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项目编号滨州医学院大学生科技创新活动基金项目申 请 书项 目 名 称：氯胺酮对幼龄大鼠海马S-100蛋白表达的影响 申 请 者： 所 在 院 系： 申 请 金 额： 0.25万 申 请 日 期： 2012-9-1 联 系 电 话： 电 子 信 箱： 滨 州 医 学 院 科 研 处6一、基本情况1项目情况项目名称氯胺酮对幼龄大鼠海马S-100蛋白表达的影响项目来源 自主立题 教师指导选题申请金额0.25万元起止时间自 2012 年9 月 至 2013 年 9 月项目类别实验研究依托研究（教研、实验）室机能学实验室2申请者情况姓名性别男年龄23民族汉族院（系）基础学院年级、班级10级临本15班专业临床3项目组成员情况姓 名性别年龄专业分 工每周工作时 间签字4指导教师情况姓 名职 称学历学位专业电 话签 字注：项目类别：实验研究、小发明、软件开发、调查研究等。年级班级：应规范填写，如2008级临本1班等。 申请书文件名格式：学院名称-申请者姓名-指导教师姓名。二、立题依据1研究意义：本课题有什么学术或应用价值。(1) 探索麻醉药物氯胺酮对学习记忆的影响，提供麻醉药物可损伤幼龄动物神经系统功能的理论依据。(2)观察幼龄动物接受氯胺酮麻醉后海马S-100蛋白表达的动态变化，探索S-100蛋白与学习记忆的关系，探讨氯胺酮影响学习与记忆功能的机制。2.国内外研究现状：与本课题有关的国内外研究动态的综合评述。氯胺酮是临床常用静脉麻醉药，尤其在儿科麻醉中具有不可替代的优势。它作为谷氨酸受体亚型N甲基D天门冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)受体非竞争性拮抗药，可影响机体学习记忆能力，使神经产生退行性变并导致认知功能障碍。国内外许多实验证实氯胺酮对学习记忆功能有影响。Fathollahi1等人的研究表明氯胺酮可抑制视皮层突触后电位的增强，抑制了LTP的形成。Taffe2等人的研究表明亚临床剂量的氯胺酮可损坏恒河猴的多种认知功能。氯胺酮也可削弱健康志愿者的空间学习和语言信息能力3,呈剂量依赖性地干扰动物的空间和非空间识别记忆4。刘毓和等研究认为氯胺酮对老年大鼠的认知功能有短暂的影响5 ,王东6等人研究证实氯胺酮麻醉后老年大鼠学习记忆能力明显降低,基底前脑胆碱乙酰基转移酶（ChA T）表达减少，而国外有研究表明氯胺酮可促进老年大鼠海马乙酰胆碱的释放7。乙酰胆碱与学习记忆功能有很重要的关系，麻醉药物通过诱发胆碱能系统的功能改变而导致术后长期认知功能障碍。多次氯胺酮麻醉的大鼠其空间学习记忆能力明显下降,而且,海马神经元超微结构也有着异常改变,其损害程度与使用氯胺酮的剂量水平有关8，但此研究未作长期观察。陈志斌9研究表明单次注射麻醉剂量的氯胺酮可诱发新生第7天的SD大鼠显著增强的海马神经元细胞凋亡，但对长期的学习记忆功能无影响。Sl00蛋白是一类分子量较小的EF手型钙离子结合蛋白，是轴突的生长因子，具有广泛的生物学活性主要由中枢神经系统中星型胶质细胞和少突胶质细胞及周围神经系统的雪旺细胞分泌，是星型胶质细胞激活的标志之一。Rasmussent 等10研究表明腹部手术后患者血清S100蛋白水平增加明显；而Heyer等11的研究表明，血清S100蛋白是判断全麻后术后认知障碍（POCD）是否发生、POCD演变过程及患者最终结局的指标。Sl00蛋白在脑损伤后有很好的时间变化规律，而且与脑损伤程度有紧密相关性。S100蛋白与学习记忆功能也有密切联系。血清S100蛋白水平与反应能力、记忆力、注意力等神经精神行为的损害密切相关。Sheng等12指出, S100的mRNA及其表达产物随年龄增长有上升趋势,长期超阈值表达可造成递质系统紊乱和突触病理改变,导致学习记忆能力下降。Sokolova13等研究显示对海马进行强直刺激形成LTP后，S100蛋白表达水平显著提高，表明S100蛋白参与了学习与记忆过程。无论是体内还是体外均证明了麻醉药物对幼龄动物的神经功能损伤且造成行为和认知障碍，我们的前期试验结果表明氯胺酮可降低幼年鼠脑组织匀浆中S100蛋白的含量。本实验拟观察接受氯胺酮麻醉的幼鼠海马组织中S100蛋白表达的动态变化及细胞凋亡因子tau蛋白的表达变化，寻找氯胺酮影响学习记忆功能的机制。3.研究目的：课题最后要达到的具体目的,要解决哪些具体问题。(1) 观察氯胺酮麻醉对幼鼠海马S100蛋白表达的影响；（2）观察接受氯胺酮麻醉的幼鼠成年后学习记忆功能是否受影响；（3）观察氯胺酮麻醉的幼鼠海马脑片细胞凋亡因子tau蛋白的表达变化。4.主要参考文献： 注意著录格式1 Fathollahi Y, Salami M. The role of N-methyl-D-aspartate receptors in synaptic plasticity of rat visual cortex in vitro: effect of sensory experience. Neurosci Lett. 2001;306(3):149-52.2Taffe MA, Davis SA, Gutierrez T,et al. Ketamine impairs multiple cognitive domains in rhesus monkeys. Drug Alcohol Depend. 2002;68(2):175-87.3 Rowland LM, Astur RS, Jung RE, et al. Selective cognitive impairments associated with NMDA receptor blockade in humans. Neuropsychopharmacology. 2005 ;30(3):633-9.4 Pitsikas N, Boultadakis A, Sakellaridis N. Effects of sub-anesthetic doses of ketamine on rats spatial and non-spatial recognition memory. Neuroscience. 2008 ;154(2):454-60.5 刘毓和,吴新民, 杜敏逸. 咪唑安定、异丙酚和氯胺酮对老年大鼠认知功能的影响.中华麻醉学杂志；2006,6 王东,张旭,杨天德等. Orexin-A 对氯胺酮麻醉老年大鼠学习记忆及基底前脑ChAT 表达的影响. 重庆医学,2009,38(15):1885-1889.7 Wang Y, Kikuchi T, Sakai M, et al. Age-related modifications of effects of ketamine and propofol on rat hippocampal acetylcholine release studied by in vivo brain microdialysis. Acta Anaesthesiol Scand. 2000;44(1):112-7.8 林林,黄陈平,方周溪,等. 多次氯胺酮麻醉对大鼠学习记忆的影响.安徽医药，2006，10（7）：490491.9 陈志斌，杨天德.氯胺酮对SD 幼鼠海马神经元细胞凋亡和NR2B 蛋白的影响.临床麻醉学杂志2008，24（10）：883885.10 Rasmussen LS.Defining postoperative cognitive dysfunctionJ.Eur J Anesthesiol，1998，15(6)：761-764.11 Heyer EJ, Connolly ES.Serum concentration of S-100 protein in assessment of cognitive dysfunction after general anaesthesia in different types of surgeryJ.Acta Anaesthesial Scand，2003，47(7)：911-912.12 Sheng JG, Mrak RE, Bales KR,et，al. Overexpression of the neuritotrophic cytokine S100beta precedes the appearance of neuritic beta-amyloid plaques in APPV717F mice. J Neurochem. 2000 ;74(1):295-301.13 Sokolova OO, Shtark MB, Lisachev PD, et，al。Expression of S100B and S100A6 genes during long-term posttetanic potentiation in the hippocampus. Bull Exp Biol Med. 2009;148(2):227-9.三、研究方案1研究内容与方法： 具体回答研究什么问题，问题的哪些方面。包括有关方法、技术路线、实验手段等说明。把课题所提出的研究内容进一步细化为若干小问题。 (1)海马S100蛋白检测:45只新生第7天SD大鼠随机均分为三组分别腹腔注射氯胺酮25mgkg组（K1组）、50mgkg组（K2组）和生理盐水50mlkg组（K0组）。24h后每组取5只幼鼠处死，用TUNEL法检测海马神经元细胞凋亡，免疫组化法检测海马S100蛋白含量的变化及细胞凋亡因子tau蛋白的表达。剩余30只动物喂养至42d，用Morris水迷宫评价大鼠成年后的空间学习记忆能力。(2)水迷宫测试：1）隐匿台定位航行实验: 接受注射的大鼠至35天龄开始水迷宫训练5日,每天训练4次,每次训练随机选择一个入水点将大鼠面向池壁放入水池,同一次训练所有大鼠入水点相同。固定平台于第象限中点并隐匿水下,记录大鼠找到隐匿平台的时间,即为逃避潜伏期。至120秒找不到平台,将其引上平台,逃避潜伏期记为120秒。大鼠每次爬上或被引上平台后,休息30秒开始下一次训练。计算各组各鼠每日的平均逃避潜伏期,作为其该日的学习成绩。2）空间搜索实验: 于定位航行实验结束当天下午进行空间搜索实验,撤除平台,记录120秒内穿过原平台位置的次数及其运动轨迹。2研究目标和创新：本课题研究要达到的预定目标。创新点是突出研究的新颖之处。目标：氯胺酮麻醉会引起幼鼠脑细胞凋亡，tau蛋白表达增加，而S100蛋白脑内含量下降，导致大鼠学习记忆功能下降。创新点：幼鼠接受氯胺酮麻醉后因S100蛋白脑内含量降低而影响了神经元的发育，轴突的生长，从而影响了突触可塑性的形成，进而影响其成年后的学习记忆功能。 3预期成果和形式：本课题研究拟取得什么研究成果，以什么形式。形式有很多，其中调查报告、研究报告、论文是课题研究成果最主要的表现形式。 发表核心期刊论文12篇4研究进度及安排： 课题研究在时间和顺序上的安排。一般分阶段描述，每一个阶段有明显的时间设定，从什么时间开始，至什么时间结束，要有详尽的研究内容安排、具体的目标落实。2012.11012012.11.30 查阅文献,撰写开题报告。2012.12.012013.01.31 开展各项实验。幼龄大鼠接受氯胺酮麻醉后不同时间点断头取脑，制作海马脑片，免疫组化法检测海马S100蛋白及tau蛋白的表达变化