课题3　血红蛋白的提取和分离

专题5DNA和蛋白质技术 二 实验操作 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 一 蛋白质提取和分离步骤 血液有哪些成分 能不能用鸡 鸭的红细胞提取血红蛋白 鸡 鸭的红细胞具有细胞核 和众多的细胞器 结构复杂 哺乳动物成熟的红细胞无细胞核 结构简单 血红蛋白含量丰富 便于提取血红蛋白 1 洗涤红细胞 阅读思考 洗涤的目的是什么 洗涤的方法是什么 洗涤干净的标志是什么 血液100mL 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 其他血细胞 1 样品处理和粗分离 二 操作过程 1 红细胞的洗涤 洗涤目的 去除杂蛋白 以利于后续血红蛋白的分离纯化 洗涤次数不可过少 洗涤操作 速度越高和时间越长 会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀 达不到分离的效果 1 采集血样 2 低速短时间离心3 吸取血浆 4 盐水洗涤 5 低速离心 低速短时间 6 重复4 5步骤三次 直至上清液中已没有黄色 表明洗涤干净 上层透明的黄色血浆 用五倍体积的质量分数为0 9 的氯化钠溶液洗涤 生理盐水 2 释放血红蛋白 阅读思考 释放血红蛋白过程中 在洗涤好的红细胞加入了哪些物质 为了加速释放过程 采取了什么措施 目的分析 蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用是 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 3 分离血红蛋白 分离过程 红细胞混合液 烧杯 有机溶剂血红蛋白 4 透析 过程 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol l的磷酸缓冲液中 pH为7 0 透析12小时 透析目的 除去样品中分子量较小的杂质 2 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两端需用砂纸磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 插到玻璃管的一端 注意事项 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否则难以铺实尼龙网 还会导致液体残留 蛋白质分离不彻底 顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 安装其他附属结构 2 凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择 A 材料 交联葡聚糖凝胶 G 75 B 代表意义 G 表示凝胶的交联程度 膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值 即每克凝胶膨胀时吸水7 5克 凝胶的前处理 配置凝胶悬浮液 计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后 配成凝胶悬浮液 凝胶色谱柱的装填方法 A 固定 将色谱柱装置固定在支架上 B 装填 将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内 装填时轻轻敲动色谱柱 使凝胶填装均匀 注意 1 凝胶装填时尽量紧密 以降低凝胶颗粒之间的空隙 2 装填凝胶柱时不得有气泡存在 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 洗涤平衡 装填完毕后 立即用缓冲液洗脱瓶 在50cm高的操作压下 用300ml的20mmol l的磷酸缓冲液 pH为7 0 充分洗涤平衡12小时 2 凝胶色谱柱的装填 50cm高 注意 1 液面不要低于凝胶表面 否则可能有气泡混入 影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果 2 不能发生洗脱液流干 露出凝胶颗粒的现象 3 样品加入与洗脱 3 样品加入与洗脱 调节缓冲液面 打开下端出口 使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐 关闭出口 滴加透析样品 吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端 滴加样品时 吸管管口贴着管壁环绕移动加样 同时注意不要破坏凝胶面 样品渗入凝胶床 加样后打开下端出口 使样品渗入凝胶床内 等样品完全进入凝胶层后 关闭下端出口 洗脱 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸缓冲液到适当高度 连接缓冲液洗脱瓶 打开下端出口进行洗脱 收集 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每5ml收集一试管 连续收集 在分离过程中 如果红色区带均匀一致的移动 说明色谱柱制作成功 思考下面的问题 让血红蛋白处在稳定的pH范围内 维持结构和功能正常 1 在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么 2 与其他蛋白质相比 血红蛋白有什么特点 这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 这使血红蛋白的分离过程非常直观 大大简化了实验操作 三 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 选做 鉴定血红蛋白纯度 1 目的 1 样品的处理 通过洗涤红细胞 血红蛋白的释放 离心等操作收集到血