课题3　血红蛋白的提取和分离

专题5DNA和蛋白质技术 课题3血红蛋白的提取与分离 蛋白质 基本单位 氨基酸 结构 氨基酸 二肽 三肽 多肽 一条多肽链盘曲折叠形成蛋白质 几条多肽链折叠形成蛋白质 一 蛋白质分离依据 P64 蛋白质的物理化学性质 形状 大小 电荷性质和多少 溶解度 吸附性质 亲和力等 一 基础知识 二 凝胶色谱法 1 概念 P64 也称做分配色谱法 是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 2 材料 凝胶 一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 由多糖类构成如葡聚糖 琼脂糖 具多孔的凝胶就叫分子筛 凝胶 凝胶糖 装配好的凝胶柱 3 原理 P64 位于凝胶外部 进入凝胶内部 较快 较慢 较短 较长 先洗脱出来 后洗脱出来 4 分离过程 P65 混合物上柱 洗脱 大分子流动快小分子流动慢 收集大分子 收集小分子 洗脱 从色谱柱上端不断注入缓冲液 促使蛋白质分子的差速流动 注 装配好的凝胶柱 1 作用 P65 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定 三 缓冲溶液 如 H2CO3 NaHCO3 NaH2PO4 Na2HPO4 2 组成 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成 3 配制 P65 调节缓冲剂的比例 可配制不同pH的缓冲液 4 意义 P65 四 电泳 1 概念 P65 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 2 原理 P65 66 在一定的pH下 生物大分子的可解离基团会带上正电或负电 1 如何产生带电粒子 2 如何移动 3 如何分离 带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小 形状的不同 使带电分子产生不同的迁移速度 从而实现样品中各种分子的分离 注 电泳过程中影响蛋白质分子运动的因素 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 注 影响蛋白质分子运动速度的因素 蛋白质由氨基酸构成 也是两性电解质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外 氨基酸残基侧链中某些基团 如谷氨酸 天冬氨酸残基中的 和 羧基 赖氨酸残基中的 氨基 精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的眯唑基 在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团 3 常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 4 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 作用 测定蛋白质分子量 注 本实验用该法进行蛋白质纯度的鉴定 2 原理 加入SDS 十二烷基硫酸钠 注 SDS的作用 P66 加入带负电荷多的SDS 形成 蛋白质 SDS复合物 消除净电荷对迁移率的影响 使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小 电泳检测结果 电泳检测结果 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 二 实验操作 一 样品处理 1 样品来源 哺乳动物血液 需加入抗凝血剂柠檬酸钠 采集得到血液 注 1 血液 血浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐磷脂葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 最多 2 红细胞 形状 两面凹圆饼状 特点 无细胞核和细胞器 3 血红蛋白 90 结构 P67 两个a 肽链 两个 一肽链 作用 携带O2或CO2 四个亚铁血红素基团 血红蛋白含有四条肽链 每条肽链环绕一个亚铁血红素基团 此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳 血红蛋白因含有血红素而呈红色 2 主要操作 1 红细胞的洗涤 材料 仪器 血液 离心机 洗涤液 生理盐水 0 9 NaCl 血液100mL 低速离心2min 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 洗涤过程 搅拌10min 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 注 P69 洗涤次数过少 无法去除血浆蛋白 速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀 达不到分离的效果 洗涤的目的 去除杂蛋白 得到较为纯净的红细胞 2 血红蛋白的释放 材料 仪器 洗涤好的红细胞 磁力搅拌器 磁力搅拌器 磁力搅拌器 使血红蛋白释放的液体 蒸馏水 甲苯 使红细胞吸水胀破 溶解红细胞的细胞膜 操作 P67 加 蒸馏水 到 原血液 体积 再加40 体积的 甲苯 置于 磁力搅拌器 上充分搅拌10分钟 目的 使红细胞破裂 释放出血红蛋白 3 分离血红蛋白溶液 材料 仪器 血红蛋白混合液 离心机 过滤装置 分液漏斗 分离过程 a离心 P67将搅拌好混合液转移到离心管内 以2000r min的速度离心10min b过滤 除去脂类 红细胞破碎物 c分液漏斗中静置分出下层红色透明液体 P67 第1层 第2层 无色透明 血红蛋白水溶液 红色透明液体 甲苯层 白色薄层固体 脂溶性物质沉淀层 第3层 第4层 暗红色 杂质沉淀层 注 P67离心后分层 甲苯层 无色透明 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层 暗红色 试管中溶液层次 分离过程 红细胞混合液 烧杯 1 途径 透析 二 粗分离 注 P67透析袋 又称玻璃纸 能使小分子自由进出 而将大分子保留在袋内 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol L的 中 pH为 透析12小时 透析袋 磷酸缓冲液 7 0 1 2 过程 P67 利用透析袋透析 透析过程 3 作用 除去样品中分子量较小的杂质 得到较为纯净的血红蛋白 1 途径 凝胶色谱法 三 纯化 2 操作步骤 1 色谱柱的制作 P67 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两端需用砂纸磨平 P68 图5 9 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 插到玻璃管的一端 移液管头部连接一细的尼龙管 并用螺旋夹作为开关 顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 组装 安装其他附属结构 装配好的凝胶柱 返回 2 色谱柱的装填 注 材料 交联葡聚糖凝胶G 75 磷酸缓冲液 装填前 P68 凝胶用蒸馏水充分溶胀后 配成凝胶悬浮液 注 P69 凝胶颗粒 洗脱液 沸水浴 装填时 P68 打开尼龙管 一次性缓慢倒入 轻轻敲打 装填均匀 注 P68 装填凝胶柱时不得有气泡存在 原因 P70因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 装填后 P68 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 注 1 洗脱液面不要低于凝胶表面 2 P70不能发生洗脱液流干 露出凝胶颗粒的现象 3 样品加入与洗脱 加样前 P68 打开下端出口 使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐 关闭出口 吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端 加样品 P68 注 图5 22 滴加样品时 吸管管口贴着管壁环绕移动加样 同时注意不要破坏凝胶面 加样后打开下端出口 使样品渗入凝胶床内 等样品完全进入凝胶层后 关闭下端出口 样品渗入 P68 加洗脱液 P68 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸缓冲液到适当高度 开始洗脱 P69 连接缓冲液洗脱瓶 打开下端出口进行洗脱 样品收集 P69 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每5ml收集一试管 连续收集 注 P70 在分离过程中 如果红色区带均匀一致的移动 说明色谱柱制作成功 样品的加入和洗脱 收集得到的纯化后的血红蛋白 四 纯度鉴定 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 课题3血红蛋白的提取与分离 知识总结 血红蛋白的提取和分离 教学反馈 1 凝胶色谱法是根据 分离蛋白质的有效方法 A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2 缓冲液的作用是 在一定范围内 抵制外界的影响来维持 基本不变 A温度BpHC渗透压D氧气浓度3 电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷 的电极移动 A相同B相反C相对D相向4 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的 与氧气的运输有关 A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白 B B B A 5 血液由血浆和各种血细胞组成 其中 的含量最多 A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6 为防止血液凝固 在采血容器中要预先加入抗凝血剂 A NaClB 甲苯C 蒸馏水D 柠檬酸钠7 将搅拌好的混合液转移到离心管中 离心后 可以明显看到试管中的溶液分为4层 其中第3层是 A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物 C D C 练习巩固 1 随着人类跨入蛋白质组时代 对蛋白质的研究和应用越来越深入 首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质 2 用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中 关于蛋白质的叙述 正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较 3 使用SDS 聚丙烯酰胺电泳过程中 不同蛋白质的电