PCR技术ppt课件

PCR技术 生物化学实验技术 目录 PCR的反应原理PCR示例 多聚酶链式反应 PCR PolymeraseChainReaction KaryB Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法 此技术获得1993年诺贝尔化学奖 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶 IIIIII 拓扑异构酶解旋酶类SSB 引物dNTPMg2 Mullis的PCR构思 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 耐热DNA聚合酶 Saiki 1988 将耐热DNA聚合酶引入PCR 使利用热变性解链DNA模板可行 PCR反应循环 Taq P1 P2 PCR反应体系 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2 模板 DNA引物 P1P2DNA聚合酶 Taq原料 dNTP反应缓冲液辅助因子 Mg2 1 PCR反应成分 1 模板单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 DNA模板一般100ng 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 PCR反应条件 2 引物浓度0 1 0 5 mol L浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 3 TaqDNA聚合酶0 5 2 5U 50 l酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 4 dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 5 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 适宜浓度为0 5 2 5mmol L反应体系 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 2 循环参数变性使双链DNA解链为单链94 20 30秒 2 退火温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 3 延伸70 75 一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25 35次次数过多 扩增效率降低错误掺入率增加 PCR技术的特点 1 高度的灵敏性 30轮循环 扩增量达230个拷贝 109拷贝 PCR产物每轮循环增加一倍 2 特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性 同时尽可能减少非特异性扩增 引物设计 1 序列应位于高度保守区 与非扩增区无同源序列 2 引物长度以15 40bp为宜 3 碱基尽可能随机分布 G C占40 60 4 引物内部避免形成二级结构 5 两引物间避免有互补序列 6 引物3 端为关键碱基 5 端无严格限制 3 操作简便易行 利用PCR扩增 只需要数小时 就可以扩增出可用电泳法检出的DNA 可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列 PCR示例 一 实验目的 学习PCR分析的原理与技术 1 材料 含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18 T质粒DNA2 仪器 微量移液器及吸头 PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3 试剂 10XPCR反应缓冲液25mmol LMgCl210mmol LdNTP10 mol L引物1和引物2 二 实验材料 仪器和试剂 1 按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀 10XPCR反应缓冲液2 5 L25mmol LMgCl22 0 L10mmol LdNTP1 0 L10 mol L引物11 0 L10 mol L引物21 0 L质粒DNA1 0 LTaq0 1 L 5U 水补充至25 0 L 三 操作步骤 2 按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀 10XPCR反应缓冲液2 5 L25mmol LMgCl22 0 L10mmol LdNTP1 0 L10 mol L引物11 0 L10 mol L引物21 0 L质粒DNA1 0 LTaq0 1 L 5U 水补充至25 0 L 三 操作步骤