的蜕皮、调控新陈代谢和围食膜孔隙度等密切相关。 (2003) 首次从长角血蜱 库中克隆了一个蜱的几丁质酶分子，并在昆虫杆状病毒中对之进行了成功的表达。重组的几丁质酶 有效降解几丁质。该研究预示此重组蛋白可作为抗长角血蜱疫苗的候选抗原。同时由于重组的昆虫杆状病毒能感染蜱，也启发人们去研制一种新的生物杀虫剂。抗氧化酶能及时清除真核生物在有氧代谢过程中产生的氧自由基，从而消除氧自由基对真核生物的毒性作用。 2001) 首次克隆和表达了长角血蜱的一种有酶活性的过氧化物还 原酶 酶在蜱吸血时大量表达，提示它可能是蜱正常生活史中的一种重要解毒酶。对 能的阐明能帮助我们更好的理解蜱唾液腺的生理特性和蜱在吸血时与宿主间的相互作用。丝氨酸蛋白酶及其抑制剂能参与许多生物的发育和生理功能的调节，所以它们或许也是抗蜱疫苗的候选抗原 (1984, 1986; et 1998; et 2001a)。 (2001b)利用 端快速扩增技术（ 隆了长角血蜱的两个丝氨酸蛋白酶基因 （ 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 它功能性抗原 1988) 的研究表明，美洲花蜱（ 叮咬家兔的过程中能向兔体分泌一些物质，在这些分泌物中有三种分子量分别为 41、 40 和 39蛋白能刺激家兔产生抗美洲花蜱的抗体。 （ 1986） 用免疫印迹法证实超敏兔血清能与吸血 96 小时的小亚璃眼蜱（ 蜱唾液中的 9 种蛋白和唾液腺中的 17 种蛋白反应。将从唾液中提取的抗原、和 注入经小亚璃眼蜱叮咬的家兔皮内后，三者均能刺激机体产生速发型变态反应，同时后两者能刺激机体产生迟发型变态反应。实验结果解释了影响抗蜱免疫的机理。 (1996) 用蛔虫提取物（ 种型变态反应的免疫调节剂）和蜱唾液腺提取物（ 弗氏不完全佐剂免疫杂交牛（ 结果表明当作为免疫调节剂的蛔虫提取物与蜱的唾液腺提取物联合应用时，能明显增强牛抗小亚璃眼蜱蜱的免疫力。 2001) 用 认了一种分子量为 39蛋白，它能引发 牛对不同阶段小亚璃眼蜱的抗性。 (2003) 利用 端快速扩增技术（ 隆了附尾扇头蜱（ 四个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（ (2003) 克隆和表达了两种蜱的铁蛋白酶。周金林 (2004) 等也克隆到了镰形扇头蜱和微小牛蜱的多个酶和酶的抑制剂分子新基因。 商业化的抗蜱疫苗 目前 ,已商业化的预防寄生虫的疫苗只有预防微小牛蜱的 et 1995; et 1992）和 (et 1995a)。 抗原成分是 1994年在澳大利亚注册，并进行了大范围的评价，通过生产者的调查，用户的接受程度已很高。在巴西的一项病原管理的项目中进行了野外评价。该疫苗能使免疫牛所感染的蜱的数量下降 89%。古巴生产的抗微小牛蜱疫苗 根据已发表的 列而生产的。截止目前，该疫苗已在古巴、哥伦比亚、 多米尼加共和国、巴西、玻利维亚和巴拉圭等国家注册，在墨西哥、巴西、哥伦比亚和古巴进行了条件试验，并在古巴、巴西、阿根廷和哥伦比亚等国家进行了田间试验 (et 1997)。 (1995b) 在巴西的田间试验显示重组疫苗奶牛、肉牛及杂交牛均有很好的保护作用。且当该疫苗与口蹄疫疫苗和和狂犬病疫苗一起使用时，三者不会互相影响，也不会对被免疫动物产生不良影响。他们建议每 6 周重复免疫一次能一直维持 保护作用。因微小牛蜱是牛巴贝斯虫（ 无浆体（ 的传播媒介，所以抗微小牛蜱疫苗 应用也降低了牛巴贝斯虫病和无浆体病的发病率 (et 1995c; et 1995)。同时，也因该疫苗的使用从总体上增强了牛的体质，从而提高了牛对蝇蛆病等其它疾病的抵抗力 (et 1995)。另一方面，也因该疫苗的使用而节省了对蜱的传统化学疗法及用于治疗蜱传病的巨大开支 (et 1997)。因为计算机模拟可以为疫苗免疫控制方法提供 快速而简便的方式，故用疫苗进行大规模抗蜱免疫程序的计算机模拟工作正在古巴进行，但程序还有待于进一步完善和优化。另外，因许多蜱种之间存在交叉反应，故多价免疫将是更有效的疫苗，目前澳大利亚人正在寻求其他抗原，以便与合使用来加强疫苗的效果。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 蜱免疫的评价标准 （ 1994）认为抗蜱疫苗在田间并不一定在一代内就直接将蜱杀死，而是要在连续的几代内通过降低蜱的繁殖能力而从总体上循序渐进地控制蜱的数量。抗蜱疫苗的主要效果是通过减少每只饱血雌蜱的产卵量从而减少幼蜱总量，只对少量动物 免疫所得到的保护效果相对于对蜱种群的控制计划来说只是杯水车薪。目前，限制抗外寄生虫疫苗进入市场的主要因素可能还是源于人们对寄生虫疫苗通过免疫攻击试验来评价的误区。 议，对寄生虫疫苗的评价应以动物系统中的经济效益及其他可持续农业的指标为准，而不应仅仅以疫苗免疫和攻击研究中的保护率水平为准。仅仅中度有效的疫苗可能在降低寄生虫数量方面很有作用。从长远角度来看，将免疫保护期延长至 5 10 年在寄生虫控制中的作用要远比将保护率提高到 50 70的作用大得多。必须看到，外寄生虫疫苗只能减少外寄生虫数量而不是只 保护单个动物，而且还需连续几代在一定范围内科学管理才能见效。所以， （ 1995）认为一个良好的蜱的防控计划应该做到： 1，对一个畜群中所有动物都要进行抗蜱免疫。 2，接受抗蜱免疫的畜群要封闭管理，因为引入未免疫的个体会使蜱在整个畜群中又死灰复燃。 3，应该明确抗蜱疫苗对蜱的损害是从吸食了被免疫动物血液的蜱的下一代开始的，并在逐代加强。 综上所述，疫苗免疫是畜禽病虫害可持续控制技术中最为有效的方法之一，家畜外寄生虫病的防治也是如此。而设计寄生虫疫苗的关键是：（ 1）确认保护性抗原；（ 2）使该抗原的 生产达到足以使用的量；（ 3）用最有效的方法去管理和实施。然而，多少年来，这三个因素仍象一条不可逾越的鸿沟阻碍着人类利用免疫学方法防治蜱的进程。直到最近十几年来，人类才揭开了抗寄生虫疫苗免疫的神秘面纱之一角。现代生物化学和分子生物学技术的不断涌现，使得人们对保护性抗原的寻找变的更加方便可靠。各种克隆表达系统的广泛应用，使得科学家们能够得到足量的用于分析的保护性抗原，并使该种抗原的商业化批量生产成为可能。新型佐剂的出现和利用生物复制载体（如细菌和病毒）将抗原导入宿主已开辟了预防接种的新途径 (et 1991)。免疫新概念正在完善我们对免疫应答的调节机制的理解，而对抗原的研究已拉开了人类理解各种免疫细胞激活机理的新序幕。目前，尽管抗寄生虫疫苗还相对甚少，而且还存在着种种缺陷，如果将人类当前对寄生虫免疫的研究成果看成是寒夜中的启明星，则利用疫苗来彻底防治寄生虫的曙光离我们并不遥远。 究内容和方法 尽管我国是蜱及蜱传病危害最为严重的国家之一，但在蜱的免疫学方面的研究工作开展甚少。本研究以青海血蜱这一我国特有的蜱种为研究对象，采用不同于传统疫苗研究的技术路线，从蜱的唾液腺筛选出外寄生虫在正常 发育中从未与宿主免疫系统接触的“隐藏抗原”，由这些“隐藏抗原”诱导的宿主免疫保护可防止寄生虫的免疫逃避机制。试验中将通过比较用蜱叮咬和用蜱唾液腺研磨物免疫动物所得抗血清的差异