鼻咽癌易感抑瘤基因的功能基因组学研究{修}.doc

鼻咽癌易感抑瘤基因的功能基因组学研究修 鼻咽癌易感抑瘤基因的功能基因组学研究修中南大学学报(医学版)xx,33 (7)J C e n t So u t hU n i v(M e d S c i)553?R EV IE WS?综述?鼻咽癌易感/抑瘤基因的功能基因组学研究李小玲,武明花,李桂源(中南大学肿瘤研究所,长沙410078)摘要鼻咽癌组织在染色体3p,9p,6q,11q,13q和14q等区域存在较高的等位基因不平衡,表明这些区域存在与鼻咽癌相关的抑瘤基因。 采用c D N A代表性差异分析等方法成功获得了候选的鼻咽癌易感/抑瘤基因,并进行了基因功能研究。 发现: (1)C x基因的表达增强是由于肿瘤细胞为突破细胞通讯功能的障碍,试图重建细胞间隙连接的一种表达变异; (2)B R D7基因是一个与细胞周期调控密切相关的核转录调控因子; (3)N A G7基因具有双重生物学功能?在抑制低侵袭能力的H NE1细胞增殖的同时,能够增加H NE1和6?10B细胞的侵袭潜能; (4)N GX6可以与E z r i n发生交互作用,参与鼻咽癌转移; (5)S P L U N C1基因的表达下调是鼻咽癌早期预警的分子诊断标志物。 这些易感/抑瘤基因的功能基因组学研究为阐明鼻咽癌的发病机制打下了坚实的理论基础。 关键词鼻咽癌;基因克隆;功能基因组学Q74A1672?7347 (xx)07?0553?06F u n c t i o n a lg e n o m i c s o fn a s op h a ry n g e a lc a r c i n o m a s u s c e p t i b i l i t y/s u p p r e s s o r g e n eL IX i a o?l i n g,W UM i n g?h ua,L IG u i?y ua n(C a n c e rR e s ea r c hI n s t i t u t e,Ce n t r a l So ut hU n i v e rs i t y,C ha n g sha410078,C h i n a)A b s tr a c t:T h e r e i s o b vi o u s a l l el e d i s eq u i l i b r iu m i n n a s op ha ry ng ea lc a r c i n o m a a t c h r o m o s o m e3p,9p,6q,11q,13q a n d14q.N a s op ha ry ng ea lc a r c i n o m a(N P C)s us c e p t i b i l i t y/s up p r e s s o rg e n e c a n d i d a t e sw e r eoba i n e d b y m o le cu l a rb i o lo g y me t h o d s,s uc ha sc D N Ar e p r e s e n t a t i o n a ld if fe r e n c ea n a?l y s is.T h e f u n c t i o n a l r e s ea r c h o f N P Cs usc e pt i b i l i ty/s up p r e s s o rg e n e c a n d i d a t e s i n d ic a t e d: (1)T he i n c r ea s e de x p r e s s i o no f C xc o n tr ib ut e d t o obs t a c le s o fg ap j u nc t i o n a l i n t e r c el lu la r c o m mu n ic a t i o n(G J I C),a n d r esu lt ed a n ab e r r a t i o no f GJIC; (2)B RD7,a tr a n sc r i pt f a ct o r,w a s a s so c i a t edw i t hc el lc yc ler e g u la t i o n; (3)N A G7,a nes tr o g e n re c e pto r repres so r,i n h ibit edt he i n v a s i vep o t e n t i a lo fh u m a n N P Cc el ls by re gu la ti ng E R e xpres s i o n a n dt he H?r as/p?c?R afa n dJ N K/A P?1/M M P1s i g?n a l i ngp a t h w a ys; (4)N GX6,a me t ast as is?as so cia t ed pro t e i n,c an n e g a ti ve?regu la t e E G F/R as/M A P Ksi g n a li ng tr an sd ucti o n pa t hw a y,an d i nt er a ct wit hezr i npro t e i nto i n hibiti nvasi o n an d me t ast a?siso f NP Cc el ls; (5)S PL UN C1,asecret edpro t e i n,c an inhibitthe bact er iumc lon e fo rma tion,andisan in na t e i m mu ne mo lecule.T hesedat a wi lllayan imp or t ant fo u ndation for the NP Cmechan is m.K e y w ord s:nasop hary ng ea lc arcino ma;g e nec lone;fu nctiona lg eno mic sJ Cent So uthU ni v(M ed Sci),xx,33 (7):0553?06(D ateofreception)xx?06?18作者简介(B io gr ap h y)李小玲(1961?),女,湖南长沙人,博士,教授,主要从事肿瘤发病病因学研究。 通讯作者(C or resp ondingauth or)李桂源,E?ma i l:ligyx ysm.基金项目(F oundationite ms)国家重大科学研究计划(xxC B910502,xxC B910504);国家自然科学基金 (30770825);湖南省自然科学基金(06J Jxx2,06J Jxx0)。 T hiswor kwas sup por tedbyS t ate KeyR esearchP rogr amofC hina(xxC B910502,xxC B910504);N ationalN atu r al Sci ence F oundationofC hina (30770825);and NaturalScienceFoundationof HunanP ro vince,P.R.C hina(06J Jxx2,06J Jxx0).书书书554中南大学学报(医学版),xx,33 (7)鼻咽癌(nasop hary ng ealc arcino ma,NP C)是一种严重威胁我国南方及东南亚地区人民身心健2鼻咽癌易感/抑瘤基因的克隆康的恶性肿瘤,素有“中国瘤”之称。 它是多因素(E B病毒感染、环境因素和遗传易感性等)参与2.1利用表型克隆策略克隆鼻咽癌易感/抑瘤基因候选者的多基因遗传性疾病,遗传易感性可能在鼻咽癌2.1.1L Z16和L Z20基因的克隆采用c D N A的发生发展中起重要作用。 因此,充分利用人类代表性差异分析法(c D N A RDA),R AC E及c DN A基因组计划这一生命科学领域宏伟工程的最新文库并结合生物信息资源进行综合分析,得到了成果,克隆鼻咽癌相关的新基因并研究其生物学新基因L Z16的全长1603b pc DN A序列,该基因功能,对探讨鼻咽癌发病机制、诊断及防治有着定位于16号染色体,编码366个氨基酸;并通过十分重要的意义。 计算机在基因库中模拟分析,得出了L Z20基因的全长2.1k bc DN A序列,该基因编码531个氨1鼻咽癌全基因组扫描及比较基4基酸,定位于6q22.122.33。 因组杂交分析2.1.2B RD7和鼻咽癌相关基因N AG11和N AG12的克隆通过文库筛选,结合N orther n,中南大学肿瘤研究所分子遗传室应用比较P CR和生物信息学等方法综合分析,克隆了转录基因组杂交检测了20例鼻咽癌基因组DN A的丢本为2.2,1.1,和1.4k b的3个鼻咽癌差异表达失和扩增,发现鼻咽癌常见的扩增染色体是1q基因,分别命名为B RD7,nasop hary ng ealc arcino ma(7/20),2q(7/20),3q(7/20),7q(7/20),8q as so ciated gene(N AG11和N AG12)。 B RD7基因定(8/20)及12q(7/20),高水平扩增的染色体是位在16q11.116q12.2,有11个外显子,编码12p(2/20)和X染色体(3/20);常见的缺失染651个氨基酸组成的核蛋白,有多个磷酸化位点色体为3p(10/20),9p(6/20),11q(8/20)及5和溴区结构域(b ro mo d o ma in)的核内转录因子。 16q(7/20)。 结果表明鼻咽癌细胞中存在多条N AG11和N AG12基因定位于9q22,N AG11基因染色体拷贝数的改变,由此推测相应区域内的瘤有4个外显子,编码87个氨基酸组成的跨膜蛋基因的扩增和抑瘤基因的丢失可能参与了鼻咽白,蛋白含有3个A TP结合区、两个蛋白激酶C1癌的发生发展。 6磷酸化位点和两个N?肉豆蔻酸化位点。 同时,我们利用平均分布于常染色体上的2.1.3鼻咽组织特异性基因N AS G和336个微卫星标记,采用半自动荧光标记多重M GC14597的分离与鉴定寻找不同组织或同PCR对48例原发性散发性鼻咽癌进行微卫星等一组织不同发育阶段以及在病变组织或正常组位基因不平衡(A I)分析,发现染色体3p和9p织中特异性表达基因是研究组织发育、分化和病7的A I是NPC常见的遗传学异常。 通过微卫星和变的关键。 张比成等采用抑制性消减杂交技术C GH分析的结果比较,发现3p等位基因不平衡(suppressionsu btractiveh yb r i di zation,S SH)分离鉴定由整个3p和部分3p区域的丢失导致,邓龙文了人鼻咽组织特异性基因N AS G和M GC14597,这2等通过微卫星分析确定了3p染色体缺失的最两个基因在人鼻咽和气管相对特异性表达,在小区位于D3S1297(3p26.326.2)和D3S1560肺、心脏和唾液腺弱表达,而在其他组织未检测(3p25.3);而9p等位基因不平衡则是由整个9到明显表达。 由于N AS G和M GC14597这两个基因均属于PL UN C家族成员,目前已被人类基因组号染色体的丢失,整个或部分9p的丢失,以及整23命名委员会分别更名为S PL UN C1和L PL UN C1。 个或部分9p的扩增所引起。 阳剑波等用112.2利用定位克隆策略克隆鼻咽癌易感/抑瘤个定位于9p2122区域的高度微卫星多态性标基因候选者定位克隆目前主要有两种策略:记分析,发现D9S161D9S1853位点之间是部分一是进行染色体杂合缺失的研究,找出某种肿瘤鼻咽癌患者9p2122区域的一个较小共同缺失共同缺失的片段,再克隆包含在该片段中的抑癌区,该区域内存在与鼻咽癌密切相关的抑瘤基因。 基因;二是对遗传性肿瘤家系进行连锁分析,将癌基因定位于染色体某一位置再进行克隆。 两者的共同之处在于首先捕捉肿瘤相关基因的染555鼻咽癌易感/抑瘤基因的功能基因组学研究李小玲,等色体位置信息,再利用物理克隆的手段获得癌基E S T s拼接、I M AGE c DN A克隆直接测序等方法,得因或抑癌基因。 到包含该E ST的大小为3941b p的c DN A序列。 2.2.1定位在3p的鼻咽癌候选易感/抑瘤基因该基因被命名为N AG22基因,其蛋白产物中含有的克隆酪氨酸激酶和蛋白激酶C的磷酸化位点、c AM P?2.2.1.1从染色体3p25L OH高频区克隆鼻咽和c GMP?依赖性蛋白激酶的磷酸化位点、多个C a?8癌候选抑瘤基因N AG7Chen等从U nigene库seink inase磷酸激酶位点及3个c oiledc oil结中选取20个上皮组织的E ST克隆3p25L OH构域。 高频区中与鼻咽癌相关的新基因。 从人的骨骼2.2.4定位在9p上的鼻咽癌候选抑瘤基因肌c DN A文库中克隆了一个1.6k b的c DN A序在染色体9p21?22区域,采用E ST s拼接、I M?列,将其命名为N AG7基因。 N AG7基因含有1个AGE cDN A克隆直接测序等方法,获得了一个全蛋白激酶C(P KC)磷酸化位点和1个肉豆蔻基长为2.0k b与鼻咽癌相关的新候选抑瘤基因,命(M yr isty l)化位点,编码一个含94个氨基酸的碱名为N AG20基因。 其蛋白羧基端含有2个连续性跨膜蛋白。 通过在鼻咽癌活检组织中检测未的重要U BA功能域(u bi quitinassociated doma in),发现点突变、缺失与重排。 生物信息学预测表属于泛肽相关蛋白家族的一个新成员,经国际人明,N AG7基因的杂合性丢失、5端调控区、3端类基因命名委员会同意,将其正式命名为u bi quit?11非翻译区以及内外显子结合区点突变可能影响inassociatedprotein1(U BA P1)。 此外,我室从N AG7基因在鼻咽癌中的表达。 9p2122区域克隆了另外一个鼻咽癌相关基因2.2.1.2从鼻咽癌易感基因3p21区域克隆鼻N GX6。 根据S M ART软件分析,N GX6基因编码的咽癌候选易感基因L TF本研究室通过18个蛋白产物有一个E GF?lik edomain和两个跨膜区,鼻咽癌高发家系的连锁分析,首次将鼻咽癌遗传结构与E GF家族的成员有一定的相似性,提示易感基因区精细定位于3p21上13.6厘摩(centi?N GX6发挥抑瘤功能可能与E GF R的表达调控有912morgan,c M)的区域。 通过对18个家系的关联关。 分析,发现染色体3p21区域存在多个位点及单倍型与鼻咽癌存在传递不平衡,进一步将鼻咽癌3鼻咽癌易感/抑瘤基因的功能研究遗传易感区域定位从染色体3p21上的13.6c M10缩小至12.4c M区域。 通过自制的包含染色3.1C on ne xin基因间隙连接蛋白(c onnexin,体3p21区域288个基因的cDN A芯片筛选并证C x)在胚胎发育、细胞的生长、分化以及细胞自身实,L TF基因是定位于3p21区域内的鼻咽癌候选稳定的维持等方面起重要作用。 C x是一个多基10易感基因。 因家族,至少有13个成员。 C x26,30,31,31.1,2.2.2定位于6q上的鼻咽癌候选抑瘤基因32,37,40,43,45在正常鼻咽组织中表达;在染色体6q区域,从U nigene库中选取C x36,46,46.6,50在正常鼻咽组织低表达或不D6S1581附近11个上皮组织的E ST,克隆表达。 本研究组首次明确了C x基因在鼻咽癌细了一个与鼻咽癌相关的新候选瘤基因?胞株(H NE1)基因组中的表达谱,发现C x37和N AG23。 N AG23基因编码一个390个氨基酸的酸C x46在鼻咽癌细胞株中特异表达,促分化剂(维性胞浆蛋白。 该蛋白含一保守的F?b ox功能区,甲酸)能抑制H NE1的生长及C x37和C x46在13?14为F?b ox蛋白家族的新成员,人类基因组命名委H NE1中的表达。 C x基因被认为是一种抑瘤员会将其更名为F BO X30。 在鼻咽癌活检组织未基因候选者,但本研究组通过对C x基因在鼻咽检测到N AG23基因的点突变、缺失与重排。 癌细胞株、胃癌中表达谱的研究,发现这些肿瘤中有些C x基因的表达减弱,而另一些C x基因表2.2.3定位在7q上的鼻咽癌候选抑瘤基因7q32?ter的微卫星位点D7S631D7S684附达增强,因此提出一种新的假说:在癌变环境中,近存在约30%46%的高频率等位基因L OH,最某些C x基因的表达增强是由于肿瘤细胞为突破小共同缺失区在D7S509附近,距其邻近的微卫细胞通讯功能的障碍,试图重建细胞间隙连接的星位点D7S500和D7S495分别为2.9c M和一种表达变异,但重建的间隙连接通道难以发挥1.2c M,提示该区域定位有与鼻咽癌密切相关的正常功能,甚至干扰细胞正常的间隙连接通讯。 抑瘤基因。 查询人类U ni GeneEST数据库,采用C x基因在某些恶性肿瘤中的表达错位现象的假556中南大学学报(医学版),xx,33 (7)说,为阐明C x基因在恶性肿瘤基因组中的表达大于H NE1细胞,N AG7基因能明显促进H NE1细规律和分子机制提供了创造性的概念和思路。 胞向肾内的侵袭。 说明N AG7基因并不具备启动3.2B RD7?一个核转录调控因子的功能研究细胞运动侵袭的作用,而是能促进肿瘤细胞的运B RD7基因是鼻咽癌组织表达下调/缺失的动侵袭潜能。 N AG7基因通过抑制E R表达,激候选抑瘤基因。 B RD7基因转染至鼻咽癌细胞系活H?ras/p?c?R af,J N K/AP?1和A KT/p70s6K等H NE1中,可部分逆转H NE1细胞的恶性表型,明信号传导通路,上调C AV1,M MP1和E zr in表达,21显抑制细胞的生长和软琼脂集落形成,将细胞阻促进鼻咽癌H NE1细胞的运动侵袭潜能。 滞在G/G期,并且可以延迟裸鼠皮下移植瘤的利用人肿瘤相关寡核苷酸芯片筛选N AG7基0115形成。 利用酵母双杂交系统(T wo?hyb ri ds ys?因调控鼻咽癌H NE1细胞的基因差异表达谱和蛋白质谱分析,构建了鼻咽癌差异表达的基因组和tem)筛选与B RD7蛋白相互作用的蛋白,发现蛋白质组数据库,成功实现了鼻咽癌差异基因组B RD7能与B RD3和/或B RD2蛋白形成异源二聚16体或三聚体发挥核内转录调节功能。 并发现和蛋白质组的对接。 N AG7基因的作用机制可能B RD7与B RD2蛋白间的交互作用不依赖于两蛋是通过诱发基因表达谱的改变而引起蛋白质表达谱发生相应的改变,在一致性改变的功能分子白的bromodomain结构域,B RD2的C?末端(22a a的作用下,抑制细胞增殖,从而发挥抑制鼻咽癌428798)某一区域是B RD2和B RD7蛋白间交21互作用的结构基础,可以增强B RD7的促凋亡活细胞生长的作用。 3.4N GX6?与E zrin发生交互作用的转移相性。 通过对B RD7上游分子事件的研究,采用缺关抑瘤基因N GX6基因是一个重要的鼻咽癌失突变、荧光素酶活性和可视化启动子活性检测技术,证实了B RD7的核心启动子活性区域,并发抑瘤基因侯选者,与鼻咽癌的淋巴结转移呈负相17现其受到c?M yc基因的直接负性调控。 B RD7关,在鼻咽癌细胞中的高表达,可导致鼻咽癌细胞H NE1蛋白质表达谱发生改变,负性调控E GF R能够抑制b eta?c atenin的核聚集,下调T CF4启动介导的M AP K信号通路,下调细胞周期素D1的子活性,从而参与调节W nt通路。 B RD7能够下调c?j un,J NK,p?c?jun,p?E RK表达,负性调控MAP K表达,使细胞增殖速度降低,从而发挥抑制鼻咽18通路,结合乙酰化组蛋白,通过ras/M EK/ERK癌细胞生长的作用。 同时,N GX6能与细胞骨架连接蛋白E zrin发生交互作用,并下调E zrin表达,和R b/E2F两条通路抑制鼻咽癌细胞周期进程,是在鼻咽癌发病过程中与细胞周期密切相关的部分抑制E GF诱导的鼻咽癌细胞的运动迁移,减19核转录调节因子。 B RD7核定位信号缺失突变弱细胞侵袭能力,增强细胞间通讯能力。 缺失突体B RD7N LS存在胞浆到胞核的移位障碍、该突变研究表明,它的E GF和C YT O结构域是调节细22胞黏附、运动迁移和生长增殖的关键功能域。 变体对细胞周期进程延缓程度明显减小,提示B RD7的N LS结构域是其重要功能结构域。 以上N GX6在结直肠癌的发生发展中同样发挥着结果提示鼻咽癌相关基因B RD7基因编码核转录非常重要的作用。 它在结直肠癌组织中表达明显下降;并抑制b eta?c atenin/W nt通路中的b eta?蛋白在细胞恶变过程中可能有细胞浆到细胞核的移位障碍。 总之,B RD7基因作为鼻咽癌候选c atenin和MAP K信号通路中关键分子J NK1/2的的抑瘤/易感基因之一,其表达异常参与了鼻咽蛋白质表达和核移位,使b eta?c atenin和p J NK1向20癌的发生和进展。 细胞膜的聚集,抑制b eta?catenin和p JNK1的核移位,来负调控W nt和S PA K/JNK通路,延缓细胞周3.3N AG7?具有双重生物学功能的鼻咽癌相关基因NAG7基因能明显抑制鼻咽癌H NE1期的进程,抑制肿瘤增殖和裸鼠皮下移植瘤的生细胞体内、外增殖,并且在不同侵袭转移潜能的长,并能抑制肿瘤血管的生成,下调