【毕业学位论文】（Word原稿）我国水稻主栽品种SSR多样性比较及水稻纹枯病抗性遗传分析作物种质资源学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 我国水稻主栽品种 样性比较及水稻纹枯病抗性遗传分析 SR a SR a I 摘 要 本研究应用 子标记 来分析我国水稻主栽品种的遗传多样性，并对水稻纹枯病抗性基因进行了初步定位。主要研究结果如下： 0 个 记，比较分析了 151 份上世纪 50 年代和近 10 年我国常规稻主栽品种的遗传差异，发现有 39 个标记具有多态性，多态位点共检测到 213 个等位基因，每个位点 2 11 个，平均 ；平均 因多样性指数（ 围在 。籼粳亚种间 样性差异明显，籼稻平均等位基因数（ 高于粳稻品种（ 比较 78份 50 年代与 73 份近 10 年水稻主栽品种的遗传多样性，籼、粳亚种表现出相近的变化趋势，即 样性指数和等位基因数 50 年代主栽品种高于近 10 年的。虽然 因多样性指数的变化并不显著 （籼稻： z = P = 稻： z = P = ，但等位基因数目的变化达到显著值 （籼稻： z = P = 稻： z = P = 。 遗传变异绝大部分 存在于两时期内，尽管时期间平均贡献的遗传变异仅占 但仍然达到 5的显著水平；籼、粳亚种两时期间平均贡献的遗传变异高于整个分析样本，分别为 籼、粳亚种不同位点的遗传分化程度也各不相同，籼稻和粳稻品种分别有 13 个和 11 个 点的等位基因在两时期间差异显著，而其余位点的遗传变异则是因时期内品种间的差而引起的。 74 份源于组合 叶秋的加倍单倍体（ 体，连续两年进行 4 重复的随机区组田间实验，运用改进的纹枯病人工接种鉴定方法，调查其纹枯病病级，结合该群体构 建的分子标记连锁图谱，运用区间作图法对抗纹枯病 行了定位。两年在第 1 染色体的相邻区间 2005 年）和 2006 年）上各检测到了一个抗纹枯病 献率分别为 2005 年）和 2006 年），第 1 染色体上检测到的抗纹枯病 源于白叶秋。两年在第 5 染色体上均检测到一个 于相同的区间 不同位置，贡献率分别是 2005 年）和 2006 年），而第 5 染色体上检测到的抗性 自另一亲本 根据上述研究结果， 表明近 10 年我国常规稻主栽品种丢失了一部分等位基因，水稻育种仍应加强更广泛的种质亲本的选择；定位的纹枯病抗性 抗纹枯病分子标记辅助育种具有积极的现实意义，通过多亲本杂交，回交等杂交手段可将抗纹枯病数量性状位点快速聚合于同一材料，能够大大加速育种进程，缩短育种年限。此外，该结果对于水稻抗纹枯病的材料筛选有指导作用。 关键词：水稻，主栽品种， 传多样性，纹枯病抗性， e SR in as 1. SR to 51 950s in 0 Of 0 39 to be 9 a 13 of .5 a 1. an . SR a e. By of a e, it 950s e of 0 in a a z = P = z = P = e (z = P = z = P = P 950s 0 of by 3 1 a of in as 950s. be in 2. It a 74 DH an H in a in 005 006. by an of a in of A H. TL of by of TL TL in on , TL on by on 005 006 by TL on on in 005 006 on on of or ), 录 第一章 文献综述 . 1 物遗传多样性研究进展 . 1 物遗传多样性的研究意义 . 1 物遗传多样性的研究方法 . 1 物遗传多样性的统计方法 . 5 稻遗传多样性研究的立题依据 . 8 稻抗纹枯病的研究进展 . 9 原学 . 9 性鉴定方法 . 10 源的筛选及抗性种质创新 . 11 性机制 . 12 性遗传机制 . 13 稻纹枯病抗性 . 15 病育种 . 16 在的问题与展望 . 17 稻纹枯病抗性遗传研究的立题依据 . 18 第二章 我国水稻主栽品种 样性的比较分析 . 19 料和方法 . 19 料 . 19 取和 析 . 19 据分析 . 20 果与分析 . 20 样性 . 20 同时期的遗传多样性 . 22 期间的遗传分化 . 22 论 . 23 第三章 水稻纹枯病抗性遗传分析 . 25 料与方法 . 25 体构建 . 25 取 . 25 卫星标记检测 . 26 据处理 . 28 枯病抗性处理及表型鉴定 . 28 果与分析 . 29 型变异分 布 . 29 V 子遗传图谱的构建 . 30 纹枯病 位 . 30 论 . 32 第四章 结论 . 33 国水稻主栽品种遗传多样性的分析 . 33 国水稻纹枯病抗性遗传分析 . 33 参考文献 . 34 致谢 . 42 作者简历 . 43 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 子标记辅助选择 合酶链式反应 机扩增多态性 制性片段长度多态性 单序列重复 单序列长度多态性 列特性扩增区域 列标签位点 增片段多态性分析 变数目串联重复位点 切扩增序列多态性 量性状位点 倍 单倍体 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 物遗传多样性研究进展 物遗传多样性的研究意义 遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，任何一个物种都具有独特的基因库和遗传结构，同时在不同的个体间往往也存在着丰富的遗传变异，由此构成了生物的遗传多样性。广义的遗传多样性是指所有生物携带的遗传信息的总和。狭义的遗传多样性是指种内基因的变化，包括种内显著不同的种群间或同一种群内的遗传变异（ 1992）。遗传多样性所指的主要还是种内的遗传变异，它是一个物种对人为干扰进行成功反应的决定因素。另外，种内的遗传变异程度同时也决定了其进化的潜势（ 1991）。 植物遗传多样性不仅包括在任何指定地区所栽培的植物种及其所有品种的全部基因遗产，而且还包括它们的野生种和半驯化种。这种遗产越多，即其生物多样性越丰富，那么改良栽培品种或选育新栽培品种的潜力就越大。遗传多样性的表达是通过大量基因的组合或重组实现的，这些基因存在于某一生物种的个体之中，但在同一生物种的不同个体中却表现出不同的特 性，如生长方式、对寄生物或病原菌的抗性，对逆境的耐受性，以及生产力等。就农作物而言，育种家可以利用其遗传多样性分离出具有所期望的特性的栽培品种。 物遗传多样性的研究方法 遗传学研究常用的标记有 形态标记、细胞学标记、生化标记 和 子 标记 （李俊清， 1998） 。无论采用哪种标记进行研究都是为了揭示物种的变异性，而且， 每一种新型遗传标记的发现都大大地推动了遗传学的发展（方宣钧， 2002）。 态标记 形态学即表型性状，是检测遗传变异最直 接 、最简便的方法。 狭义的形态标记是指肉眼可见的外部特征特性，如植物的株高、 叶形、果实颜色等。从广义上讲形态标记也包括与色素、生殖生理特性、 抗病抗虫性等 有关的标记。形态标记具有简便易行、直观快速等优点，长期以来，植物多样性保护研究以形态标记作为主要的或初步的指标。但是形态标记提供的遗传信息有限，一些高度遗传的特性通常在研究材料中表现出很小的变异，遗传表达有时不太稳定。另外，许多形态标记易受环境、生育期等因素的影响，使其应用受到限制。这些局限性导致了生物化学技术如同工酶和蛋白质电泳（ ， 1957）和直接分析 平多态性的分子技术的发展。然而，形态标记仍是不可能被任何分 子技术所取代的，分子或生化的研究结果应与形态特征特性鉴定相中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 互补充（ ， 1997）。 胞学标记 细胞学标记常见的 有 染色体的结构特征和数量特征，它们分别反映了染色体结构和数量上的遗传多 样 性。染色体 结构特征包括染色体的核型和带型。核型特征是指染色体的长度、着丝点的位置 和随体有无等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异；带型特征是指染色体经特殊染色后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等。 染色体数量特征是指细胞中染色体数目的多少，染色体数量上的遗传多样性包括整倍体和非整倍体变异，前者如多倍体，后 者诸如缺体、单体、三体、端着丝点染色体等。 细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但 是细胞学标记的数目十分有限 。另外，一些细胞学标记常常伴有一些有害的表型效应，从而限制了细胞学标记的应用。 化标记 研究蛋白质多态性的最重要手段是同工酶电泳技术。同工酶是指具有同一底物专一性的不同分子形式的 酶 ，具有组织、发育及物种特异性。该技术的基本原理是根据电荷性质差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和专门的染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同基因型。由于其方便经济，易于操作，受到广泛应用，特别在 物种起源和进化研究、 种质鉴定 以及动植物群体遗传结构研究中同工酶电泳分析已经成为常规操作（ ， 1983； ， 2000； 2002） 。 以同工酶为标记有以下优点：与形态标记相比，同功酶标记受环境影响小，表现相对稳定；实验所需材料较少，可以反复进行实验；同工酶位点是共显性的，父母的基因型可以同时在后代中检验出来。 但 其也 存在诸多不足，如 对电泳分析的样品要求较高； 每一种同工酶标记都需要特殊的显色方法和技术； 实验结果随动植物不同发育时期、器官及环境会有所变化 等。最关键的不足是 可以利用的遗传位点数量比较少 ，尤其是在种内品种间，同工酶的差异更少 ， 因此远不能满足数量性状定位和标记辅助选择育种等实际工作的需要。 子标记 子 标记本质上是指能反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的 段，也即基因型在 平上的表现形式。 子标记 具有以下优点：直接以 形式出现，没有上位性效应，不受环境及基因表达与否的限制； 能对 不同发育时期的个体、任何组织器官，甚至细胞作检测；多态性几乎遍及整个基因组； 多态性高， 自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；表现为中性标记，即不影响目标性状的表 达，与不良性状无必然的连锁；许多分子标记为共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息（贾继增， 1996；刘勋甲等， 1998；夏铭， 1999）；部分分子标记可分析微量 古化石样品。 近年来， 随着基因组研究的不断深入，分子标记的研究和应用也得到迅猛的发展。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 子标记 根据检测手段， 大致可分为三类：第一类是以分子杂交技术为基础的标记，如限制性片段长度多态性（ 称 of 变数目串联重复位点） 等。第二类是基于聚合酶链式反应（ 简称 应）基础上发展起来的标记，包括随机扩增多态性 称 简单序列重复标记（ 称 列特性扩增区域）、 序列标签位点（ 称 。第三类是基于限制性酶切和 术的分子标记，包括扩增片段长度多态性标记（ 称 酶切扩增序列多态性（ 称 。 基于分子杂交的 记 最早发展的 子标记（ ， 1974），至今仍被广泛应用。其 基本原理是利用限制性内切酶识别并切割基因组 特 定位点，由于生物个体种群间酶切位点的差异，得到长短、数目不同的限制性片段，这些片段经凝胶电泳分离后，呈现不同的带状分布，通过与克隆的 针进行 交和自显影后，即可产生和获得反映生物个体或群体特异的 谱。 由于基因组 碱基对的突变引起限制性内切酶识别位点的增减，或是识别位点间发生碱基的互换、突变、插入、重排或缺失等变化导致限制性片段数目和长度的变异。由于 碱基对的突变和重排很普遍，所以 数量很大（洪国藩， 1999）。常用的记探针主要来源于随机的 基因组克隆（ 称 隆）和 优点是：生物体 遍存在；大多数为中性突变；标记呈孟德尔遗传，不存在上位性或多效效应，不受环境影响；共显性；结果稳定可靠，重复性好。上述优点 记特别适用于构建连锁图，迄今为止，已在水稻、玉米、番茄、马铃薯、小麦等 20 余种作物上构建了 谱，并在不断的饱和图谱上的标记。同时也成为分析群体内和群体间的遗传变异度、群体间基因流以及谱系和亲缘关系的强有力工具。但 存在明显的缺点： 所需的 较 大 ； 操作繁琐， 又需要昂贵的生化试剂， 成本高；所需 态性探针不易获得；多态检出效率低，只能检测内切酶识别位点上的变异，能提供的信息有限等。 基本原理与 致相同，只是对限制性内切酶和 针有特殊要求，限制性内切酶的酶切位点必须不在生物基因组的重复序列中，以保证小卫星（重复单元核心序列 670和微卫星（重复单元 1 6序列的完整性；分子杂交所用的 针是小卫星序列或微卫星序列。 次可检测到的基因座可达几十个，但与 样，实验操作繁琐，检测时间长，成本高。 基于 记 核心是 段的变性 延伸循环反应： 变性：以微量的 模板，在高温变性条件下，双链解成单链。 复性：在复性温度下，寡核苷酸引物与单链 的互补碱基结合。 延伸：在延伸温度下，经聚合酶的作用，以引物为起始合成互补的 。经过多中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 次循环，当一对引物结合部位间的距离在一定范围内时，能扩增出若干以引物序列为两端的 于不同生物个体基因组 基变异，导致寡核苷酸引物结合部位的序列改变，或者一对引物相邻两个结合部位之间发生插入、缺失或其它重新排列，则同 一对引物扩增产物的长度发生变异，因此， 以作为分子标记的基础。 与 比，它所需要的 较少，可检测 平，不需要同位素，安全性好；较便宜，快速易行，易于自动化。目前应用较多的有 标记。 记 :是第一种广泛应用于生物遗传变异性检测和基因定位的 记， 原理是利用一个随机序列的寡核苷酸作引物（通常为 10 个核苷酸），以基因组 模板，通过 应非定点扩增 断，经凝胶电泳检测 列的多态性。 记在基因组研究方面具有独特的优势（ ， 1990； ， 1990） ： 基因型分析 不需 针，设计引物也不需要知道序列信息；技术简单， 析不涉及 交、放射自显影或其它技术；不 像析， 析只需少量 品；用一个引物就可扩增出许多片段 ， 检测多态性快；成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高 。 记检测灵敏、方便，多态性强，可以检测出 记不能检测的重复序列区，可填补 谱的空缺，适用于遗传多样性检测、种质资源鉴定和分类、目标性状基因的分子标记、遗传图谱的快速构建等。 记 存在的 缺点 是 不稳定， 重 现 性 差 ， 可靠性 不太高 ， 因为在 应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变 ；此外， 记为显性标记，不能有效 鉴别杂合子 ，因此不能提供完整的信息。 原理与 术相似的标记技术还包括 意引物引导的 记。 术是利用非常短的随机引物（ 一般为 5 8 个核苷酸 ）扩增不同个体的 后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色检测 。 用引物比 ，因而扩增产物更多，但其 定性比 低。 记较长，通常为 18 24 个核苷酸，稳定性比 ，但揭示多态性的能力比 。 记 : 亦称微卫星标记或简单序列长度多态性标记（ 由几个核苷酸（ 2 5 个）为重复单位组成的长达几十个 核苷酸的串联重复序列 如（ n，（ n，（ n 等，在染色体上呈随机分布，由于重复次数不同及重复程度的不完全 而造成了每个座位的多态性（ ， 1989） 。不同研究者对微卫星标记重复单元的长度有不同定义，包括 1-5 1-6 2-6 2-8 （ ， 2000），微卫星 术则是根据两侧序列设计一对特异引物进行增，经电泳分离扩增产物，根据产物长短的变化，揭示不同个体在每个 点上的多态性（ ， 1989； ， 1989； ， 1989）。 记的优点：数量丰富，覆盖整个基因组，揭示多态性高 ；具有等位基因的特性，提供的信息量大；呈共显性；每个位点位置由设计的引物决定，便于相互交流，目前已广泛用于种质鉴定、遗传多样性评价、 纹图谱构建以及标记辅助选择、连锁图绘制等（ ， 1994；袁力行等， 2000； 等， 1997；刘 峰 等， 1999）。它的缺点是必须针对每个染色体座位的 定并找到其两端的单拷贝序列设计引物，需要投入大量的人力、物力。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 记在野生稻和栽培稻中都具有极高的多态性检测能力（ ， 1993； ， 1993；， 1994； ， 1997）。目前已定位的水稻微卫星标记已达 2000 余个（ 2002）并公布于公共数据库中 (从而使微卫星标记在水稻分子标记和 基因定位 中得到广泛的应用 。 记 :记 是在 术基础上发展起来的，由于 稳定性较差，为了提高 记的稳定性，先对基因组 析，然后将目标 段进行克隆并对其末端测序，根据 段两端序列设计特定引物（ 一般比 物长 ，通常 18 24 以此引物对基因组 段 进行 异性扩增，从而鉴别原 段相对应的单一位点( ， 1993)。 记由于所用的引物较长且引物序列和模板 全互补，在严谨的条件下扩增，结果稳定性好，可重复性强 ， 且一般呈 共显性遗传。 基于限制性酶切和 术的 子标记 记 :是由 （ 1993） 发 明 ，其基本原理是对基因组 可产生粘性末端的限制性内切酶消化，产生大小不同的酶切片断，与含有共同粘性末端的人工接头连接，作为扩增反应的模板。 引物的结合部位是接头以及与之相连的酶切片段中的几个碱基序 列。因此，引物由三部分组成： 与人工接头互补 的 核心碱基序列 ； 限制性内切酶识别序列 ； 引物 3 端的 2或 3 个选择性碱基 序列 。只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性片段才能被扩增。由于接头和引物是人工合成的，因此，不需要在事先知道 列的前提下，可以扩增酶切片段；应用选择性碱基，则可将一次扩增控制在 50 100 条带。 质上是 结合的技术，集 两 者优点 于一体，既具有 可靠性，也有 敏性。 记所需的 少，检测快速，通用性强，因此被认为是目前一种十分理想、有 效的分子标记（郑敏 等 ， 1999；王志林等， 2001）。据报道水稻 记多态性较高，其基因组分布又较随机（ ， 1996； 1997； ， 1998）；短短几年内，已应用于水稻遗传变异性分析、框架图谱构建和基因定位等各个领域（ ， 1996；， 1997； ， 1997； ， 1998； ， 1998）。不过， 要用同位素检测，费用昂贵，对操作人员素质及 量要求较高。 记 :又称 实质上是 合的一种方法。 其基本步骤是：先进行 增，然后将 增产物用限制性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳将 段分开。 当 增片段不表现多态时，对扩增片段进行酶切 ， 从而增加了检测多态性的机会，记揭示的是特异 段的限制性长度变异的信息（ ， 1993）。 物遗传多样性