清洗液（酸液）的配方.doc

实验室操作清洗液（酸液）的配方:弱次强强重铬酸盐（g）10012063浓硫酸（ml）1002001000蒸馏水（ml）1001000200较常用的为次强酸，新配制呈红色，经多次使用或遇有机溶剂呈绿色，表示清洁液已失效，需要配。塑料及橡胶制品的处理：1 先煮沸5min以上2 用自来水清洗12遍以上3 用双蒸水荡洗3遍以上4 烘干5 与玻璃器皿一起灭菌96孔板清洗:1 泡酸24-48hr（尽量没在酸液中）2 捞出，用自来水冲洗12遍（注意冲洗每个孔）3 双蒸水荡洗3遍4 低温烘干（50摄氏度以下，且板要倒扣）5 将板及盖照紫外3h6 放置无菌室备用另法:泡酸缸1h,自来水冲20遍,双蒸水冲10变,与pe手套保鲜膜皮筋一起照紫外一晚上,包装待用.培养基配制:1 成分（DMEM）：培养基干粉（1包/升），碳酸氢钠（据培养基袋口的说明加，经验值2g/l），青霉素（0.06g（10万u）/l），链霉素（0.1g（10万u）/l）2 配成溶液后过滤除菌，用前加入10%血清注意：1 所用双蒸水需要新鲜烧的，因为放置过久的双蒸水PH值变化2 先溶解碳酸氢钠，再溶解双抗，最后加入培养基干粉3 过滤除菌的滤膜为0.22um，在滤膜上方可放置一张滤纸进行粗滤，使用前先灭菌处理4 小牛血清在开封之前需经过灭活，156摄氏度水浴30min，由于血清本来就是无菌的，所以无需过虑除菌（所剩的血清都已经灭活了，后购买的需先灭活再用）消化液配制：1 成分：0.25g胰蛋白酶，0.02gEDTA，100mlPBS；2 先把EDTA溶于100ml的PBS中，再加入胰蛋白酶，定容到100ml；注意：1 先加热溶解EDTA2 再加入胰蛋白酶，混匀3 0.22um滤膜过滤除菌冻存液配制：170%的基础培养基（不含血清），20%的血清，10%的DMSO2可以不加70%的培养液就加血清和10%DMSO，现配现用，加入细胞沉淀中3用枪轻轻混匀后分装于冻存管（2ml），一般最多只能加入1ml的细胞悬液，这样有利于复苏的存活率，然后逐步降温，步骤为：14摄氏度放置30min2-20摄氏度放置1hr3-70摄氏度放置3hr以上（或过夜）4迅速转移至液氮中（放置在事先作好的纱布袋中，并做好标记，包括冻存细胞的名称、冻存时间和数量）注：液氮罐须定期检查（每半个月或1个月检查1次），若液氮高度低于罐高的1/3，须及时补充液氮，并做好记录，以便下次估计充氮时间。MTT溶液配制（四甲基偶氮唑盐）浓度5mg/ml，将称好的MTT加入PBS溶液，震荡混匀溶解后用0.22um孔径的滤膜过滤除菌，4 摄氏度保存，由于MTT见光氧化，故在瓶外包纸避光保存。PBS溶液配制:NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.15g(Na2HPO4.12H2O 2.9g)KH2PO4 0.2g双蒸水定容到1L，调PH7.2-7.4(杨艳丽:NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4.12H2O 3.58gKH2PO4 0.24g双蒸水 先抽滤 再灭菌)洗瓶：1 烘干（如果是干的可以免去烘干这一步）2 泡酸24hr以上3 酸缸中拿出清水冲洗，直至黄色退去4 用刷子清洗器皿一遍，然后清水冲洗5-6遍（理论10遍以上）5 单蒸水冲洗5-6遍6 双蒸水冲洗5-6遍7 烘干8 玻璃器皿有盖的盖上（松弛便于蒸汽进入），用牛皮纸或报纸封住瓶口，放入高压灭菌锅内灭菌，无盖的玻璃器皿，用锡纸包住瓶口，再套牛皮纸，最后放入高压锅（121摄氏度，20min）9 将器皿放入烘箱，烘干（如果来不及可以省略，最后烘一遍）10 放入细胞培养室，归类。清洗盖子：用清水冲洗瓶盖，干净后放入沸水中煮沸10min，晾干（不要放入烘箱中或高压锅内）细胞复苏:(细胞房用之前要去紫外灯照射30min)1 先从液氮罐内迅速拿出需要复苏的细胞，迅速放入37摄氏度的水浴中，并不停的摇晃，注意瓶口不要碰到水面，以防污染细胞；2 将盛入37摄氏度水浴中的细胞连同烧杯一起带入细胞房，待细胞均匀融化后，拿出；3 将细胞悬液倒入离心管，加入3-4滴完全培养基，放入离心机中离心1500转（调两档），3-4min，观察细胞沉淀情况，如果太少，再次离心3-4min；4 将离心管拿出，倒掉上清液，在离心管中加入2滴培养液，并用弯头滴管伸入液面以下不断吹打（注意不要将弯头伸出液面，以防有气泡产生，影响细胞生长）；5 将新的细胞培养瓶中加入两滴管培养液，再将离心管中的细胞转入新的细胞培养瓶（以防加入时产生气泡）并使细胞散步均匀；6 用酒精擦拭瓶身，显微镜观察细胞形态（有透明的圆的细胞漂浮其中），培养瓶上写明日期及培养细胞的名称；7 将培养瓶的盖子稍松，放入CO2培养（便于CO2进入）待第二天观察（细胞一般4小时贴壁）；8 清理超净台，用酒精擦拭培养液的瓶身，并放入冰箱内保存，并将其它物品归类。若有下个同学要用超净台，可打开三盏紫外灯，并快速离开；9 将物品通过传送间带出细胞房。细胞传代:1. 从CO2培养箱中取出细胞，放于显微镜下观察，如果细胞已长满瓶底的80%，则需传代；2. 将旧的培养剂倒去，加入胰酶2ml，轻轻荡洗瓶底，将死细胞及其一些细胞代谢物除去，发现细胞开始回缩但不脱离瓶底，然后倒去胰酶；3. 再向培养瓶内加入2ml胰酶，并放入CO2箱中消化2min，拿出后显微镜观察细胞的形态变化，发现细胞质固缩，细胞间隙增大后，立即停止消化；4. 加入新的培养基2ml，用滴管从一侧到另一侧，反复多次后，于显微镜下观察，发现细胞基本漂浮于液面上（抑制胰酶消化）；5. 将培养瓶内的液体吸入离心管内，1500rpm，3min，弃去上清（去胰酶）；6. 加入新的培养基3ml于离心管，用滴管吹打均匀，使细胞基本散开不聚集；7. 新的培养瓶内各加入2ml新的培养基，据细胞的生长状况吸取细胞（生长快的少吸些，生长慢的多吸些），将离心管内的细胞分装于两个新的培养瓶内；8. 显微镜观察，标记，酒精擦拭，放入箱中前稍拧松盖子，于CO2培养箱中培养。细胞冻存：1. 将旧的培养基倒去；2. 吸取3ml胰酶，加入细胞培养瓶中，轻轻荡洗一下，倒掉；3. 吸取2ml胰酶，加入细胞培养瓶中，放入CO2培养箱，2min，取出，显微镜下观察细胞生长状况；4. 加培养液3ml于培养瓶内，用滴管反复吹打；5. 吸取培养瓶内的细胞于离心管中，1500rpm，3min；6. 倒掉上清液，加冻存液1ml，吹打混匀，吸取入冻存管中；7. 冻存管先放置于4度30min，-20度1h，-70度过夜。（冻存液的配制：90%小牛血清，10%DMSO）Western:TGFb+18%(15%)过硫酸铵固定胶的板槽 涂抹凡士林(防漏胶)于250ml小烧杯中,配18%分离胶 用枪头搅匀固定玻板,倒入分离胶 浓缩胶 分离胶(加水,用针头压平液面，再倒出水)（10：00-10：40等待胶凝固）加入浓缩胶冰箱中取样加入上样buffer(5*SDS)（溴芬兰、ED、甘油）,离心水煮沸样品在沸水中变性4min取出样品 离心将凝固的胶转入电泳槽以微量注射器上样(电泳槽漏)加满电极液 电流偏大(防气泡)(所有孔都加满,使跑出电泳条带平整)1*SDS1*SDS1*SDS5*SDS5*SDS5*SDSMARKER1*SDS1*SDS1*SDS(上不同样品时电极液洗针)（甘油含量高，样品沉积快，故一般加样20ul，多加甘油可加大上样量至30ul，marker -70度 10ul）电压计：80-120V（40min-1h 分离胶；2-3h 浓缩胶）准备大平皿,加入转印buffer取出胶切胶（切充分，有蓝色转膜麻烦）（MC易染色；PBDF膜）（蛋白结合牢固程度：小分子用干法，大分子用湿法）（20kb,0.22膜）剪膜 泡甲醇15s 水2min剪滤纸 泡转印buffer 30min滤纸 滤膜 胶 滤纸夹子夹好放入槽中转印（I=200A t=2.5hr）放入脱脂奶粉封闭TBST洗5min加抗体曝光OgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5HaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#t*x*x0C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x0C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x0C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x0C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQjVnZr%v)z1D5H9LdPhTiUmYq$u(y0C4G9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZs&w-A2E6IaMeQfRjVnZr%v)z1D5H9LdPiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w-B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdPhUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w-B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdPhUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w-B+B3F7KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYr%v)z1D5H9LdPhTlXpYq$u(y0C4G8KcOgTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgTlXp!t$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w-x+B3F7JbNfSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3F7J8KcOgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5IaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5IaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5IaMeQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo!t*x+B3F7JbNfRjVnZr%v&w-A2E6IaMeRjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*y0C4G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeRjVnZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x0C4G8KcOgSkTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVn#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVn#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVn#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVn#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4H9LdPhTlXp!t*x+B3F7JbNfRjVn#s&w-A2E6IaMeQiUmYq$u(y0C4H9LdPhTlXp!q$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D5H9LdQiUmYq$u(y0C4G8KcOgSkWo#s&w+B3F7JbNfRjVnZr%v)z1D2E6IaMeQiUmZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmZr%v)z1D5H9LdPhTlXp!t*x+B3G8KcOgSkWo#s&w-A2E6IaMeQiUmZr%v)z1D5H9Ld