【毕业学位论文】（Word原稿）Bt蛋白酶联免疫分析技术研究农产品质量与食物安全硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 白酶联免疫分析技术研究 t t I 摘 要 转基因作物由于具有抗虫害、抗除草剂等优良品质，目前在一些国家已大规模商品化生产。随着人们对转基因食品安全性认识的不断深入，各国在积极发展转基因技术的同时，加强了对转基因产品的监控和管理。中国和世界一些国家采用了转基因产品标识制度，因此研发转基因成分的快速检测技术具有重大实际意义。 本研究以转抗虫基因产品中的表达产物 虫晶体蛋白作为研究对象，利用免疫分析技术，建立了定 量检测 列蛋白的直接竞争 测技术，并研制其产品，为转基因产品的快速、大批量检测和基因标识制度提供了技术支撑。 本研究 利用 白作为 免疫 原免疫小鼠制备了多克隆 抗血清，并通过 饱和硫酸铵盐沉淀法 进行 纯化 ，其 效价分别为 52000 和 50000(间接非竞争 法 ), 与不同 白交叉反应率均小于 亲和常数（ K）均大于 109， 符合 建立 析技术的质量要求 。 采用改良的过碘酸纳简易法 对 白 进行 辣根过氧化物酶（ 记 ，经紫外分光 光度法 鉴定， 结果表明： 两种抗原（ 标记率分别为 分子比分别为 在进一步进行包被条件、抗体（抗血清）和酶标抗原工作浓度优化的基础上，建立了 白的直接竞争 测技术，并进一步研制了直接竞争 剂盒，结果如下： （ 1） 白直接竞争 测技术及产品：测定 范围为 50ng/600ng/灵敏度 为 50ng/加回收率在 间，平均回收率为 与间 接 法测得的结果无显著差异；试剂盒的板内变异系数在 间，平均变异系数为 ， 板间变异系数在 间，平均变异系数为 ； 试剂盒在 4 下可保存 6 个月以上。 （ 2） 白直接竞争 测技术及产品：测定 范围为 40ng/750ng/敏度 为 40ng/加回收率在 间，平均回收率为 与间接 检测结果也无显著差异；试剂盒的板内变异系数在 间，平均 变异系数为 ， 板间变异系数在 间，平均变异系数为 ； 试剂盒在 4 下可保存 6 个月以上。 关键词： 白，转基因产品，直接竞争法， 剂盒 in in in of of in to of So it is to a of of is to a a t in a of Ab 2000 0000 of by t to Bt RP by of of of a as (1) a 0ng/ml 0ng/of . V. of (2) 0ng/ml 0ng/of . V. is Bt 录 摘 要 . I . 录 . I 第一章 绪论 . .t 植物的发展现状 . 1 t 蛋白免疫分析研究现状 . 2 测法 . 2 同凝集反应 . 3 疫试纸条法 . 3 疫印迹分析法 . 4 t 蛋白检测觉技术发展趋势 . 4 疫 术（ . 4 子印迹技术 . 5 动注射免疫分析（ . 5 疫传感器 . 5 白质芯片技术 . 6 研究的立 题依据及意义 . 6 第二章 白多克隆抗体制备 . 7 料与方法 . 7 料 . 7 物免疫和抗血清制备 . 9 血清的采集和保存 . 10 血清质量评价 . 10 血清的纯化 . 12 果与分析 . 12 t 蛋白浓度测定 . 12 血清效价测定 . 13 和力测定 . 13 异性测定 . 14 论 . 15 第三章 白 直接竞争 剂盒的研制 . 16 料与方法 . 18 料 . 18 直接竞争 法的研究 . 20 白 直接竞争 剂盒的研制 . 22 剂盒测样过程 . 23 剂盒性质测定 . 23 剂盒使用的注意事项 . 24 果与分析 . 24 标板的处理 . 24 原的酶标记 . 25 被 抗体、酶标抗原工作浓度的筛选 . 25 剂盒特性测定 . 26 论 . 28 响 测方法的因素 . 28 作要点 . 29 原的酶标记 . 30 体最佳工作浓度的确定 . 31 剂盒的使用及存在问题 . 31 第四章 白 直接竞争 剂盒的研制 . 32 料与方法 . 32 料 . 32 b 蛋白直接竞争 剂盒内容及制备 . 33 剂盒测样过程 . 34 剂盒性质测定 . 34 果与分析 . 35 原的酶标记 . 35 被 抗体、酶标抗原工作浓度的筛选 . 35 剂盒标准曲线及灵敏度 . 36 剂盒准确性实验 . 36 剂盒精密度实验 . 37 剂盒精有效期测定 . 38 论 . 38 第五章 主要结论 . 39 参考文献 . 40 致 谢 . 45 作者简历 . 46 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 t 作物的发展现状 自 1981年克隆出第 1个 1代转 987年诞生的，比利时 1987）等、美国 1987）等和 1985）等分别将 3端缺失的 b)、 a)、 c)基因转入烟草，得到了转基因植株，美国 1987）用 3端缺失的 b)基因导入蕃茄，但这些转基因植株的抗虫性都较弱，难以检测出 占可溶性蛋白的 1990年 修饰和改造，获得 此，人们在 达载体的构建、植物组织转化、抗虫植物的培育等方面进行了大量的研究。迄今，国内外已有许多实验室和科研单位用不同的 要是 得了 50多种不同的抗虫转基因作物，有的已进人大田试验和商品化生产阶段。从 1995年起， 花和马铃薯已商品化，到 1997年，全世界已发放 1个，棉花和马铃薯品种各 5个，主要种植于 8个国家和地区，转基因抗虫作物商品化速度很快，至今已在美国、阿根廷、加拿大、中国、巴西、南非、墨西哥、澳大利亚等 20多个国家开始大面积种植。到 2005年为止全球转 8（ 1620万公顷），获得了巨大的经济效益，估计到 2006年全球转基因作物种子的销售额将达 55亿美元以上。 中国从 1991年开始，在国家 “863”高技术计划的资助下也进行了相应的研究，首先将 3端缺失的 花、烟草、甘蓝、 等获得抗虫转基因植株，随后也开展了造和全台成，并将其导人烟草、甘蓝、棉花等 25种以上作物。 1996年，郭三堆等将人工合成的调控序列和 c)基因成功导人中棉 棉 3号及晋棉 7号等我国主要棉花栽培品种，使我国成为世界上继美国之后独立开发成功转基因抗虫棉并获得知识产权的第二个国家。并将 成双价抗虫棉，已育成 6个品种，数十个优良品系，1997年获准商品化生产，到 2005全国种植面积达 330万公顷，经济、社会和生态效益显著。另外，我国的转基因抗 虫玉米、水稻、烟草、马铃薯等农作物都有望在近期实现产业化。 近年来，转基因作物的商品化是否会导致严重的环境问题已经引起广泛的争议。争论涉及的主要问题是转基因作物的广泛种植与传播是否会加速杂草及抗药性害虫的进化。许多资料表明，经遗传改良作物的商品化会导致编码有益性状的转基因转移到这些作物的野生种和近缘种中。（ 1997）认为 蛋白活性的散失将可能成为作物最严重的生态危机。由于 基因作物正逐步进入大批量商业应用，一些潜在的可能生态危机将有一个缓慢的释放过程，因而难以评价。至少，从目前已得到 商品化的转 物来看，还没有关于 物对生态环境产生危险性的报道。 另外， 物食品安全性也是值得探讨的问题。尽管对 物的普遍认识是仅对二化螟等鳞翅目昆虫具有转一性的毒杀作用，人和动物中因无特异性 蛋白结合位点，因而对人和动物而言安全有保障，这点已积累了大批的资料。但其中不容争议的事实是 白会在一些作物的食用部分表达，如水稻和玉米的籽粒，因此人们的担心忧虑并不是多余的。尽管 蛋白无中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 任何毒性，但至少也为发现对人和动物有何营养价值的报道，长期食用这些 “无效 ”的物质或在体内长期积累是否会引起 负效应是人们关心的焦点。有关 物的生态效应，现已成为研究的热点。为安全起见， 许多国家要求对转基因产品实行标签制度，因此对产品进行转基因成分检测、确定是否含有、含量多少以及什么种类的转基因产品是摆在各国政府面前一项亟待解决的主要任务。 t 蛋白免疫分析研究现状 白是转基因作物中的抗虫基因的表达产物。目前检测 白的方法主要是免疫法（ 疫印迹，试纸条等），免疫测定法基于抗原 定时间短，操作程序标准，检测极限低，可对大量样品进行测定。同时它对仪器设备要求相对低， 测定结果可以长期保存，并且可以对转基因表达产物进行定量分析。 测法 酶联免疫吸附方法（ 目前应用的最广泛的免疫检测方法，其基本原理是基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体可以保留其免疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保持其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标记抗体或抗原按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法士形成的抗 原抗体复合物与其他物质分开，这样结合在固相载体上的酶量与标本中的受检物质的量就会成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量就与标本中受检物质的量直接相关，于是就可根据呈色的深浅进行定量或定性分析。由于酶的催化效率很高，可极大地放大反应结果，从而可以使测定达到很高的灵敏度。 法首先需要制备纯度较高的抗原和特异性高的抗体。 白多从苏云金杆菌中提取晶体蛋白，并加以纯化，王保民（ 1998）等报道纯化的毒蛋白是 130多肽链，而陈松（ 1999）等报道 130多肽链为前 毒素蛋白，在此基础上加入胰蛋白酶，就得到 67多肽组成的毒蛋白。利用 体蛋白注射兔或白鼠，制备多克隆抗体或单克隆抗体。王保民（ 2000）等制备了蛋白 得到 4 个单克隆株系 成功地建立了双抗夹心 测了中棉所 30、 期叶片中毒蛋白的含量，分别为 g（ g（ 1996）等、 1998）等及国内的陈松（ 1999）等报道应用多克隆抗体成 功地检测了转 因棉在棉株生长的各个时期的表达量。在抗体的标记上，王保民（ 1998）等用的是生物素标记 ， 陈松（ 1999）等用辣根过氧化物酶标记 。 沈法富（ 1999）等建立了 法检测 蛋白，能通过颜色的深浅来进行抗性等级的评价，且检测 光明（ 2003）等建立的检测玉米 白的间接 量检测方法，对 白质的质量浓度最低可检值为 严吉明（ 2003）建立的间接 8ng/松 等建立的夹心 胞晶体蛋白提纯品的最低检测值为 20ng/后的进一步研究将对 胞晶体蛋白提纯品的最低检测值提升为1，线性范围 115,板内误差 ，即可判定 剂盒已失效， 37 下的 24h 相当于常温下的 45d。 剂盒使用的注意事项 （ 1）试剂盒储存于 28 ，不要冷冻，使用前将所有试剂回升至室温，使用后立即将所有试剂放回 28 。 （ 2）在 中再现性，很大程度取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是 （ 3）在所有恒温育过程中用盖子盖住微孔板，避免光线照射。 （ 4）反应终止液为 2硫酸，避免接触人体。 （ 5）用酶标仪测读数时，孔内必须无气泡，以免影响读数的准确。 （ 6）标准物质和无色的发光剂避免直接暴露在光线下。 （ 7） 加入终止液后 30 果与分析 标板的处理 分别采用紫外线（ 30w 紫外灯，距酶标板 75射 2h）和预处理液（ 500水乙醇加入到 50080g/L 的 溶液中，混合搅拌过夜，次日再加入 600蒸水混匀即为预处理 表 3 不同处理的测定结果 by 理 酶标抗原稀释度 1:50 1:100 1:200 1:300 1:400 1:500 紫外线 处理液 照 国农业科学院硕士学位论文 第三章 接竞争 剂盒的研制 25 液，浸泡 24h）处理酶标板，以未经过处理的酶标板为对照，按照直接 序进行测定，测定结果见表 3。从表 3 可以看出，用紫外线照射过的酶标板测定的 要明显高于预处理液浸泡过的及未经处理的酶标板的 ，说明用紫外线照射过的酶标板，其对抗体的吸附力高于预处理液浸泡及未处理的酶标板。因此以后的测 定均采用用紫外线处理过的酶标板（ 30w 紫外灯，距酶标板 75射 2h）。 原的酶标记 用辣根过氧化物酶（ 为标记酶，采用改良的过碘酸纳简易法，制备酶标 标抗原分别稀释 10 倍后，测得：酶标 原的 根据公式计算： 酶标记抗原中 释倍数 标记抗原中抗原量（ 释倍数 标记率 分子比（ 度抗原浓度）（抗原分子量 子量） = 包被抗体、酶标抗原工作浓度的筛选 白抗体和酶标 原分别系列稀释后，做方阵滴定试验。选择 接近 时 白抗体和酶标 原的浓度作为工作浓度，结果如表 4。 表 4 抗体和酶标抗原最佳浓度选择 he of 标抗原稀释度 抗体稀 释度 1:10000 1:20000 1:25000 1:30000 1:35000 1:40000 1:45000 1:25 :50 :100 :200 :300 :400 表 4 可以看出， 白抗体稀释倍数为 30000，酶标 原的稀释倍数为200 时测得的 最接近 此选择 白抗体稀释倍数为 30000 与酶标 00 时的溶液浓度作为包被抗体和酶标抗原的最佳工作浓度 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 接竞争 剂盒的研制 26 剂盒特性测定 剂盒标准曲线及灵敏度 灵敏度系指应用该法能检出待测样品的最低量，即最小检出量。最小检出量越小，灵敏度越高。将 白标准溶液稀释成系列浓度，用直接竞争 法分析得到以下曲线（图8）。 01020304050607080901000 1 2 3 4B t C r c 蛋白浓度对数 ( L g C )抑制率%图 8 白直接竞争 线 by 曲线转换后可以看出（图 9）：在 50ng/600ng/围内，抑制率与 白浓度的对数值成良好的线 性关系，直线回归方程为 y x) 归系数 敏度为 50ng/ 01020304050607080901000 1 2 3 4 c 蛋白浓度对数 (L g C)抑制率%图 9 白直接竞争 准曲线 by 国农业科学院硕士学位论文 第三章 接竞争 剂盒的研制 27 加回收率试验 用两种方法分析测定样品（玉米）中的添加回收率，结果见表 5。由表 5 可以看出， 剂盒的添加回收率在 间， 表 5 剂盒样品的添加回收率试验 5 of it 添加水 平 ng/复 N 试剂盒